一种培育栽培烟草单倍体诱导系的方法与流程
1.本发明涉及一种培育栽培烟草单倍体诱导系的方法，属于植物基因工程领域。
背景技术：
2.烟草是我国重要的经济作物之一，随着经济的发展及环境的变化，烟农对培育高品质、安全性好、抗逆性强的烟草品种有了更迫切的需求，栽培烟草的常规杂交选育至少要经历6代以上的筛选和稳定过程，存在育种周期长，且工作量巨大的问题。以单倍体诱导系杂交诱导为基础的单倍体育种方法仅需两个世代即可迅速获得纯系，极大地缩短了育种进程，是重要的现代育种技术之一。
3.野生烟草n.africana具有诱导烟草产生单倍体的功能，但存在诱导率低，易形成混倍体、易携带野生烟草不良气息、远缘杂交不亲和等问题，急需获得新的栽培烟草来源的单倍体诱导系。目前，在玉米、拟南芥等植物中相继报道了单倍体诱导基因或诱导系，栽培烟草为异源四倍体，基因家族内通常存在基因功能冗余现象，很多性状都是由两个以上基因共同发挥作用，这为功能基因的研究和利用带来诸多困难。目前，对于栽培烟草来源的单倍体诱导系和诱导相关基因尚未见报道。
技术实现要素：
4.基于上述，本发明提供一种培育栽培烟草单倍体诱导系的方法，可以短时间内获得纯系烟草，加快烟草新品种选育进程，以克服现有技术的不足。
5.本发明的技术方案是：一种培育栽培烟草单倍体诱导系的方法，包括：
6.用基因编辑系统编辑目的栽培烟草，获得ntdmp1基因、ntdmp2基因和ntdmp3基因同时编辑失活的纯合株系即为栽培烟草单倍体诱导系；
7.所述ntdmp1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述ntdmp2基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述ntdmp3基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
8.可选的，所述基因编辑系统中含有sgrna序列，所述sgrna在目的栽培烟草中识别的靶标dna为编码ntdmp1蛋白的dna片段、编码ntdmp2蛋白的dna片段和编码ntdmp3蛋白的dna片段。
9.可选的，所述sgrna识别的靶位点的核苷酸序列如seq id no.4所示。
10.可选的，所述用基因编辑系统编辑目的栽培烟草的方法包括：
11.1)将所述sgrna连接到载体上得到重组crispr/cas9载体；
12.2)将所述重组crispr/cas9载体转入到栽培烟草k326中。
13.本发明还提供一种培育栽培烟草单倍体的方法，为将所述方法培育的栽培烟草单倍体诱导系作为父本，目的栽培烟草作为母本进行杂交，获得栽培烟草单倍体。
14.本发明的有益效果是：
15.1、通过分析ntdmp1，ntdmp2和ntdmp3序列，设计同时靶向ntdmp1，ntdmp2和ntdmp3三个基因的sgrna，构建编辑失活载体，对栽培烟草进行遗传转化，获得ntdmp1，ntdmp2和
ntdmp3三基因同时编辑失活的纯合株系。该株系具有诱导栽培烟草产生单倍体的功能，在烟草育种中具有重要应用价值。
16.2、通过培育烟草单倍体诱导系可以短时间内获得纯系烟草，加快烟草新品种选育进程，有效解决了目前栽培烟草的常规选育存在的育种周期长，且工作量巨大的问题。
17.3、通过对烟草单倍体诱导相关基因进行鉴定，获得了栽培烟草中具有单倍体诱导功能的基因，对解析栽培烟草的单倍体诱导遗传机理具有重要的意义。
18.4、本发明证明了16个烟草dmp家族基因中的3个成员同时发生突变可诱导栽培烟草产生单倍体，首次提供了一种创制栽培烟草单倍体诱导系的新方法。
附图说明
19.图1流式细胞法分析杂交后代的倍性；
20.图2杂交后代中单倍体和四倍体的染体数目分析。
具体实施方式
21.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
22.下述实施例选择表1中靶点进行实验，靶点位置、靶点序列依序见表1中第3列和第4列，对应的靶基因见表1中第1列。
23.表1靶标位点的位置和序列
[0024][0025]
ntdmp1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，ntdmp2基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，ntdmp3基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
[0026]
seq id no.1：
[0027]
