ZF683作为免疫抑制靶点在诱导T细胞免疫耐受调控中的应用
znf683作为免疫抑制靶点在诱导t细胞免疫耐受调控中的应用
技术领域
1.本发明涉及基因的功能与应用领域，尤其涉及znf683作为靶标在t细胞免疫耐受调控相关疾病的诊断或预后监测，以及方面的用途。
背景技术：
2.异基因造血干细胞移植(allogenic hematopoietic stem cell transplantation，allo-hsct)是治愈多种血液疾病的手段，例如侵袭性恶性血液肿瘤、骨髓异常增生症等。一方面，allo-hsct后重塑的免疫系统发挥移植物抗白血病(graft-versus-leukemia effects,gvl)、预防机会性细菌、病毒感染等作用，为受者提供强大的免疫保护。另一方面，allo-hsct后由于同种异体反应性t细胞的存在可能引发急、慢性移植物抗宿主病的发生。国内外研究显示：30％-60％患者异基因造血干细胞移植后发生ii-iv级急性移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，gvhd)，14％患有严重(iii-iv级)急性移植物抗宿主病，慢性gvhd发生率高达80％(malard f,huang x j,sim j p y.treatment and unmet needs in steroid-refractory acute graft-versus-host disease[j].leukemia,2020,(5):1229-40。blazar b r,murphy w j,abedi m.advances in graft-versus-host disease biology and therapy[j].nat rev immunol,2012,12(6):443-58。ferrara j l,levine j e,reddy p,et al.graft-versus-host disease[j].lancet,2009,373(9674):1550-61)。
[0003]
gvhd指由异基因供者细胞与受者组织发生反应导致的临床综合征，其生理过程主要是供者t细胞和炎症细胞因子介导导致受者体内多器官组织损伤。而防治gvhd的关键是诱导allo-hsct后t细胞的耐受。因此，探索异基因造血干细胞移植后诱导t细胞免疫耐受的关键调控分子，从而及时诊断和监测gvhd并进行适当的，乃至在gvhd发病前即可评估其患者风险来实现“预警预测”，是改善gvhd诊疗策略的关键科学问题。
[0004]
在单倍型相合造血干细胞移植(haploidentical stem cell transplantation，haplo-hsct)中，由于hla不完全相合导致供体和宿主细胞的同种异体反应更为强烈，受者更可能发生gvhd、严重影响患者预后和生存质量。因此迫切需要探索单倍型相合造血干细胞移植后诱导免疫耐受从而减轻gvhd的关键调控分子。
[0005]
znf683，又称锌指蛋白683，是一种转录因子，它介导了组织中多种t淋巴细胞的转录程序，包括组织中的记忆t细胞，nk细胞和nkt细胞。在胸腺和周围t细胞、nkt细胞的分化中也起着重要作用。本发明的研究团队前期研究结果中发现；在单倍型相合造血干细胞移植后形成免疫耐受的受者中，cd8效应t细胞(cd8 effector t,cd8 teff)显著扩增，并且高表达转录因子znf683。目前在人的原代t细胞中，对于znf683的研究局限于其表达水平的探究。既往研究表明znf683多表达于循环效应t细胞中，然而znf683对人原代t细胞的调控作用以及调控的具体分子机制尚未见报道。
[0006]
因此，针对以上不足，本发明研究了znf683在人原代t细胞中的调控作用，并通过
10等细胞因子的分泌水平降低,细胞毒性分子cd107a的表达下降；rna-seq结果发现在高表达znf683的cd8+t细胞中对维持端粒稳定性、保护和延伸至关重要的rtel基因上调；t细胞活化相关wnt信号通路在过表达znf683的cd8+t细胞中下调。
[0028]
第三，研究还发现t细胞在活化过程中会下调znf683的表达水平。可见，znf683是维持效应t细胞处于相对静止且长寿命状态的免疫检查点基因，t细胞通过上调znf683表达水平进入静息态，下调znf683水平进入活化状态。znf683基因的高表达可以诱导人t细胞进入免疫耐受状态，znf683可作为预测以及靶向急、慢性gvhd的关键分子。
附图说明
[0029]
图1：znf683在单倍型移植受者的cd8+t细胞中表达上调；a：rna-seq和atac-seq数据的综合分析。显示了来自haplo-sct受体与其配对供体相比，cd8 t细胞中的差异基因。
[0030]
