一种包埋植物乳杆菌乳剂及其制备方法和应用
1.本发明涉及一种包埋植物乳杆菌乳剂及其制备方法和应用，属于微生物技术领域。
背景技术：
2.益生菌是有益的活性微生物，可以通过调节宿主的肠道菌来保护胃肠道健康，预防/癌症，从而影响代谢和免疫。益生菌要对健康产生有益作用，存活细胞在通过胃肠道到达结肠前必须至少达到107cfu/ml。然而，益生菌在食品中的应用存在一些挑战，包括在加工和长时间储存期间的生存能力，以及在酸性条件和消化液中的生存能力。因此必须通过一些方法提高益生菌在不良环境中的存活率。
3.对益生菌进行包埋可以提高益生菌的稳定性，适宜的包埋壁材可以在不良环境中维持益生菌的稳定、调控益生菌释放的位置和释放的速度。乳化法因其易于设计和制备被广泛用于封装生物活性物质。迄今为止，报道的含有生物活性物质的乳剂主要是通过合成表面活性剂生产的。然而，合成表面活性剂具有轻微毒性，以天然聚合物(蛋白质、多糖)制备乳剂具有重要意义。许多食品蛋白(大豆蛋白、乳清蛋白、酪蛋白)被用作乳化剂，但只有蛋白质稳定乳化剂对温度、ph值和盐等环境因素敏感，易发生聚结、絮凝和奥氏熟化。故亟需一种更好保留益生菌的活性，改善包封效果的一种包埋植物乳杆菌乳剂及其制备方法和应用。
技术实现要素：
4.本发明的目的是为了提供一种包埋植物乳杆菌乳剂的制备方法，该法可以更好保留益生菌的活性，改善包封效果，能够在4℃下稳定贮存，有优异的抗热和抗胃消化能力。
5.同时，本发明提供一种包埋植物乳杆菌乳剂，该乳剂稳定性好，活菌数高。
6.同时，本发明提供一种包埋植物乳杆菌乳剂在食品中的应用，该食品用于调节宿主的肠道菌、保护胃肠道健康。
7.同时，本发明提供一种包含包埋植物乳杆菌乳剂的食品。
8.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
9.一种包埋植物乳杆菌乳剂的制备方法包括以下步骤：
10.步骤一，将质量比为2：1的酪蛋白粉末与豌豆分离蛋白粉末混合均匀后分散于100ml pbs中，酪蛋白粉末的浓度为20-60g/l，在40-60℃以400-700r/min的速度搅拌2-5h，然后放入冰箱水合8-16h，获得混合蛋白溶液；
11.步骤二，将0.4-2g结冷胶粉末分散于100ml去离子水中，在40-50℃以400-700r/min的速度搅拌0.5-3h，获得结冷胶溶液；
12.步骤三，将混合蛋白溶液与结冷胶溶液以1：1的体积比混合，在40-60℃以700-900r/min的速度搅拌2-4h，获得混合蛋白-结冷胶复合物溶液；
13.步骤四，棕榈油融化备用，将植物乳杆菌菌粉以1:40、1:20、1：10、1：5、或1：2的比
例放入棕榈油中，以300-800r/min的速度搅拌至均匀分散，获得油相；
14.步骤五，将油相与混合蛋白-结冷胶复合物溶液以1：4的体积比混合，获得混合液；
15.步骤六，将混合液以8000-16000rpm乳化2-6min，获得混合蛋白-结冷胶乳液。
16.植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)的保藏编号为cicc6002。
17.pbs为0.01m，ph为7.0-7.2；冰箱的温度为4℃。
18.去离子水的ph为6.8-7.2。
19.棕榈油的融化温度为40-60℃。
20.混合蛋白-结冷胶复合物溶液中，酪蛋白、豌豆分离蛋白和结冷胶的浓度分别为20g/l，10g/l和8g/l。
21.本发明的制备方法获得的包埋植物乳杆菌乳剂。
22.包埋植物乳杆菌乳剂在食品中的应用。
23.食品用于调节宿主的肠道菌、保护胃肠道健康。
24.包含本发明的包埋植物乳杆菌乳剂的食品。