atggagcaaagtactgagggaattgggatcaaaatttacagtgcatcaaaacgtgccgatacatcaatgtaccctactaatttaccaccagacaacgatgttccgatccccgaattgcctcaaccagcaattggtggcaagaaaagacgagcaatggcaaatggggttcaaaaaacactctcaaaaacttcattgcttgtcaatttcttgccaacaggcacacttttaacttttgaaatggtccttccatcagtctatggcaaaggcgattgttcccctgtcactacactaatgattttaacactacttggcctttgtactttgtcttgcttcttcttccattttaccgatagttttcggggacccgacgggaaagtttactatggatttgtgacaccaagaggattgaaagttttcaagtccggactaggtgtggatgtgccaaaagatgagaggtaatatgtgtgatcaaacatatatgacagacagatcgcctctcacaattttgtgatagtttttatgacgaaattcatccatgtggattgatacttttgacggaatatatatcaccagaccgatcgtctgtcacaattttgtgacattttttatgttcatccatttggattgatattttttgacggaataaatatgacaaacagatcgtctgttacaattttgtgacatt
tatgatggaattcatccatgtggattgatagttttgacggaatatacatgacggacagatcgtctgtcacaattttgtgacaatttttatgtcagaattcatccatgtggattgatatatgtgaagattttattcttttgtcacaagcattatttttcttgtagtacgttgatttcacacttcaaagccgttatttcatgttttaatttattgtttactttttctaataggtacgtagtgggatttacggatttcgtgcatgcgatgatgtctgttttggtatttgtggcgattgctttttcggatcatagagtgacgctttgtctattccctggacatgcaaaagaacttgatgaaattatgaggagttttcctttaatggtgggagttatttgcagtggactttttcttgtttttcccaatactagatatggtattggatgtatgtctgcttaa
[0028]
seq id no.2：
[0029]
atggagcaaagtactgagggaattgggatcaaaatctacagtgcatcaaaacgtgcagatacaacaatataccctactaatttaccaccagataacgatgttccgatccctgaattgcctcaaccagcaattggtggcaaaaaaagaagagcaatggctaatggggttcaaaaaactctctcaaaaacttcattgcttgtcaattttctaccaacaggcacacttctaacttttgaaatggtccttccatcagtctatggcaaaggcgattgttcaccggtcactacattaatgattttaacactacttggcctttgtactttgtcttgcttcttcttccattttaccgatagttttcgtggacccgatgggaaagtttactatggatttgtgacaccaagagggttgaaagttttcaagtctggactaggtgtggatgtgccaaaagatgagaggtaatatttgtgacggaatagatatgatagacagatcgtctgtcacagttttgtaacagttttatggcagaattcatccatgtgggttgatatttgtgacgattttattctttcgtcacgaacattatttttcttgtagtaagttgattttacacttcaaagccgttatttcatgttttaatctattgtttactttttctaacaggtacgtcgtgggatttacggatttcgtacatgcaatgatgtctgttttggtatttgtggcgattgcattttcggatcatagagtgacgctttgtctattccctggacatgcaaaagaacttgatgaaattatgaggagttttcctttaatggtgggagttatttgcagtggactttttcttgttttccccaatactagatatggtattggatgtatgtctgcttaa
