免疫组库正常性评估方法及其应用与流程
免疫组库正常性评估方法及其应用
1.本技术是国际申请日为2016年9月29日、国际申请号为pct/us2016/054469于2018年3月22日进入中围国家阶段、申请号201680055322.3、发明名称“免疫组库正常性评估方法及其应用”的申请的分案申请。
2.相关申请的交叉引用
3.本技术要求标题为“免疫组库正常性测定方法及其应用(immunorepertoire normality assessment method and its use)”并在2015年9月29日提交的美国临时专利申请号62/234,424的优先权，其通过引用并入本文。
发明领域
4.本公开内容涉及用于进行诊断测试的方法。更具体地，本公开内容涉及用于相对于标准指数评估免疫组库多样性的诊断测试。
5.发明背景
6.诊断测试可以用于检测患者中是否存在正常状态，并且这些测试的结果可以用于筛选患者并且笼统得辅助诊断。例如，正常白细胞计数为4,500至10,000个细胞/毫升。升高的白血病计数不确定特定的疾病，但是其可以指示需要医学评价的潜在问题。女性和男性的红细胞计数的正常范围通常是不同的，对于男性，5-6百万/毫升的计数是正常的，对于女性，3.6-5.6百万是正常的。通过其在150,000至400,000的范围内，血小板计数是正常的。例如，存在炎症时，红细胞可能下降，白细胞计数可能上升，并且血小板计数也可能升高。
7.类似地，心脏病、患有心脏病的倾向性、某些癌症的征兆和多种遗传病可能具有多种诊断测试的一种或或多种异常结果作为其早期征兆。此类诊断测试包括，例如，下述的测量：白蛋白，碱性磷酸酶，丙氨酸转氨酶(alt)，天冬氨酸氨基转移酶(ast)，血尿素氮(bun)，血清钙，血清氯化物，二氧化碳，肌酸酐，直接胆红素，γ-谷氨酰胺转肽酶(gamma-gt)，葡萄糖，乳酸脱氢酶(ldh)，血清无机磷，钾，血清钠，总胆红素，总胆固醇，总蛋白和尿酸。
8.另外，血糖水平也可以用作与疾病相关的早期指征，其在库欣综合征(cushing syndrome)、甲状腺功能亢进症(hyperthyroidism)、胰腺癌、胰腺炎、前驱糖尿病(pre-diabetes)和糖尿病中是不同的。
9.如上文所述，诊断测试目前是可用的，并且以常规基础进行以检测个体中异常状态的存在或不存在。然而，这些测试不涉及患者中免疫组库的多样性。检测个体中相对于标准物是否存在多样性的免疫组库的能力可以辅助对所述个体的健康的评估。
10.发明概述
11.本公开内容涉及用于确定患者中免疫组库多样性的方法。所述方法包括：定量患者样品中免疫系统细胞或亚中第三互补性决定区(“cdr3”)的表达；并且鉴定所述或亚内由所述cdr3表示的pcdr3的百分数，其中正常的免疫组库多样性特征在于存在pcdr3的最小百分数，而异常的免疫组库多样性状态特征在于不存在pcdr3的最小百分数。
12.在某些实施方案中，所述方法中pcdr3的最小百分数是选自约25％至约75％的百分数。在另一些实施方案中，pcdr3的最小百分数是约25％。在另一些实施方案中，pcdr3由
约1000种最常共有的cdr3构成。在另一些实施方案中，pcdr3由多于1000种最常共有的cdr3构成。在另一些实施方案中，pcdr3由少于1000种最常共有的cdr3构成。在另一些实施方案中，pcdr3由个体集合中至少25％的个体所共有的cdr3构成。
13.在某些实施方案中，pcdr3由个体集合中至少50％的个体所共有的cdr3构成。在某些实施方案中，所述集合包含至少100个个体。在另一些实施方案中，所述集合包含约1000个个体。