25.本发明具有以下有益效果：
26.本发明公开了一种包埋植物乳杆菌乳剂及其制备方法和应用，将酪蛋白(动物蛋白)与豌豆分离蛋白(植物蛋白)干混，制备混合蛋白溶液；利用蛋白与多糖间的静电相互作用，制备混合蛋白-结冷胶复合物；将植物乳杆菌菌粉分散于棕榈油中；将含有菌粉的油相与含有混合蛋白-结冷胶复合物的溶液，利用高剪切均质机乳化。本发明制备的复合乳剂具有良好的包封效果，能够在4℃下稳定贮存，有优异的抗热和抗胃消化能力。
27.本发明中的多糖可以提高蛋白质乳剂在储存和模拟胃肠道条件下的稳定性，以及所含物质的生物利用度。结冷胶能够抵抗酸性环境，还具有耐受热应力，不易被酶水解等特点。
附图说明
28.图1为本发明混合蛋白-结冷胶乳液在4℃贮存21天后的外观形态图；
29.图2为本发明混合蛋白-结冷胶乳液在4℃和25℃贮存21天后的外观形态图；
30.图3为植物乳杆菌包埋乳剂的冷冻扫描电子显微镜图。
具体实施方式
31.下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
32.将活化的植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)接种至1l mrs培养基中，37℃静置培养12h。6000rpm离心10min收集菌泥，将菌泥用14％的脱脂乳粉反复冲洗三次并重悬至100ml脱脂乳粉中，重悬后的样品冷冻干燥24h得到植物乳杆菌菌粉；该植物乳杆菌的拉丁文名称为lactobacillus plantarum，保藏单位为中国工业微生物菌种保藏管理中心(简称cicc)，保藏编号为cicc6002，发明人通过菌种保藏中心购买得到。
33.本发明包括如表1中的以下试剂：
34.表1试剂
[0035][0036][0037]
实施例1
[0038]
将酪蛋白(动物蛋白)和豌豆分离蛋白(植物蛋白)分别以质量比1：1，2：1，5：1混合后溶解在pbs(0.01m，ph7.0)中，以500r/min的速度在45℃下搅拌3h，然后放入4℃冰箱水合12h，制备混合蛋白(3％，w/v)储备液。将0.5g菌粉加入20ml 50℃融化后的棕榈油中，以800r/min的速度搅拌至均匀分散。将20ml油相(含有菌粉的棕榈油)与80ml混合蛋白溶液使用高剪切均质机12000rpm乳化4min。
[0039]
对比例1
[0040]
将酪蛋白或豌豆分离蛋白溶解在pbs(0.01m，ph 7.0)中，以500r/min的速度在45℃下搅拌3h，然后放入4℃冰箱水合12h，制备酪蛋白(3％，w/v)储备液。将0.5g菌粉加入20ml 50℃融化后的棕榈油中，以800r/min的速度搅拌至均匀分散。将20ml油相(含有菌粉的棕榈油)与80ml混合蛋白溶液使用高剪切均质机12000rpm乳化4min。
[0041]
1.植物乳杆菌包埋乳剂的粒径和电位测定
[0042]
在25℃下用malvern 3000激光粒度仪测量液滴的尺寸；用nano zs90粒度和电位分析仪对液滴的ζ-电位进行了表征。测量前，样品在去离子水中按1：100的比例稀释，以避免多重散射效应。
[0043]
表2的结果表明与单独的酪蛋白(动物蛋白)或豌豆分离蛋白(植物蛋白)相比，酪蛋白与豌豆分离蛋白2：1复配后制备的乳液粒径较小，电位绝对值增大。选择酪蛋白与豌豆分离蛋白质量比2：1进行后续试验。
[0044]
表2植物乳杆菌包埋乳剂的粒径和电位
[0045][0046]
[0047]
注：不同字母表示组间差异显著(p＜0.05)。
[0048]
实施例2
[0049]
