一种硒代部花菁类化合物及其应用
cancer therapy.chem.sci.2017, 8,7689-7695；ebaston,t.m.；nakonechny,f.；talalai,e.；gellerman,g.；patsenker,l.,iodinatedxanthene-cyanine nir dyes as potential photosensitizers for antimicrobial photodynamic therapy. dyes and pigments,2021,184,108854；santra,m.；owens,m.；birch,g.；bradley,m., near-infrared-emitting hemicyanines and their photodynamic killing of cancer cells.acs appl.biomater.2021,4,8503-8508；xu,f.；li,h.d.；yao,q.c.；ge,h.y.；fan,j.l.；sun,w.；wang,j.y.； peng,x.j.,hypoxia-activated nir photosensitizer anchoring in the mitochondria forphotodynamic therapy.chem.sci.2019,10,10586-10594)然而，在原有的部花菁结构上添加重 原子无疑增加了合成难度，并且重原子的引入增加了细胞暗毒性以及有限的吸收发射波长严 重阻碍了肿瘤的光疗效果的可行性。此外，在从激发态返回基态的过程中，荧光成像方式和 光疗策略pdt/ptt分别与能量辐射和非辐射过程相关，几乎相互对立，始终具有竞争性， 因此很难在单个发团中同时增强两者，同时，在拓展部花菁染料的成像窗口和提高其 效果的同时避免不可预见的光降解和漂白仍然存在很大挑战。。
技术实现要素：
4.针对现有技术的不足，本发明提供了一种新型硒代部花菁类化合物及其应用。
5.本发明具体技术方案如下：
6.一种硒代部花菁类化合物，具有如下结构：
7.其中r代表-oh，-nh2或n,n-二乙胺基；
8.x-代表阴离子，如cl-、br-、i-、no
3-或pf
4-。
9.本发明进一步公开了一种聚乙二醇修饰的硒代部花菁类化合物，其特征在于具有如下结构：
10.其中r代表-oh，-nh2或n,n-二乙胺基；
11.x-代表阴离子，如cl-、br-、i-、no
3-或pf
4-；n＝3～200的整数。本发明一个具体的示
例，r 代表n,n-二乙胺基，聚乙二醇为peg5000(n＝79)。
12.经聚乙二醇修饰的 本发明所述的硒代部花菁类化合物以及聚乙二醇修饰的硒代部花菁类化合物吸收和发射波长 均位于近红外区域(700-900纳米)。本发明另一目的在于保护上述化合物在制备荧光染料或 肿瘤光疗药物中的应用。进一步的，所述荧光染料为细胞和活体成像荧光探针。
13.本发明另一目的在于提供所述的硒代部花菁类化合物以及聚乙二醇修饰的硒代部花菁类 化合物的合成方法。根据硒酚的强亲核性，选择3-二乙胺基苯硒酚和川菁染料ir780一步反 应得到硒代部花菁类化合物cyse-net2。将cyse-alkynyl和n
3-mpeg-methoxy通过铜(i)催 化的炔烃-叠氮化物点击反应(click reaction)获得聚乙二醇修饰的硒代部花菁类化合物。本发明 合成方法简易，合成条件温和，提纯较为简易。
14.有益效果
15.(1)本发明所述的硒代部花菁类化合物相比较于氧/硫代部花菁染料(yuan,l.；lin,w.y.； zhao,s.；gao,w.s.；chen,b.；he,l.w.；zhu,s.s.,a unique approach to development ofnear-infrared fluorescent sensors for in vivo imaging.j.am.chem.soc.,2012,134, 13510-13523)，吸收波长红移至776nm,发射波长红移至818nm，其单线态氧产率提高 至14.8％，光热转换效率增强至42.2％。该染料靶向细胞线粒体，在光照下产生更多的 活性氧ros物种，以杀伤细胞，并具有明显的光毒性，其半致死浓度ic50值达到0.26 μm，是一种潜在的有效光敏剂。
16.(2)本发明在硒代部花菁类化合物的结构基础上进行了聚乙二醇修饰获得cyse-mpeg
5k
， 并对其进行了研究。结果显示cyse-mpeg
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不仅继承了cyse-net2的光热转换能力， 单线态氧产率为14.8％，光热转换效率为14.2％，更值得注意地是，相较于cyse-net2的较差光稳定性，具有高的光热转换能力和稳定性。cyse-mpeg
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可以有效的在肿瘤区 域富集，实现了光声模式下肿瘤区域的成像造影，为肿瘤临床提供更精确的时空信 息。在生物学、医学中具有广阔的应用前景。
附图说明
17.图1.为不同氧族部花菁类化合物cyx-net2(x＝o,s或se)的归一化吸收光谱(1a)和荧光光谱 (1b)。