14.本公开内容还涉及用于确定患者中的免疫组库多样性的方法。所述方法包括：在包含靶标特异性巢式引物的反应混合物中，从来自人或动物受试者的白细胞扩增多核苷酸，以产生一组第一扩增子，至少一部分靶标特异性的巢式引物包含在扩增过程中作为模板用于在第一扩增子中掺入用于至少一个共用引物的结合位点的另外的核苷酸；将一部分包含第一扩增子的第一反应混合物转移到包含至少一种共用引物的第二反应混合物中；使用所述至少一种共用引物，扩增所述第一扩增子，以产生一组第二扩增子；对所述第二扩增子测序，以鉴定白细胞亚中的cdr3序列；使用所鉴定的cdr3序列来定量由所述样品所表示的pcdr3百分数，从而提供正常性指数；并且鉴定所述正常性指数是正常的还是异常的，其中正常状态特征在于存在最小的pcdr3百分数，而异常状态特征在于不存在最小的pcdr3百分数。
15.在某些实施方案中，所述第二方法测量白细胞，其中所述包含约100,000个随机选择的细胞。在某些实施方案中，所述方法重复约10至100次，每次使用随机选择的细胞，以确定由患者表达的pcdr3的平均百分数。在某些实施方案中，pcdr3的最小百分数是约25-约75的百分数数字。在某些实施方案中，pcdr3由至少1000种最常共有的cdr3构成。在某些实施方案中，pcdr3包括本文所述的seq id no：1至seq id no：4014。例如，患者的正常性指数可以基于由seq id no：1至seq id no：4014所示的pcdr3序列的百分数(其以患者样品的预先确定的读数表示)来确定。在某些实施方案中，pcdr3由个体集合中至少50％的个体所共有的cdr3构成。
16.参比个体集合可以是不同规模的。在某些实施方案中，参比集合包括至少100个个体。在某些实施方案中，所述集合包含约1000个个体。在某些实施方案中，所述集合由健康对照个体构成，而在另一些实施方案中，所述集合由患有一种或多种具体的疾病状态的个体构成。可以进一步控制参比集合以解释给定患者的某些变量。在某些实施方案中，个体的集合与患者大致在年龄上匹配。在另一些实施方案中，个体集合与患者是性别匹配的。
17.在本公开内容的不同方面中，以本文所述的方法分析的免疫系统细胞可以包括，例如，所有的t细胞[pant]，t细胞的功能性亚组，如cd8+t细胞[细胞毒性的t(ta)]，cd4+t细胞和它们的亚组[th1，th2，th17，调节性t(reg)和滤泡性t(tfh)]，或t细胞的发育亚组，如幼稚的(naive)t(tn)，激活的t(ta)，记忆性t(tm)，所有的b细胞(panb)和它们的亚组，诸如幼稚的b(br)，激活的b(ba)，记忆性b(bm)，浆细胞和浆母细胞b细胞。所述细胞可以从外周血或本领域已知的其他来源获得。
[0018]
本领域技术人员应该清楚，通过示例的方式仅描述了优选的实施方案，并且存在在本公开内容范围之内的多种改进。本公开内容的这些和其他方面将在下文更详细地讨论。
[0019]
附图简述
[0020]
图1显示叠加在单幅图中的四个图，表示(从上到下)总读数的数目、独特的cdr3的数目、pcdr3的数目和正常性指数。
[0021]
详述
[0022]
本方面人已经开发了一种通过比较患者样品中的cdr3序列与指标个体组中最常共有的cdr3序列(即，pcdr3)而确定患者免疫组库的多样性的方法。患者样品中这一pcdr3的百分数称为“正常性指数”，并且可以作为所述患者中免疫组库多样性的诊断指征。本公开内容还包括用于确定所述高度共有的pcdr3的亚组的方法。在本公开内容的一个方面中，如果患者的正常性指数满足或超过最小百分数，则认为患者的免疫组库是正常的，而如果患者的正常性指数低于所述最小百分数，则认为患者的免疫组库是异常的。用在本文中时，“患者”可以是指人或动物。
[0023]
个体表达的cdr3表现出巨大的多样性，具有多至10^15种可能的独特的cdr3。由此，本公开内容使用cdr3作为免疫系统多样性的基础。本发明人已经基于7500万份cdr3取样确定大约81％随机选择的cdr3是给定的个体所特有的，并且在多个个体之间不共有。然而，本公开内容提供一种用于确定高度共有的cdr3的集合的方法，由此得到共有cdr3的标准指数，通过该标准指数可以比较个体免疫组库的多样性。