[0030]
seq id no.3：
[0031]
atggagcaaagtactgagggaattgggatcaaaatctacagtgcatcaaaacgtgcagatacatcaatataccctactaatttaccaccagataacgatgttccgatccctgaattgcctcaaccagcaattggtggcaaaaaaagaagagcaatggcaaatgggattcaaaaaactctctcaaaaacttcattgcttgtcaattttctaccaacaggcacacttctaacttttgaaatggtccttccatcagtctatggcaaaggcgattgttcacccgtcactacattaatgattttaacactacttggcctttgtactttgtcttgcttcttcttccattttaccgatagttttcgtggacccgatgggaaagtttactatggatttgtgacaccaagagggttgaaagttttcaagtctggactaggtgtggatgtgccaaaagataagaggtaatatttgtgacggaatagatatgatagacagatcgcctgtcacagttttgtaatagttttatggntatatactgacaaatcgtctgtcacaatatgtgacagtttttatgacggaattcatccatgtggattgatatttgtgacgattttattctttcgtcacgagcattatttttcttgtagtaagttgttttacacttcaaagccgttatttcatgttttaatctattatttactttttctaacaggtacgtcgtgggatttaccgatttcgtacatgcaatgatgtctgttttggtatttgtggcgattgcattttcggatcatagagtgacgctttgtctattccctggacatgcaaaagaacttgatgaaattatgaggagttttcctttaatggtgggagttatttgcagtggactttttcttgtttttcccaatactagatatggtattggatgtatgtctgcttaacdsatggagcaaagtactgagggaattgggatcaaaatctacagtgcatcaaaacgtgcagatacaacaatataccctactaatttaccaccagataacgatgttccgatccctgaattgcctcaaccagcaattggtggcaaaaaaagaagagcaatggctaatggggttcaaaaaactctctcaaaaacttcattgcttgtcaattttctaccaacaggcacacttctaacttttgaaatggtccttccatcagtctatggcaaaggcgattgttcaccggtcactacattaatgattttaacactacttggcctttgtactttgtcttgcttcttcttccattttaccgatagttttcgtggacccgatgggaaagtttactatggatttgtgacaccaagagggttgaaagttttcaagtctggactaggtgtggatgtgccaaaagatgagaggtacgtcgtgggatttacggatttcgtacatgcaatgatgtctgttttggtatttgtggcgattg
cattttcggatcatagagtgacgctttgtctattccctggacatgcaaaagaacttgatgaaattatgaggagttttcctttaatggtgggagttatttgcagtggactttttcttgttttccccaatactagatatggtattggatgtatgtctgcttaa
[0032]
实施例1：栽培烟草单倍体诱导系的获得
[0033]
1、设计sgrna
[0034]
根据靶位点设计sgrna序列，如seq id no.4所示：
[0035]
seq id no.4：ccttccatcagtctatggcaaag
[0036]
2、重组crispr/cas9载体构建
[0037]
将sgrna通过gateway的方法连接到载体上得到重组载体crispr/cas9。具体方法如下：
[0038]
(1)合成如下1对引物
[0039]
dmp(+):cagtggtctcaagtgctttgccatagactgatgga，如seq id no.5所示。
[0040]