18.图2.为cyx-net2的单线态氧产率及光热效应测试图。光照条件下吸收光谱的变化，间隔时 间为5秒。(2a-c)dpbf与cyx-net2在甲醇溶液中激光光照后的光谱变化情况，激发波长为 750nm，照射功率为20mw/cm2；(d)光照吲哚菁绿icg和cyx-net2引起dpbf在410nm 处吸收值变化随时间变化情况。(e)在750nm激光照射下，cyx-net2(50μm)和pbs(ph＝7.4) 的温度变化随时间的变化，当温度到达最大值时，停止光照，红外热成像仪记录温度变化曲 线；(f)cyse-net2的热-冷曲线，共5个循环，激光波长为750nm，光功率密度为500mw/cm2。
19.图3.为cyx-net2的4t1细胞荧光共聚焦成像假图。(a)cyo-net2；(b)cys-net2；(c) cyse-net2共定位成像图。染料cyx-net2通道，670nm激发，680nm-800nm通道收集；线 粒体染料mitotracker green和溶酶体染料lysotracker green通道，488nm激发，492nm-630 nm通道收集；细胞核染料dapi通道，405nm激发,420nm-450nm通道收集。bar值：25μm。
20.图4.为cyx-net2的4t1细胞光疗效果。(a)细胞内ros检测实验，cyx-net2(4μm)孵育
细 胞后经避光或光照处理，dcfh-da(1μm)为细胞内活性氧检测指示剂。绿荧光通道，488 nm激发，500nm-550nm通道收集，bar值：20μm；(b)a图中对应细胞内平均荧光强度柱状 图，n＝3；(c)孵育不同浓度(0-4μm)cyx-net2的4t1细胞经避光或光照处理后在24小时 后的存活率，激光波长为750nm，光功率密度为500mw/cm2；(d)cyx-net2(4μm)与4t1 细胞孵育光照后活死细胞染图，活细胞染剂钙黄绿素(calcein am)，死细胞染剂碘化丙 啶(propidium iodide，pi),绿通道，488nm激发，500nm-550nm通道收集；红通道，543 nm激发,560nm-650nm通道收集。bar值：25μm。
21.图5.为本发明所述聚乙二醇修饰的硒代部花菁类化合物cyse-mpeg
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的光热效应。(a)在 750nm激光照射下，cyse-mpeg
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(50μm)的pbs(ph＝7.4)溶液的温度变化随时间的变化， 当温度到达最大值时，停止光照，红外热成像仪记录温度变化曲线；(b)cyse-mpeg
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的热
‑ꢀ
冷曲线，共5个循环，激光波长为750nm，光功率密度为500mw/cm2；(c)在750nm激光， 500mw/cm2光功率密度照射下，不同浓度(20μm，40μm和60μm)的cyse-mpeg
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红外 温度变化曲线；(d)cyse-mpeg
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浓度为60μm，在不同功率(200mw/cm2，300mw/cm2和 500mw/cm2)下红外温度变化曲线。
22.图6.为本发明所述聚乙二醇修饰的硒代部花菁类化合物cyse-mpeg
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的细胞光疗效果。(a) 孵育不同浓度(0-64μm)cyx-net2和cyse-mpeg
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的4t1细胞经避光处理后在24小时后的 存活率；(b)孵育不同浓度(0-4μm)cyse-mpeg
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的4t1细胞经光照处理后在24小时后的 存活率，激光波长为750nm，光功率密度为500mw/cm2。
23.图7.为本发明所述聚乙二醇修饰的硒代部花菁类化合物cyse-mpeg
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的肿瘤靶向荧光/光声 成像。(a)尾静脉给药，cyse-net2和cyse-mpeg
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(50μm)在荷4t1瘤小鼠中的荧光造影图 像；(b)给药1小时,2小时和3小时后肿瘤组织与正常组织的荧光造影图，激发波长780nm, 收集波段845
±
20nm；(c)a图中肿瘤区域的荧光强度；(d)b图中cyse-net2在各时间段肿瘤 组织与正常组织的荧光强度；(e)b图中cyse-mpeg