将酪蛋白(动物蛋白)和豌豆分离蛋白(植物蛋白)混合后溶解在pbs(0.01m，ph 7.0)中，以500r/min的速度在45℃下搅拌3h，然后放入4℃冰箱水合12h，制备混合蛋白(6％，w/v)储备液；将结冷胶粉末溶解在去离子水中，以500r/min的速度在45℃下搅拌1h，制备结冷胶(0.4-2％，w/v，分别为0.4％、0.8％、1.2％、1.6％、和2％)储备液，同时制备不含结冷胶的储备液；将50ml混合蛋白溶液与50ml结冷胶溶液在50℃，以800r/min的速度搅拌2h，制得混合蛋白-结冷胶复合物溶液。
[0050]
将0.5g菌粉加入20ml 50℃融化后的棕榈油中，以800r/min的速度搅拌至均匀分散。将20ml油相(含有菌粉的棕榈油)与80ml水相(混合蛋白-结冷胶复合物溶液)使用高剪切均质机12000rpm乳化4min。
[0051]
1.植物乳杆菌包埋乳剂的粒径和电位测定
[0052]
在25℃下用malvern 3000激光粒度仪测量液滴的尺寸；用nano zs90粒度和电位分析仪对液滴的ζ-电位进行了表征。测量前，样品在去离子水中按1:100的比例稀释，以避免多重散射效应。
[0053]
表3显示了结冷胶浓度对乳液的粒径和ζ-电位的影响。随着结冷胶浓度的增加，乳液的粒径呈现先增加后减小的趋势，当结冷胶浓度高于0.8％时，乳液粒径继续增大。结冷胶浓度过低时，不足以稳定乳液，多个油滴相互接触形成更大的油滴致使乳液粒径增大。乳化剂(混合蛋白-结冷胶复合物)过量时吸附在油水界面，使得粒径再次增大。当结冷胶浓度为0.8％时，乳液的粒径最小。
[0054]
结冷胶的浓度对乳液ζ-电位有明显的影响，ζ-电位绝对值就越大，乳液越稳定。与单独蛋白乳液相比，混合蛋白-结冷胶复合物作为乳化剂的乳液ζ-电位绝对值明显增加(p《0.05)。由混合蛋白和高浓度结冷胶形成的复合物作为乳化剂制备的乳液颗粒之间空间斥力增大，提高了乳液的稳定性。当结冷胶浓度高于0.8％时，乳液电位绝对值减小，乳液趋于不稳定。
[0055]
表3植物乳杆菌包埋乳剂的粒径和电位
[0056]
结冷胶浓度(％)粒径(μm)电位(mv)013.86
±
0.16
f-22.54
±
0.31f0.219.62
±
0.23
b-24.92
±
0.12e0.423.2
±
0.26
a-26.53
±
0.27d0.618.75
±
0.19
c-27.18
±
0.23c0.812.89
±
0.25
e-30.86
±
0.13a116.5
±
0.17
d-28.25
±
0.25b[0057]
注：不同字母表示组间差异显著(p＜0.05)。
[0058]
2.植物乳杆菌包埋乳剂的物理稳定性
[0059]
将新配制的乳液(结冷胶浓度依次为0、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％和1％)装入20ml密闭玻璃瓶中，置于4℃贮存21天。
[0060]
在4℃条件下贮存21天后，样品的分层程度与结冷胶的浓度密切相关，如图1所示，结冷胶浓度为0.8％和1％时，乳液的分层程度无显著性差异，但结冷胶浓度为1％时，乳液
颜偏黄且有较多孔隙。
[0061]
如图2所示，为结冷胶浓度(0、0.2％、0.4％、0.6％和0.8％)对乳液贮存(4℃和25℃)稳定性的影响图。
[0062]
3.植物乳杆菌包埋乳剂的包埋率
[0063]
在乳液中加入1％w/v的20并涡旋振荡30分钟，然后用稀释涂布平板法测定植物杆菌的活力，即用无菌生理盐水连续稀释样品至适当浓度，将其涂布于mrs固体培养基上，37℃孵育48h。
[0064]
包埋率(％)＝样品中生物量/总的生物量
[0065]