图2：验证体外原代t细胞过表达znf683。a-b:通过慢病毒感染在健康人的cd3+t细胞中过表达znf683，感染48h后a：qpcr检测znf683的过表达效率。b：慢病毒感染效率在空白对照(non-infection)、空载对照(control)和znf683过表达组(znf683-oe)的流式典型图。
[0031]
图3：过表达znf683对原代t细胞增殖的影响。a-e:通过慢病毒感染在健康人的cd3+t细胞中过表达znf683，感染48h后。a-c：流式检测细胞周期的变化。d-e；感染48h后,用celltracetm violet细胞示踪剂标记3天，测对照组t细胞以及过表达znf683的t细胞增殖。
[0032]
图4：原代t细胞过表达znf683对凋亡的影响。a-b：通过慢病毒感染在健康人的cd3+t细胞中过表达znf683，感染48h后，用annexin v与7-aad共染共染检测t细胞凋亡。a：典型流式图。b：统计图。
[0033]
图5：原代t细胞过表达znf683对细胞因子分泌的影响。a-e:通过慢病毒感染在健康人的cd3+t细胞中过表达znf683，感染48h后,流式分选过表达znf683t细胞，体外刺激3d后，流式检测过表达znf683 gfp+细胞(a)、cd4+t细胞(b)、cd8+t细胞(c)分泌il-4、il-10、ifn-γ、il-2、cd107a的水平。d-e；统计图。
[0034]
图6：高表达znf683的原代cd8+t细胞转录谱变化
[0035]
a:热图展示高表达znf683的原代cd8+t细胞与对照组cd8+t细胞表达的差异基因。b：go富集分析高表达znf683的原代cd8+t细胞与对照组cd8+t细胞的差异基因。c：分选单倍型造血干细胞移植1年以上患者的cd8+t细胞，体外cd3/28beads刺激3天后，qpcr检测znf683的表达水平。
具体实施方式
[0036]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0037]
实施例1样本来源与细胞培养
[0038]
1.病例资料：选取北京大学人民医院血液病研究所接受单倍型相合以及同胞相合造血干细胞移植的患者及健康供者共8对；年龄周岁≦60周岁；造血干细胞移植后呈嵌合状态；停用免疫抑制剂；收集标本时，患者无慢性gvhd、无复发，无植入不良，无严重感染等移
植相关并发症发生。
[0039]
2.t细胞的分离与培养：通过ficoll密度梯度离心法从健康供体的骨髓中分离出人骨髓单核细胞(bmmcs)。使用cd3microbeads((miltenyibiotec,130-097-043)从bmmcs中纯化cd3+t细胞，并将cd3+t细胞重悬在imdm(gibco,invitrogen)+10％9500bit(stemcell technologies,09500)(血清替代物，排除血清中可能含有的tgf-β对t细胞造成的影响)+il-2(100u/ml)培养基中。
[0040]
实施例2慢病毒过表达znf683的表达水平
[0041]
znf683过表达的慢病毒载体购自sangon biotech(中国上海)。cd3+t细胞重悬于imdm+10％9500bit+il-2(100u/ml)培养基中，铺于24孔板，2
×
105细胞/孔，加入cd3/28beads(invitrogen,11131d)刺激，24h后将每孔培养体系浓缩至一半，根据病毒滴度加入相应体积的病毒，使得moi达到30，并加入polybrene(sigma,usa)至终浓度为6μg/ml；培养24h后换液。加入病毒48h后利用流式细胞术检测感染效率，并分析过表达znf683后，t细胞的增殖、凋亡、细胞因子分泌的变化。
[0042]
znf683在形成免疫耐受的单倍型移植受者的cd8 t细胞中表达上调。选取了8对在已停用免疫抑制药物的情况下，生存期大于1年的单倍型造血干细胞移植术后患者和其相应供者外周血标本，并且收取标本时无感染无复发等事件发生。我们分选了供受者外周血来源的cd3
+
cd4
+
和cd3
+
cd8
+
t细胞亚进行了转录组水平测序(rna-seq)以及atac-seq(assay for transposase-accessible chromatin with high throughput sequencing)。我们的结果表明在单倍型移植受者中，znf683不仅在cd8
+
t细胞中有更加开放的染质可及性，并且znf683在cd8
+
t细胞转录组水平表达明显上调(图1，表示了rna-seq和atac-seq数据的综合分析，显示了来自haplo-sct受体与其配对供体相比，cd8 t细胞中的差异基因。)
[0043]
验证体外原代t细胞过表达znf683。在体外通过慢病毒感染在人原代t细胞中过表达znf683，通过qpcr验证了感染后znf683的过表达水平(图2a)。定量pcr结果显示，znf683表达水平在znf683过表达组(znf683-oe)显著高于对照组(ct)，通过流式检测荧光标记的慢病毒载体感染效率(图2b)。
[0044]