[0024]
用于本文时，“异常”意指在患者中不存在测量的pcdr3序列的最小百分数。由此，异常表示与用于产生pcdr3的参比个体组的差异。异常的免疫组库可以，但是不必须，表示患者中疾病的存在与否。
[0025]
用于本文时，“免疫组库”意指实际在一个或多个个体的淋巴细胞中检测到的一组不同的cdr3序列。
[0026]
本公开的方法可以使用下述步骤进行，以鉴定患者中正常的免疫状态或异常的免疫状态，所述方法包括下述步骤：(a)在包含靶标特异性巢式引物的反应混合物中，从来自患者的白细胞扩增多核苷酸，以产生一组第一扩增子，至少一部分靶标特异性的巢式引物包含在扩增过程中作为模板用于在第一扩增子中掺入用于至少一个共用引物的结合位点的另外的核苷酸；(b)将一部分包含第一扩增子的第一反应混合物转移到包含至少一种共用引物的第二反应混合物中；(c)使用所述至少一种共用引物，扩增所述第一扩增子，以产生一组第二扩增子；(d)对所述第二扩增子测序，以鉴定白细胞亚中的cdr3序列；和(e)使用所鉴定的cdr3序列来定量由所述样品所表示的pcdr3百分数，从而提供正常性指数；和(f)鉴定所述正常性指数是正常的还是异常的，其中正常状态特征在于存在最小的pcdr3百分数，而异常状态特征在于不存在最小的pcdr3百分数。如图1所示，患者的正常性指数、pcdr3和独特的cdr3是相关的。
[0027]
在某些实施方案中，测序包括每份样品采集约100,000个读数。在某些实施方案中，使用随机选择，读数进行多次，例如，约10至100次，从而获得样品中存在的pcdr3序列的平均百分数。得到的数目除以参比集合中的pcdr3数目，以得到一个称为“正常性指数”的百分数，其是在0％与100％之间的数目。例如，如果患者样品包含1000个pcdr3序列中的400个，那么该患者的正常性指数是0.40或40％。在另一些实施方案中，采集至少10,000个读数。在另一些实施方案中，采集多于100,000个读数。在另一些实施方案中，读数进行少于10次。在另一些实施方案中，读数进行多于100次。
[0028]
在某些实施方案中，指数集合由约1000个个体构成。在另一些实施方案中，指数集
合包含100-1000个个体。在另一些实施方案中，指数集合包含少于100个个体。在另一些实施方案中，指数集合包含多于1000个个体。相对于患者，个体可以是年龄匹配的、性别匹配的、健康的、疾病匹配的和/或当关于变量进行对照时本领域通常已知的其他标准。在某些实施方案中，指数集合由健康对照组成。在另一些实施方案中，指数集合由健康对照和具有一个或多个疾病状态的个体的混合组成。在另一些实施方案中，指数集合由具有一个或多个特定疾病状态的个体构成。
[0029]
在某些实施方案中，通过比较来自指数集合的每份样品并鉴定由所述参比集合中检测的至少50％的个体共有的那些cdr3来确定指数集合共有的cdr3序列(即，pcdr3)。在某些实施方案中，pcdr3包括大约前1000个共有的cdr3序列。在另一些实施方案中，pcdr3包括至少100个cdr3序列。在另一些实施方案中，pcdr3包括多于1000个cdr3序列。
[0030]
在某些实施方案中，用于确定免疫组库的正常或异常状态的最小pcdr3百分数为约25％。在另一些实施方案中，最小pcdr3百分数为25％-75％。
[0031]