如表4所示，用混合蛋白-结冷胶复合物制备的乳液包埋率明显高于单用混合蛋白的包埋率(p《0.05)。结果表明，用蛋白质-多糖复合物制备的乳液能显著提高植物乳杆菌的包埋率，并随着结冷胶浓度的增加而逐渐增加，但当结冷胶过量时，包埋率呈现降低趋势。当结冷胶浓度为0.8％时，乳液中植物乳杆菌的包埋率最高(88.67％)，与单独使用混合蛋白制备的乳液相比，封装效率明显提高20.32％，故选择结冷胶浓度0.8％进行后续试验。
[0066]
表4不同结冷胶浓度植物乳杆菌包埋乳剂的包埋率
[0067]
多糖浓度(％)包埋率(％)068.35
±
0.13f0.272.06
±
0.15e0.476.53
±
0.27d0.684.89
±
0.19c0.888.67
±
0.22a1.086.43
±
0.26b[0068]
注：不同字母表示组间差异显著(p＜0.05)。
[0069]
4.植物乳杆菌包埋乳剂的贮存稳定性
[0070]
将植物乳杆菌包埋乳剂在4℃下储存21天，分别在0、7、14，21天对存活的细胞进行计数。
[0071]
如表5所示，游离植物杆菌、混合蛋白乳液和混合蛋白-0.8％结冷胶乳液的初始活力分别为9.44、9.32和9.36lg cfu/ml。7天、14天和21天后，游离组的存活细胞明显低于混合蛋白和混合蛋白-0.8％结冷胶乳液(p《0.05)。混合蛋白-0.8％结冷胶乳液在4℃保存21天后，存活细胞数(8.96
±
0.03lg cfu/ml)明显高于蛋白乳液(8.73
±
0.03lg cfu/ml)，仅减少0.4lg cfu/ml。这些结果表明，混合蛋白乳液或混合蛋白-0.8％结冷胶乳液可以明显改善植物乳杆菌的贮存稳定性，其中混合蛋白-0.8％结冷胶乳液的效果最好。
[0072]
表5植物乳杆菌包埋乳剂的贮存稳定性
[0073]
[0074][0075]
注：不同字母表示组间差异显著(p＜0.05)。
[0076]
5.植物乳杆菌包埋乳剂耐热性
[0077]
将植物乳杆菌包埋样品分别在63℃下加热30分钟，72℃下加热2分钟以模拟巴氏杀菌，然后立即在室温水浴中冷却，测定活细胞数。
[0078]
如表6所示，在63℃处理30分钟后，游离植物乳杆菌样品的存活率低于2lg cfu/ml，混合蛋白乳液(4.58lg cfu/ml)和混合蛋白-0.8％结冷胶乳液(6.47lg cfu/ml)在巴氏灭菌后明显加强了植物杆菌的活性(p《0.05)。与长时间灭菌(63℃加热30分钟)相比，75℃加热2分钟对植物杆菌的活性影响较小。在75℃加热2分钟后，混合蛋白乳液和混合蛋白-0.8％结冷胶乳液中植物乳杆菌的活力分别下降了3.17和2.13lg cfu/ml。在热处理过程中，结冷胶的加入改善了乳液对植物乳杆菌的保护效果，这可能是由于结冷胶具有抵抗热应力的能力，而且蛋白与结冷胶形成了如图3所示的紧密的网状结构，可以更好地保护内部菌种。图3为植物乳杆菌包埋乳剂的冷冻扫描电子显微镜图片，混合蛋白-0.8％结冷胶乳液的微观结构由场发射扫描电子显微镜(su8010，日立有限公司，日本)记录。乳液液滴被放置在支架上的低温扫描电子显微镜管中，并在氮气中冷冻。将样品转移到低温转移系统中，在-100℃下进行10分钟的升华。铂金溅射涂层后，将涂层样品插入配备有sem平台冷模块的观察室，保持在-140℃下观察。
[0079]
结果：图3a和3b是混合蛋白-0.8％结冷胶乳液的低温冷冻扫描图像，可以看出其形状为球形，粒径范围为10-20μm。图3c和3d是混合蛋白-0.8％结冷胶乳液的低温冷冻图像，可以看出油滴被包裹在一个网络结构中，这可能是由于混合蛋白与结冷胶分子间通过静电作用形成的酪蛋白-结冷胶复合物，能够稳定棕榈油界面，使油滴嵌入致密的聚合物网络中。