实施例3.t细胞细胞周期检测
[0045]
在室温下重悬细胞于pbs中使用流式抗体避光孵育20分钟进行表面cd4-percp-cy5.5(biolegend，357414)，cd8-apc-r700(bd horizon，565165)染。使用固定/穿孔试剂盒(bd pharmingen,562574)对t细胞进行固定30分钟后加入抗体ki-67-apc(biolegend，350514)染，并在室温下孵育20分钟。pbs洗涤并上机检测。上机检测前加入dapi。单克隆抗体购于bd、biolengend公司。
[0046]
znf683抑制t细胞的增殖。znf683可能是单倍型相合造血干细胞移植后诱导或者维持cd8t+细胞免疫耐受的关键分子。真核细胞周期由四个不同的阶段组成:g1期、s期、g2期和m期。一方面，t细胞增殖对于产生有效的适应性免疫反应至关重要，增殖的一个关键因素是细胞进入细胞周期；另一方面，真核生物中的非增殖(非分裂)细胞通常从g1进入静止g0状态来长时间保持静止。我们为了探究znf683对t细胞周期进程的影响，使用ki67/dapi染后进行流式检测，将细胞周期分为g0，g1和s/g2/m期，结果显示与空载病毒对照感染的t细胞相比，高表达znf683的原代t细胞处于g0期的细胞比例明显增多(图3a、图3c)；与对照
组的t细胞相比，znf683过表达的t细胞ki-67的表达有下降(图3a、图3b)。使用celltrace
tm violet标记高表达znf683的原代t细胞与对照组原代t细胞，结果显示与对照组的t细胞相比，过表达znf683的t细胞增殖明显下降(图3d、3e)。
[0047]
实施例4.t细胞凋亡检测
[0048]
在室温下重悬细胞于pbs中使用流式抗体避光孵育20分钟进行表面cd4-af700(biolegend，357418)，cd8-v500(bd horizon，560774)并在室温下孵育20分钟,孵育完抗体后将细胞重悬于100μl 1
×
binding buffer，加入凋亡试剂盒annexinv-apc和7-aad-percp(bd pharmingen，550475)标记并室温避光孵育15min，pbs洗涤并1h内上机检测。单克隆抗体购于bd、biolengend公司。
[0049]
znf683抑制t细胞的凋亡
[0050]
t细胞的凋亡对t细胞形成免疫耐受来说至关重要。一方面，自身反应性tcr的胸腺细胞在发育过程通过细胞凋亡途径得以消除，免疫反应过程中扩增的效应t细胞也会发生凋亡(activation induced cell death,acid)。另一方面，细胞长寿是和tnaive以及记忆t细胞持续存在外周稳态扩增的基础。为了探究znf683对t细胞凋亡的影响，我们通过流式分选过表达znf683的t细胞，用annexin v与7-aad共染评估znf683对t细胞凋亡的影响。结果显示高表znf683的t细胞早凋与晚凋比例较对照组下降(图4a、图4b)，这些结果表明znf683与t细胞的长寿命状态相关。
[0051]
实施例5细胞分泌因子和细胞毒分子的表达检测
[0052]
收集细胞前4h使用golgiplug(bd pharmingen,555029)在室温下重悬细胞于pbs中使用流式抗体避光孵育20分钟进行表面cd4-percp-cy5.5(biolegend，357414)，cd8-apc-r700(bd horizon，565165)染。使用固定/穿孔试剂盒(bd pharmingen,562574)对t细胞进行固定30分钟后加入抗体ifn-γ-bv510(biolegend，502528)、cd107a-pe(bd pharmingen，555801)收集细胞前4h加入；il-4-apc(biolegend，500714)、il-10-pe-cy7(biolegend，501420)、il-2-v450(biolegend，560867)染，并在室温下孵育20分钟。pbs洗涤并上机检测。单克隆抗体购于bd、biolengend公司。
[0053]
实施例6.celltracetm violet细胞增殖实验
[0054]
重悬细胞于预温的pbs，细胞浓度1
×
106/ml，每1ml细胞中加入1ul celltracetm violet(thermofisher,c34557)贮存液，终浓度为10um，37℃孵育30min，并加入5倍体积的完全培养基，终止染。培养3天后405nm激发光检测。
[0055]
实施例7.定量qpcr检测znf683mrna的表达情况
[0056]
根据rneasy mini试剂盒(qiagen,74106)的实验方法提取来自健康供者纯化的t细胞的rna。使用cdna逆转录试剂盒(takara，rr047a)进行cdna的合成。利用sybr green染料法检测细胞中目的基因的表达情况。以18s作为内参，使用δδct方法计算目的基因mrna的相对表达。引物序列如下：znf683上游引物：5'-catatgtggcaagagctttgg-3'；znf683下游引物：5'-ggcaagttgagtgaagctct-3'，18s上游引物：5'-accgattggatggtttagtgag-3'；和18s下游引物：5'-cctacggaaaccttgttacgac-3'。