由于人或动物免疫系统中细胞的数目和种类如此庞大，使得对多于一个小亚组的细胞进行测序几乎是不可能的，因此之前难以以宽泛的方式评估免疫系统。本发明人开发了一种或半定量的pcr方法(arm-pcr，在美国专利申请公布号20090253183中更详细地描述)，其提供比之前可用的方法增加的灵敏性和特异性，同时产生半定量结果。正是这种能力增加特异性和灵敏性，并且由此增加单个样品中可检测的靶标的数量，这使得该方法理想地用于检测免疫组库的克隆型的相对数目。本发明人最近发现，使用这种测序方法允许比较患者的cdr3序列与指数组通常共有的那些，这导致开发了本发明的方法。所述方法可以用于相对于个体的指数集合评价受试者免疫组库的多样性。例如，本发明人已经证明了疾病的存在与患病的免疫组库多样性相关，例如，cdr3序列的多样性下降，这可以使用本公开的方法容易地检测到。因此，尽管目前在临床实践中使用细胞计数和生化测试，但是这种方法可以用作正常相对异常免疫组库多样性的初始诊断指征。
[0032]
免疫组库的克隆型(即，克隆类型)通过在免疫系统的免疫球蛋白(ig)和t细胞受体(tcr)产生的早期阶段可变的(v)、多样性(d)和连接(j)基因片段经由体细胞重组的重排来确定。v(d)j重排可以从t细胞受体α、β、γ和δ链以及从免疫球蛋白重链(igh)和轻链(igk，igl)扩增并检测。例如，细胞可以通过获得外周血、淋巴组织、癌组织、或来自其他器官和/或器官系统的组织或流体从患者获得。获得这些样品(诸如血液样品)的技术是本领域技术人员已知的。细胞计数可以从通过pcr扩增和测序检测的序列的数目推测得到。
[0033]
cdr3区包含约30-90个核苷酸，包括重组的基因的可变的(v)、多样性(d)和连接(j)片段的连接。其编码受体的结合特异性，并且可用作序列标签以鉴定独特的v(d)j重排。
[0034]
wang等公开了可以使用pcr来获得样本中靶分子数目的定量或半定量测定(wang，m.等人，“quantitation of mrna by the polymerase chain reaction，”(1989)proc.nat’l.acad.sci.86：9717-9721)。本发明人之前已经描述了用于实现定量扩增的特别有效的方法。一种这样的方法称为arm-pcr，其记载在美国专利申请公布号20090253183a1中。
[0035]
本公开的各个方面包括从t细胞、b细胞和/或t或b细胞亚组arm-pcr扩增cdr3。所述细胞型可以使用本领域已知的技术分选并分离，所述技术包括，但不限于，facs分选和磁珠分选。因此，本文中所用的术语细胞“”包括通常称为细胞“”或“亚”的那些。然后，
例如，使用诸如454或illumina的平台，使用下一代测序，有效地对大量扩增的产物进行测序。
[0036]
arm-pcr方法在一次反应中提供多个多核苷酸的高度灵敏的、半定量的扩增。arm-pcr方法还可以通过自动化方法在封闭的盒系统(huntsville，alabama)中进行，这在本发明的方法是有益的，原因在于，例如，多种t和b细胞的库是如此庞大的。在arm-pcr方法中，靶标数量在由dna聚合酶驱动的反应中增加，这是被引入到反应中的靶标特异性引物的结果。该扩增反应的另一个结果是引入用于共用引物的结合位点，其通过将一部分包含第一组扩增子的第一反应混合物转移到包含共用引物的第二反应混合物中而用于后续的扩增。用于本文时，“至少一种共用引物”是指至少一种将与所述结合位点结合的引物，并且包括引物对，诸如正向引物和反向引物。该转移可以通过从第一扩增反应回收一部分反应混合物并且将所述样品引入到第二反应管或室中而进行，或者通过从结束的第一扩增中去除一部分液体，留下一部分，并且向进行第一扩增的管中加入新鲜的试剂而进行。在每种情形中，然后，将另外的缓冲液、聚合酶等与共用引物一起加入，以产生扩增的产物用于检测。使用共用引物扩增靶分子提供半定量结果，其中在第一扩增中扩增的定量数目的靶标使用共用引物而不是靶标特异性引物而扩增——这使其可以产生显著更高数量的靶标用于检测并且确定患者血液样品内包含多种重排的细胞的相对量。此外，将第二反应混合物与一部分第一反应混合物组合允许向第一反应混合物中加入更高浓度的靶标特异性引物，这在第一扩增反应中导致更高的灵敏性。正是使用诸如arm-pcr方法的方法的特异性和灵敏性以及获得定量结果的能力的组合允许对在细胞中表达的cdr3的充分灵敏和定量的评估，从而产生具有诊断用途的正常性指数。