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在各时间段肿瘤组织与正常组织的荧光 强度；(f)cyse-net2和cyse-mpeg
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在肿瘤区域每隔1小时的光声造影图像；(g)f图中肿瘤 区域的光声信号pa
780
强度值，标尺：3mm。
24.图8.为本发明所述聚乙二醇修饰的硒代部花菁类化合物cyse-mpeg
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的肿瘤光热成像。(a) pbs+780nm光照组，cyse-net2+780nm光照组与cyse-mpeg
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+780nm光照组小鼠热成像 图片；(b)a图中肿瘤部位温度上升曲线。
25.图9.为本发明所述聚乙二醇修饰的硒代部花菁类化合物cyse-mpeg
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的肿瘤光疗评估。(a) 不同实验组荷瘤小鼠在过程中的体重变化曲线；(b)不同实验组小鼠肿瘤体积增长曲线； (c)实验结束后，不同实验组荷瘤小鼠体型和肿瘤部位照片；(d)经过两周结束后，不同 实验组离体肿瘤照片；(e)不同实验组小鼠的主要器官组织苏木精-伊红染切片，标尺:100 μm。
具体实施方式
26.下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出 了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实例。
27.实施例1：不同氧族部花菁类化合物cyx-net2(x＝o,s或se)的制备
28.1.cyo-net2的制备
[0029][0030]
化合物cyo-net2的合成:将cycho-net2(280mg,1.0mmol)，ch3coona(164mg,2.0 mmol)和吲哚盐(395g,1.2mmol)溶解在无水ac2o(25ml)中，在25℃搅拌18小时。将所 得深绿溶液减压浓缩并将所得残余物溶解在二氯甲烷中，然后用水洗涤3次，有机层用无 水硫酸钠干燥。旋蒸脱溶剂，硅胶谱柱提纯，洗脱剂：ch2cl2：ch3oh＝100:3，得到深 绿固体0.38g，产率约65％。1h nmr(400mhz,cd2cl2,δppm):8.54(d,j＝14.2hz,1h), 7.53-7.40(m,4h),7.30(td,j＝7.5,0.7hz,1h),7.21(d,j＝7.9hz,1h),6.84(dd,j＝9.0,2.4hz, 1h),6.55(d,j＝2.0hz,1h),6.08(d,j＝14.2hz,1h),4.07(t,j＝7.5hz,2h),3.55(q,j＝7.1hz, 4h),2.78(t,j＝6.1hz,2h),2.69(t,j＝6.1hz,2h),1.99-1.86(m,4h),1.77(s,6h),1.29(t,j＝ 7.1hz,6h),1.09(t,j＝7.4hz,3h)ppm.
13
c nmr(400mhz,cd2cl2):δ174.69,165.12,157.78, 153.62,143.64,143.45,142.16,139.94,130.94,130.06,126.67,124.63,123.67,116.38,114.51, 113.79,112.22,100.72,97.02,55.21,50.78,47.49,46.58,30.04,29.63,25.81,22.03,13.59,12.71 ppm.hr-ms(esi,positive mode,m/z):calcd.467.30569,found 467.30423for[m-i]
+
。
[0031]
2.cys-net2的制备
[0032][0033]
化合物cys-net2的合成:在n2氛围和0℃下，化合物cys-nh2(200mg,0.361mmol)溶解 在ch3cn(30ml)溶液中，加入碘乙烷(281mg,1.8mmol)和k2co3(200mg,1.44mmol)，在 85℃下回流18h。减压除去反应溶剂，用二氯甲烷稀释，然后用水洗涤3次，有机层用无水 硫酸钠干燥。旋蒸脱溶剂，硅胶谱柱提纯，洗脱剂：ch2cl2：ch3oh＝50:1，得到蓝绿 固体产率约15％。1h nmr(400mhz,cd2cl2,δppm):8.24(d,j＝13.6hz,1h),7.51(dd,j＝ 14.8,8.1hz,2h),7.43(dd,j＝16.9,9.2hz,2h),7.32(t,j＝7.4hz,1h),7.21(d,j＝7.9hz,1h), 6.92(d,j＝10.5hz,2h),6.17(d,j＝13.7hz,1h),4.06(t,j＝7.3hz,2h),3.53(dd,j＝13.9,6.9 hz,4h),2.79(t,j＝5.8hz,2h),2.67(t,j＝5.8hz,2h),2.06-1.87(m,4h),1.79(s,6h),1.28(t,j ＝6.9hz,6h),1.07(t,j＝7.3hz,3h)ppm.