[0057]
实施例8.rna-seq实验
[0058]
使用rneasy micro kit(qiagen,74004)提取rna，并通过nebnextoligo d(t)25珠子(neb,e7490)纯化mrna；使用nebnext ultra ii rnalibrary prep kit(neb,e7770s)用
于构建cdna文库；使用ampure xp珠子(beckman coulter，a63881)用于纯化300bp到500bp之间的cdna文库。cdna双末端测序在novaseq6000(illumina)上进行，每个样本产生28到3500万个150bp双末端读数。
[0059]
统计学分析：spss 20.0用于统计分析，使用配对t检验评估znf683-0e、ct组凋亡、细胞因子分泌、增殖在组间的差异。p＜0.05认为差异具有统计学差异。
[0060]
实施例9 znf683降低t细胞因子分泌水平
[0061]
il-2主要作为重要的t细胞生长因子,不仅是重要的免疫刺激剂，也对调节t细胞的免疫反应和维持其外周耐受发挥着至关重要的作用。为了探究znf683对t细胞分泌il-2的影响，流式分选过表达znf683的t细胞，体外cd3/28beads刺激培养三天后，流式评估测定过表达znf683的t细胞的因子分泌水平。我们的结果显示相较于对照组的t细胞，高表达znf683的gfp+细胞，以及cd4+t,cd8+t细胞中il-2分泌降低的趋势明显(图5a、图5c、图5d)，在cd3+，cd8+t细胞中il-2分泌降低趋势具有统计学意义(图5e)。我们的结果还显示，相较于对照组t细胞，高表达znf683的gfp+细胞、cd4+t、cd8+t细胞中il-4,il-10分泌都有降低的趋势(图5a、图5b)，其中il-4在总t细胞中降低趋势有统计学意义(图5d)，并且il-10在高表达znf683的cd4+t细胞中降低趋势有统计学意义(图5d)。cd107a是nk和活化的cd8+t细胞脱颗粒的标志物，ifn-γ的间接作用通常会增强cd8+t细胞活性。对于这两种细胞因子的分泌情况，我们的结果显示，相较于对照组t细胞，高表达znf683组的gfp+细胞，cd4+t,cd8+t细胞中inf-γ,cd107a表达水平降低，inf-γ表达水平降低，其中在高表达znf683的gfp+细胞，高表达znf683的cd4+t细胞中inf-γ表达降低的水平有统计学意义(图5d)，并且cd107a表达水平降低在高表达znf683的gfp+细胞、cd8+t中有统计学意义(图5e)。
[0062]
图5原代t细胞过表达znf683对细胞因子分泌的影响
[0063]
a-e:通过慢病毒感染在健康人的cd3+t细胞中过表达znf683，感染48h后,流式分选过表达znf683t细胞，体外刺激3d后，流式检测过表达znf683 gfp+细胞(a)、cd4+t细胞(b)、cd8+t细胞(c)分泌il-4、il-10、ifn-γ、il-2、cd107a的水平。d-e；统计图。
[0064]
实施例10.过表达znf683的cd8+t细胞活化端粒维持相关信号通路
[0065]
在明确了znf683的表达对诱导t细胞处于静止且长寿命的调控作用后，我们为了探究znf683调控t细胞的具体分子机制，我们对高表达znf683的cd8+t细胞与对照组cd8+t进行rna-seq。我们的结果显示znf683表达在高表达znf683组中上调，与对照组cd8+t细胞相比，维持端粒稳定性、保护和伸长至关重要的rtel1在高表达znf683的cd8+t细胞中表达上调(图6a)，参与端粒维持过程的t环形成相关基因和端粒环解体相关基因在过表达znf683的cd8+t细胞中富集(图6b)。此外，与对照cd8+t细胞相比，wnt信号通路相关基因，如porcn，在过表达znf683的cd8 t细胞中下调(图6a-b)。最有趣的是，我们发现分选单倍型造血干细胞移植1年以上患者的cd8+t细胞，体外cd3/28beads刺激后，znf683的表达水平降低。这些结果表明：znf683的高表达使cd8+t细胞处于失活的状态；与此同时znf683维持cd8+t细胞中端粒的复制能力并抑制cd8+t细胞的凋亡，可能是抑制cd8+t细胞衰老的重要调控基因。此外，当cd8+t细胞在体外被活化的过程中，znf683的表达会下调，说明znf683可能是维持cd8+t细胞处于静息态的免疫检查点。
[0066]
实施例11gvhd模型小鼠的
[0067]
将balb/c小鼠(h-2d)进行全身8gy致死剂量照射清髓后，形成放射性造血损伤模