[0080]
表6植物乳杆菌包埋乳剂的耐热性
[0081][0082]
6.植物乳杆菌包埋乳剂模拟胃肠道消化
[0083]
在37℃条件下，将样品置于模拟胃液中孵育2h，然后置于模拟肠液中孵育4h，评估样品中植物乳杆菌的活力。
[0084]
表7列出了模拟胃肠液消化过程中的游离和包封的植物乳杆菌的生存能力。在模拟胃肠液中培养的2小时，由于氢离子和胃蛋白酶的作用，游离和封装的植物乳杆菌的存活率持续下降。游离植物乳杆菌的活力从9.44lg cfu/ml下降到4.29lg cfu/ml，混合蛋白乳液中植物乳杆菌的活力从9.32lg cfu/ml下降到6.14lg cfu/ml，混合蛋白-0.8％结冷胶乳液从9.32lg cfu/ml下降到7.18lg cfu/ml。混合蛋白-0.8％结冷胶乳液中活细胞的损失明显低于蛋白乳液(p《0.05)，这主要是由于结冷胶在乳液体系中的保护作用，它有效地减少了蛋白质层的水解和乳液液滴的破裂。
[0085]
当样品在模拟肠液中进一步消化4小时后，游离植物乳杆菌的活细胞数低于检测限；对于混合蛋白乳液和混合蛋白-0.8％结冷胶乳液，其包封的植物乳杆菌活力仅略有下降。结果表明，封装在混合蛋白-0.8％结冷胶乳液中的植物乳杆菌对模拟肠液的耐受性要高于混合蛋白乳液。
[0086]
表7植物乳杆菌包埋乳剂模拟胃肠道消化
[0087][0088][0089]
注：不同字母表示组间差异显著(p＜0.05)。
[0090]
本实施例获得的包埋植物乳杆菌乳剂在食品中的应用。食品用于调节宿主的肠道菌、保护胃肠道健康。食品包括酸奶、奶饮料、奶片等等，在此不再一一赘述。
[0091]
实施例3
[0092]
将2g酪蛋白(动物蛋白)和1g豌豆分离蛋白(植物蛋白)混合后溶解在100ml pbs(0.01m，ph 7.2)中，酪蛋白粉末的浓度为20g/l，以400r/min的速度在40℃下搅拌2h，然后放入4℃冰箱水合8h，制备混合蛋白(3％，w/v)储备液；将结冷胶粉末溶解在100ml ph为6.8的去离子水中，以400r/min的速度在40℃下搅拌0.5h，制备结冷胶0.4％w/v储备液，将50ml混合蛋白溶液与50ml结冷胶溶液在40℃，以700r/min的速度搅拌3h，制得混合蛋白-结冷胶复合物溶液。
[0093]
将0.5g菌粉加入10ml 40℃融化后的棕榈油中，以300r/min的速度搅拌至均匀分散。将10ml油相(含有菌粉的棕榈油)与40ml水相(混合蛋白-结冷胶复合物溶液)使用高剪切均质机8000rpm乳化6min。
[0094]
实施例4
[0095]
将6g酪蛋白(动物蛋白)和3g豌豆分离蛋白(植物蛋白)混合后溶解在100ml pbs(0.01m，ph 7.1)中，酪蛋白粉末的浓度为60g/l，以700r/min的速度在60℃下搅拌5h，然后放入4℃冰箱水合16h，制备混合蛋白(9％，w/v)储备液；将结冷胶粉末溶解在100ml ph为7.2的去离子水中，以700r/min的速度在50℃下搅拌3h，制备结冷胶2％w/v储备液，将50ml混合蛋白溶液与50ml结冷胶溶液在60℃，以900r/min的速度搅拌4h，制得混合蛋白-结冷胶复合物溶液。
[0096]
将0.5g菌粉加入5ml 60℃融化后的棕榈油中，以500r/min的速度搅拌至均匀分散。将5ml油相(含有菌粉的棕榈油)与20ml水相(混合蛋白-结冷胶复合物溶液)使用高剪切均质机16000rpm乳化2min。
[0097]
实施例5
[0098]
本实施例与实施例4的区别仅在于：将1g菌粉加入5ml 45℃融化后的棕榈油中，以400r/min的速度搅拌至均匀分散。将5ml油相(含有菌粉的棕榈油)与20ml水相(混合蛋白-结冷胶复合物溶液)使用高剪切均质机10000rpm乳化3min。