[0037]
由于识别抗原的克隆扩增导致更大的识别所述抗原的细胞，潜在地包括产生抗体的b细胞或携带受体的t细胞。这可能引起依据本文公开的方法采集的读数偏向抗原特异性扩增方面，由此减少检测的pcdr3序列的百分数。因此，相对低的正常性指数，例如，低于最小百分数的一个正常性指数，可能指示在已经诊断患有特定疾病的个体中或在最近用特定的抗原疫苗接种的个体中普遍存在的特定细胞的扩增。
[0038]
用于扩增和测序免疫系统细胞的可变区的引物可商购得到，并且已经在出版物中记载，诸如记载在本发明人公开的专利申请w02009137255和us201000021896a1。
[0039]
存在一些可商业获得的高通量测序技术，诸如hoffman-laroche公司的测序系统。在测序方法中，例如，a和b衔接子在pcr过程中连接在pcr产物上或在pcr反应后连接在其上。所述衔接子用于扩增和测序步骤。当联合arm-pcr技术进行时，a和b衔接子可以用作扩增反应中的共用引物(其有时称为“公用引物”或“超级引物”)。在a和b衔接子物理连接到样品文库(如pcr扩增子)上后，使用本领域技术人员已知的技术制备单链dna文库。将所述单链dna文库固定在特别设计的dna捕获珠子上。每个珠子携带独特的单链dna文库片段。将珠子结合的文库用在油包水混合物中的扩增试剂乳化，产生微型反应器，每个微型反应器仅包含一个具有一个独特的样品-文库片段的珠子。每个独特的样品文库片段在其自身的微型反应器内扩增，排除了竞争或污染序列。整个片段集合的扩增平行进行。对于每个片段，这导致每个珠子有数百万拷贝数。随后，中断乳液pcr，而扩增的片段保持与其特定的珠子结合。将克隆扩增的片段富集并且上样到装置上进行测序。孔的直径仅允许每个孔一个珠子。将加入测序酶后，测序仪器的流控亚系
统在成千上百个分别包含单个珠子的孔之间以固定的次序流过个体核苷酸。加入与模板链互补的一个(或多个)核苷酸导致通过该仪器内的ccd照相机记录的化学发光信号。使用gs flx系统，装置产生的信号强度和位置信息的组合允许软件确定大于1,000,000个个体读数的序列，每个多至约450个碱基对。
[0040]
使用定量和/或半定量方法已经获得了序列，然后可以计算正常性指数，例如，通过确定由患者样品预先确定的读数数量所表示的pcdr3百分数来计算。每个患者的正常性指数可以与预先确定的阈值进行比较，以确定所述患者的正常性指数是否落入正常范围内，并且因此是正常的，或者低于该阈值，并且因此是异常的。
[0041]
本公开内容的方法为医师提供另外的诊断目的的临床测试，以确定患者的免疫组库是否是异常的。此外，本公开内容的方法，特别是如果用在自动化系统中，诸如本发明人在美围专利申请公布号201000291668a1中所述的自动化系统中，可以用于分析来自多名患者的样品，通过使用一个或多个微阵列实现对所扩增的靶序列的检测。
实施例
[0042]
患者样品
[0043]
采集在肝素钠中全血样品(40ml)或外周血单核细胞细胞(pbmc)是从1100个个体获得的，代表健康个体和患有疾病的个体的混合体。将这1100个个体随机分成11个不同的组，每组100份样品。
[0044]
rna提取和库扩增
[0045]
rna提取使用rneasy迷你试剂盒(rneasy mini kit，qiagen)按照供应商流程进行。对于每个靶标，使用在www.irepertoire.com可用的引物软件设计一组巢式序列特异性的引物(正向-外，fo；正向-内，fi；反向-外，ro；和反向-内，ri)。将一对共有序列标签连接到所有内部引物(fi和ri)上。一旦在前几个扩增周期中这些标签被掺入到pcr产物中，使用一对公用引物进行扩增的指数相。在第一轮扩增中，仅使用序列特异性的巢式引物。然后通过外切核酸酶消化去除巢式引物，并且通过加入公用引物和新鲜酶与dntp的混合物，使用第一轮pcr产物作为模板进行第二轮扩增。由pcr引物向来自相同样品的扩增子中引入每种独特的条形码(barcode)。