dmp(-):cagtggtctcaaaactccatcagtctatggcaaag，如seq id no.6所示。
[0041]
(2)pcr体系
[0042]
按照以下pcr反应体系进行加样：
[0043]
成分体积nuclease-free water20μlbiorun pfu pcr mix25μlprimer(+)(100μm)2μlprimer(-)(100μm)2μltemplate1μltotal volum50μl
[0044]
pcr程序如下：
[0045]
步骤循环数94℃for 5min194℃for 30sec3050℃for 45sec3072℃for 54sec3072℃for 10min116℃for 30min1
[0046]
用1％琼脂糖凝胶电泳，5v/cm电压，20分钟，将dmp(893bp)的电泳片段在紫外灯下切取出来，放在一个体系中进行溶胶回收，用总体积30ul的水溶解回收dna(回收产物标记为：rdnad1)，检测无误后与载体进行连接。
[0047]
(3)酶切连接
[0048]
酶切连接体系
[0049]
成分体积nuclease-free water8μl10
×
buffer2μl
bsai/eco31i1μlt4_ligase1μlphsbdcas9i4μlrdnad14μltotal20μl
[0050]
酶切连接反应条件
[0051]
步骤循环数37℃for 20min137℃for 10min520℃for 10min537℃for 20min180℃for 5min1
[0052]
(4)转化
[0053]
将5-10ul连接产物转化大肠杆菌感受态，涂卡那霉素抗性平皿，37℃培养12小时，进行菌斑pcr鉴定。
[0054]
(5)菌斑pcr鉴定
[0055]
挑取10个菌斑同时进行1.5mlep管接菌和pcr鉴定，引物：phsbdcas9i鉴定引物pbw-f：ccagaaattgaacgccgaag，pbw-r：gtaaaacgacggccagt，分别如seq id no.7和seq id no.8所示。pcr反应体系和反应程序同(2)。目标条带为1667bp左右的片段。选1-3个阳性条带对应的菌液，取100ul送样测序，其余400ul菌液接种到含有5-10ml卡那霉素抗性lb中，试管摇菌，待测序结果出来后，对应测序正确的取一管提取质粒。
[0056]
3、转基因植株的获得
[0057]
将步骤2获得的重组crispr/cas9载体通过热激转至农杆菌感受态gv3101，通过pcr验证获得阳性克隆。通过烟草遗传转化实验将重组crispr/cas9载体转入栽培烟草k326中，在抗性培养基上长出的抗性芽转移到生根培养基中，待根长出后，将培养瓶置于阳光充足处，加入少量的水炼苗2d；炼苗后将小苗取出，洗去根部培养基，转移至烟草育苗基质中，放入人工气候室进行培养。
[0058]
4、ntdmp1/ntdmp2/ntdmp3基因突变的转基因植株鉴定
[0059]
采集步骤3阳性苗的叶片，提取基因组dna作为pcr反映模板采用dmp1-f、dmp1-r、dmp2-f、dmp2-r、dmp3-f和dmp3-r引物进行扩增，测序鉴定突变情况。
[0060]
dmp1-f:tcaaaacgtgccgatacatcaatg，如seq id no.9所示。
[0061]
dmp1-r:cgatctgtctgtcatatatgtttga，如seq id no.10所示。
[0062]
dmp2-f:tcaaaacgtgcagatacaacaata，如seq id no.11所示。
[0063]
dmp2-r:acccacatggatgaattctgc，如seq id no.12所示。
[0064]
dmp3-f:ctacagtgcatcaaaacgtgca，如seq id no.13所示。
[0065]
dmp3-r:cgatctgtctatcatatctattccg，如seq id no.14所示。
[0066]
关于基因突变情况的鉴别方式为：
[0067]
自靶位点序列起具有双峰特征的序列，则该株系的基因型为杂合基因型(2条同源染体中的1条染体上ntdmp1和/或ntdmp2和/或ntdmp3基因突变，且另一条染体上的
ntdmp1和/或ntdmp2和/或ntdmp3未突变或者突变形式不同)，则该株系为烟草杂合突变型株系。
[0068]
自靶位点序列起具有特异单峰特征的序列，若该序列与栽培烟草序列相同，则该株系为野生型基因型，即ntdmp1/ntdmp2/ntdmp3基因未发生突变。若该序列与普通栽培烟草序列不同，则该株系的基因型为纯合突变基因型(两条同源染体上ntdmp1和ntdmp2和ntdmp3基因均发生突变)，则该株系为烟草纯合突变型株系。