型。回输c57bl/6小鼠来源的去除t细胞的骨髓细胞(tcelldepletion-bm)混合脾脏来源t细胞(spleent)。
[0068]
对照组(20只)通过尾静脉注射5
×
106tcd-bm+3
×
106spleent；
[0069]
组(20只)通过尾静脉注射5
×
106tcd-bm+3
×
106spleent-znf683-oe，即利用慢病毒在脾脏来源t细胞中过表达znf683基因。
[0070]
观察并记录两实验组在接受异源hsc移植后的存活时间。
[0071]
试验结果表明，对照组的造血损伤小鼠体内注射入异源造血干细胞后，所有小鼠均产生严重的gvhd，表现为超过三分之一以上的体重损失以及因为严重gvhd而死亡。对照组的存活率在8天内下降到了50％，并且所有小鼠在14天内皆因严重gvhd死亡。
[0072]
而组中的老鼠由于接受了过表达znf683慢病毒载体，gvhd症状显著减轻，其存活率在8天内提高到了80％，并且在14天有超过50％以上的小鼠存活。
[0073]
该实施例验证了过表达znf683能够或预防移植物抗宿主病gvhd，从而进而提高gvhd模型小鼠的存活率。
[0074]
综上所述，体外实验结果表明，znf683高表达抑制t细胞增殖和细胞毒功能，并且抑制t细胞凋亡。进一步结合组学数据分析发现，在高表达znf683的cd8 t细胞中，参与维持端粒稳定性、保护和延伸至关重要的rtel基因表达上调，即znf683与体内hcmv感染后的特异性t细胞、过继性免疫细胞后的t细胞持续存在相关；同时实验发现znf683的高表达下调了t细胞活化wnt信号通路相关基因。结合这些体外实验证明了znf683使t细胞处于静止并且长寿命的状态。另外，还发现haplo-sct受者cd8
+
t细胞和健康供者的cd8
+
t细胞在体外受到刺激时，znf683表达均有所降低。这些结果均表明znf683是cd8效应t细胞处于长寿命、静止状态的免疫检查点。
[0075]
因此，形成免疫耐受的haplo-sct受者中cd8
+
t细胞高表达znf683表明:znf683是维持haplo-sct受者免疫耐受的关键调控分子。综上所述，本发明为临床单倍型相合造血干细胞移植后免疫耐受的监测、预测以及靶向急、慢性gvhd的潜在关键分子。
[0076]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
技术特征：
1.znf683在制备用于t细胞免疫耐受调控相关疾病的诊断或预后监测的试剂或试剂盒中的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述t细胞免疫耐受调控相关疾病为异基因造血干细胞移植引起的疾病，优选为急性或慢性移植物抗宿主病(gvhd)。3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂为检测znf683表达量的试剂，所述试剂盒中含有检测znf683表达量的试剂。4.根据权利要求2或3所述的用途，其特征在于，所述检测znf683表达量的试剂包括检测mrna表达量和/或蛋白表达量的试剂。5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述检测mrna表达量的试剂包括以下方法中使用到的试剂：基于pcr的检测方法、southern杂交方法、northern杂交方法、点杂交方法、荧光原位杂交方法、dna微阵列方法、aso法、高通量测序平台方法。6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述检测znf683的mrna表达量的试剂包括特异性引物和/或探针，优选的，所述znf683上游引物：5'-catatgtggcaagagctttgg-3'；znf683下游引物：5'-ggcaagttgagtgaagctct-3'。7.znf683在制备用于或预防t细胞免疫耐受调控相关疾病的药物中的用途。8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述t细胞免疫耐受调控相关疾病为异基因造血干细胞移植引起的疾病，优选为急性或慢性移植物抗宿主病。9.根据权利要求7或8所述的用途，其特征在于，所述药物为用于增加患者体内znf683基因或蛋白的量的试剂。10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述试剂为znf683的激动剂、过表达znf683的慢病毒载体或者znf683的功能域的模拟肽。
技术总结
本发明涉及ZF683作为靶标在T细胞免疫耐受调控相关疾病的诊断或预后监测，以及方面的用途。特别的，本发明研究了ZF683对人原代T细胞的调控作用，检验了ZF683作为临床移植后预后及GVHD靶点的可行性。床移植后预后及GVHD靶点的可行性。床移植后预后及GVHD靶点的可行性。