[0046]
测序
[0047]
将来自不同样品的条形码标记的扩增子产物汇合在一起，并且上样到2％琼脂糖凝胶上。在电泳后，从对应由琼脂糖凝胶上切下的250-500bp片段的dna条带纯化dna片段。使用钛试剂盒(seqwright，inc.)用454gsflx系统对dna测序。
[0048]
测序数据分析
[0049]
按照条形码标签分选每种样品的序列。在序列分离后，以与wang等人报道的方法(wang c，等人.high throughput sequencing reveals a complex pattem of dynamic interrelationships among human t cell subsets.proc natl acad sci usa 107(4)：1518-1523)相似的方式进行序列分析。简言之，将由imgt服务器(http：//www.imgt.org)下载的种系v和j参比序列用程序irmap绘制到序列读数上。通过绘图信息，将参比序列中限定cdr3区的边界映照到测序读数上。提取测序读数中所包括的cdr3区，并且翻译成氨基酸序列。
[0050]
确定pcdr3
[0051]
将从11组的每个组得到的序列进行比较，以确定哪些cdr3序列在每组至少50％的样品中检测到。将得到的cdr3序列分选，以选择前4014个最常共有的cdr3序列作为pcdr3，用于计算患者样品的正常性指数的目的。为包括在pcdr3中所选的cdr3序列-seq id no：1到seq id no：4014-显示在表i中。
[0052]
表i
[0053]
[0054]
[0055]
[0056]
[0057]
[0058]
[0059]
[0060]
[0061]
[0062]
[0063]
[0064]
[0065]
[0066]
[0067]
[0068]
[0069]
[0070]
[0071]
[0072]
[0073]
[0074]
[0075]
[0076]
[0077]
[0078]
[0079]
[0080]
[0081]
[0082]
[0083]
[0084]
[0085]
[0086]
[0087]
[0088]
[0089]
[0090]
[0091]
[0092]
[0093]
[0094]
[0095]
[0096]
[0097]
[0098]
[0099]
[0100]
[0101]
[0102][0103]
本技术提及多篇出版物。这些出版物的公开内容以它们的整体特此通过引用并入本技术中以更充分地描述本技术所述属领域的状态。关于在所述参考文献所依赖的句子中讨论的、在它们中所含的内容，公开的参考文献也个别地和具体地通过引用并入本文。
[0104]
本文描述的方法及其各种实施方案是示例性的。本文描述的方法的各种其它实施方案是可能的。
技术特征：
1.一种用于使用免疫组库多样性评估个体患者的免疫组库的正常或异常状态的方法，所述方法包括下述步骤：(a)使用针对由参比个体组共有和鉴定的pcdr3序列的引物，检测在所述共有的pcdr3序列组内的个体的cdr3在所述患者的免疫组库中的存在；和(b)鉴定来自所述患者的免疫组库内存在的所述共有组的pcdr3序列的百分数，以评估所述患者的免疫组库的状态，其中，相对于所述共有的组，存在共有pcdr3序列的最小百分数表示正常的免疫组库，和不存在共有pcdr3序列的最小百分数表示异常的免疫组库。2.