[0069]
表2栽培烟草突变体鉴定结果
[0070][0071]
选取栽培烟草纯合突变体d3作为父本，常规栽培烟草作为母本杂交，获得单倍体材料。
[0072]
实施例2：烟草单倍体诱导能力分析。
[0073]
将实施例1中获得的栽培烟草突变株系d3作为父本，常规栽培烟草k326或f1(云烟87/k326)作为母本进行杂交收种，播种杂交后代，通过以下方法检测杂交后代中的单倍体。
[0074]
1、流式细胞倍性分析法检测叶片倍性
[0075]
采集所有后代植株叶片进行流式细胞倍性分析实验，具体方法如下：
[0076]
提取待测植株幼嫩叶片的细胞核，以二倍体栽培烟草叶片作为对照；再用流式细胞仪器检测信号，首先检测二倍体细胞核信号，并将二倍体细胞核信号峰位设为50(由于二倍体细胞内的遗传物质是单倍体细胞内遗传物质的两倍，因此，单倍体细胞核信号峰位在25附近出现)。若待测植株细胞核信号峰出现在200附近，则认为该待测植株为单倍体植株。若待测植株的信号峰出现在400附近，则认为其与二倍体细胞核信号强度富集位置相同，该待测植株为二倍体(图1)。
[0077]
2、染体制片法鉴定染体数目
[0078]
采集上述步骤1检测出的候选单倍体植株嫩叶制作染体片，具体方法如下：取栽培烟草生长点周围幼嫩叶片，浸没于0.002mol/l的8-羟基喹啉中，在4℃条件下预处理24小时，预处理后用卡诺固定液固定过夜，蒸馏水冲洗2～3次后，放入混合酶液(3％纤维素酶+1％离析酶)中于37℃下孵育0.5～1h。蒸馏水清洗后除去酶液，加入卡诺氏固定液，并以涂片法进行制片，火焰干燥，5％吉姆萨染。经镜检观察染体数目。染体数目为24条的即为单倍体，染体数目为48条的即为二倍体栽培烟草，如图2。
[0079]
统计上述鉴定结果并按照如下公式计算诱导率：诱导率(％)＝(单倍体株数/总株
数)
×
100。可以看出ntdmp1/ntdmp2/ntdmp3基因同时突变后，在杂交后代中可以获得单倍体，诱导率在2.5％左右。可见本发明获得的ntdmp1，ntdmp2和ntdmp3三基因同时编辑失活的纯合株系，具有诱导栽培烟草在短时间内产生单倍体的功能，可加快烟草新品种选育进程，有效解决了目前栽培烟草常规育中存在的育种周期长，且工作量巨大的问题。
[0080]
表3诱导率统计结果
[0081][0082]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
技术特征：
1.一种培育栽培烟草单倍体诱导系的方法，其特征在于，包括：用基因编辑系统编辑目的栽培烟草，获得ntdmp1基因、ntdmp2基因和ntdmp3基因同时编辑失活的纯合株系即为栽培烟草单倍体诱导系；所述ntdmp1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述ntdmp2基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述ntdmp3基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。2.根据权利要求1所述的培育栽培烟草单倍体诱导系的方法，其特征在于，所述基因编辑系统中含有sgrna序列，所述sgrna在目的栽培烟草中识别的靶标dna为编码ntdmp1蛋白的dna片段、编码ntdmp2蛋白的dna片段和编码ntdmp3蛋白的dna片段。3.根据权利要求2所述的培育栽培烟草单倍体诱导系的方法，其特征在于，所述sgrna识别的靶位点的核苷酸序列如seq id no.4所示。4.根据权利要求1所述的培育栽培烟草单倍体诱导系的方法，其特征在于，所述用基因编辑系统编辑目的栽培烟草的方法包括：1)将所述sgrna连接到载体上得到重组crispr/cas9载体；2)将所述重组crispr/cas9载体转入到栽培烟草中。5.一种培育栽培烟草单倍体的方法，为将权利要求1至4任一所述方法培育的栽培烟草单倍体诱导系作为父本，目的栽培烟草作为母本进行杂交，获得栽培烟草单倍体。
技术总结
本发明公开了一种培育栽培烟草单倍体诱导系的方法，包括：用基因编辑系统编辑目的栽培烟草，获得tDMP1基因、tDMP2基因和tDMP3基因同时编辑失活的纯合株系即为栽培烟草单倍体诱导系；所述tDMP1基因的核苷酸序列如SEQ ID O.1所示，所述tDMP2基因的核苷酸序列如SEQ ID O.2所示，所述tDMP3基因的核苷酸序列如SEQ ID O.3所示。本发明通过培育烟草单倍体诱导系可以短时间内获得纯系烟草，加快烟草新品种选育进程，有效解决目前栽培烟草常规育中存在的育种周期长，且工作量巨大的问题。题。题。