[0099]
实施例6
[0100]
本实施例与实施例4的区别仅在于：将1g菌粉加入2ml 50℃融化后的棕榈油中，以600r/min的速度搅拌至均匀分散。将2ml油相(含有菌粉的棕榈油)与8ml水相(混合蛋白-结冷胶复合物溶液)使用高剪切均质机14000rpm乳化5min。
[0101]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
技术特征：
1.一种包埋植物乳杆菌乳剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，将质量比为2：1的酪蛋白粉末与豌豆分离蛋白粉末混合均匀后分散于100ml pbs中，酪蛋白粉末的浓度为20-60g/l，在40-60℃以400-700r/min的速度搅拌2-5h，然后放入冰箱水合8-16h，获得混合蛋白溶液；步骤二，将0.4-2g结冷胶粉末分散于100ml去离子水中，在40-50℃以400-700r/min的速度搅拌0.5-3h，获得结冷胶溶液；步骤三，将混合蛋白溶液与结冷胶溶液以1：1的体积比混合，在40-60℃以700-900r/min的速度搅拌2-4h，获得混合蛋白-结冷胶复合物溶液；步骤四，棕榈油融化备用，将植物乳杆菌菌粉以1:40、1:20、1：10、1：5、或1：2的比例放入棕榈油中，以300-800r/min的速度搅拌至均匀分散，获得油相；步骤五，将油相与混合蛋白-结冷胶复合物溶液以1：4的体积比混合，获得混合液；步骤六，将混合液以8000-16000rpm乳化2-6min，获得混合蛋白-结冷胶乳液。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）的保藏编号为cicc6002。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，pbs为0.01m，ph为7.0-7.2；冰箱的温度为4℃。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，去离子水的ph 为6.8-7.2。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，棕榈油的融化温度为40-60℃。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，混合蛋白-结冷胶复合物溶液中，酪蛋白、豌豆分离蛋白和结冷胶的浓度分别为20g/l，10g/l和8g/l。7.根据权利要求1~6任意一项所述的制备方法获得的包埋植物乳杆菌乳剂。8.根据权利要求7所述的包埋植物乳杆菌乳剂在食品中的应用。9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，食品用于调节宿主的肠道菌、保护胃肠道健康。10.包含根据权利要求7所述的包埋植物乳杆菌乳剂的食品。
技术总结
本发明公开了一种包埋植物乳杆菌乳剂及其制备方法和应用，制备方法包括：将酪蛋白（动物蛋白）与豌豆分离蛋白（植物蛋白）干混，制备混合蛋白溶液；利用蛋白与多糖间的静电相互作用，制备混合蛋白-结冷胶复合物；将植物乳杆菌菌粉分散于棕榈油中；将含有菌粉的油相与含有混合蛋白-结冷胶复合物的溶液，利用高剪切均质机乳化，获得混合蛋白-结冷胶乳液。本发明制备的乳剂具有良好的包封效果，能够在4℃下稳定贮存，有优异的抗热和抗胃消化能力。有优异的抗热和抗胃消化能力。有优异的抗热和抗胃消化能力。