权利要求1的方法，其中细胞选自由下述组成的组：所有t细胞[pant]，cd8+ t细胞[细胞毒性的t(ta)]，cd4+ t细胞和它们的亚组[th1，th2，th17，调节性t(treg)，滤泡性t(tfh)]，t细胞的发育亚组，如幼稚的t(tn)，激活的t(ta)，记忆性t(tm)，所有的b细胞(panb)，幼稚的b(br)，激活的b(ba)，记忆性b(bm)，浆细胞和浆母细胞b细胞。3.权利要求1的方法，其中所述pcdr3的最小百分数是选自约25％至约75％的百分数数字。4.权利要求1的方法，其中所述pcdr3的最小百分数是约25％。5.权利要求1的方法，其中所述pcdr3由约1000个最常共有的cdr3构成。6.权利要求1的方法，其中所述pcdr3由多于1000个最常共有的cdr3构成。7.权利要求1的方法，其中所述pcdr3由少于1000个最常共有的cdr3构成。8.权利要求1的方法，其中所述pcdr3由个体集合中至少25％的个体共有的cdr3构成。9.权利要求1的方法，其中所述pcdr3由个体集合中至少50％的个体共有的cdr3构成。10.权利要求9的方法，其中所述集合包含至少100个个体。11.权利要求9的方法，其中所述集合包含约1000个个体。12.用于确定患者中免疫组库多样性的方法，所述方法包括：(a)在包含靶标特异性巢式引物的反应混合物中，从来自人或动物受试者的白细胞扩增多核苷酸，以产生一组第一扩增子，至少一部分靶标特异性的巢式引物包含在扩增过程中作为模板用于在第一扩增子中掺入至少一个共用引物的结合位点的另外的核苷酸；(b)将一部分包含第一扩增子的第一反应混合物转移到包含至少一种共用引物的第二反应混合物中；(c)使用所述至少一种共用引物，扩增所述第一扩增子，以产生一组第二扩增子；(d)对所述第二扩增子测序，以鉴定白细胞亚中的cdr3序列；(e)使用所鉴定的cdr3序列来定量由所述样品所表示的pcdr3百分数，从而提供正常性指数；和(f)鉴定所述正常性指数是正常的还是异常的，其中正常状态特征在于存在最小的pcdr3百分数，和异常状态特征在于不存在最小的pcdr3百分数。13.权利要求12的方法，其中所述细胞选自由下述组成的组：所有的t细胞[pant]，cd8+ t细胞[细胞毒性的t(ta)]，cd4+ t细胞和它们的亚组[th1，th2，th17，调节性t(treg)，滤泡性t(tfh)]，t细胞的发育亚组，如幼稚的t(tn)，激活的t(ta)，记忆性t(tm)，所有的b细胞(panb)，幼稚的b(br)，激活的b(ba)，记忆性b(bm)，浆细胞和浆母细胞b细胞。14.权利要求12的方法，其中所述白细胞为约100,000个随机选择的细胞。15.权利要求12的方法，其中所述方法重复约10至100次，每次使用随机选择的细胞，从
而确定由所述患者表达的pcdr3的平均百分数。16.权利要求12的方法，其中所述pcdr3的最小百分数是约25至约75的百分数数字。17.权利要求12的方法，其中所述pcdr3的最小百分数为约25％。18.权利要求12的方法，其中所述pcdr3由至少1000个最常共有的cdr3构成。19.权利要求12的方法，其中所述pcdr3包括seq id no：1至seq id no：4014。20.权利要求12的方法，其中所述pcdr3由个体集合中至少50％的个体共有的cdr3构成。21.权利要求20的方法，其中所述集合包含至少100个个体。22.权利要求20的方法，其中所述集合包含约1000个个体。23.权利要求20的方法，其中所述集合由健康对照个体构成。24.权利要求20的方法，其中所述集合由具有一种或多种具体的疾病状态的个体构成。25.权利要求20的方法，其中所述个体集合是与所述患者大致年龄匹配的。26.权利要求20的方法，其中所述个体集合是与所述患者性别匹配的。
技术总结
本公开内容一般涉及用于比较患者的免疫组库多样性与一组个体共有的免疫组库从而鉴定所述患者的免疫组库多样性相对于所述一组个体共有的免疫组库是正常还是异常的方法。个体共有的免疫组库是正常还是异常的方法。