13
c nmr(400mhz,cd2cl2):δ174.67,159.09, 151.10,143.29,142.46,141.96,140.66,134.71,131.68,130.12,126.90,126.58,123.78,120.75, 115.91,112.34,106.16,101.97,97.33,50.91,47.50,46.45,
33.66,29.94,28.03,22.10,22.04,13.68, 12.70ppm.hr-ms(esi,positive mode,m/z):calcd.483.28284,found 483.28107for[m-i]
+
。
[0034]
3.本发明所述cyse-net2的制备
[0035][0036]
化合物cyse-net2的合成:在n2氛围和0℃下，将nabh4(23mg,0.6mmol)分批加入到 2arse-net2(91mg,0.2mmol)的etoh(2ml)溶液中。反应15分钟后，加入固体柠檬酸(192mg， 1.0mmol)，并将反应混合物在0℃继续搅拌5分钟。然后将反应液用et2o(5ml)稀释并加入 去离子水(3ml)。萃取完分离各层，有机层用饱和nh4cl水溶液(2ml)和盐水(2ml)洗涤，经 na2so4干燥，过滤并真空浓缩，得到arseh-net2，无需进一步纯化。1h nmr(400mhz, cd2cl2,δppm):7.09(t,j＝7.9hz,1h),6.97-6.88(m,2h),6.54(d,j＝7.5hz,1h),3.30(q,j＝ 7.0hz,4h),1.12(t,j＝7.1hz,6h)ppm。
[0037]
化合物arseh-net2(361mg,1.58mmol)和k2co3(218mg,1.58mmol)溶于乙腈溶液中 (20ml),50℃加热下ar氛围中搅拌10min。ir780(700mg,1.05mmol)溶于乙腈(50ml)， 用注射器缓慢滴加进上述溶液，室温下避光反应24h，tcl跟踪反应。旋蒸脱溶剂，硅胶 谱柱提纯，展开剂：ch2cl2:ch3oh＝94:4，得到蓝固体，产率约20％。1h nmr(400mhz, cd2cl2,δppm):8.08(d,j＝13.7hz,1h),7.53(d,j＝8.6hz,2h),7.46(t,j＝7.6hz,1h),7.36(t, j＝7.4hz,1h),7.30-7.24(m,2h),7.04(d,j＝1.9hz,1h),6.85(d,j＝9.0hz,1h),6.30(d,j＝ 13.7hz,1h),4.12(t,j＝7.4hz,2h),3.51(q,j＝7.0hz,4h),2.81(t,j＝6.0hz,2h)),2.66(t,j ＝6.0hz,2h),2.03-1.84(m,4h),1.79(s,6h),1.27(t,j＝7.0hz,6h),1.07(t,j＝7.3hz,3h) ppm.
13
c nmr(400mhz,cd2cl2):δ174.36,161.53,149.46,144.40,142.03,141.59,141.36, 139.08,134.76,130.56,128.92,128.75,126.09,122.57,120.03,113.91,111.47,107.59,102.26, 49.95,46.52,45.07,33.43,28.51,27.56,21.03,20.91,12.37,11.37ppm.hr-ms(esi,positivemode,m/z):calcd.531.22730,found 531.22687for[m-i]
+
。
[0038]
cyx-net2在纯甲醇溶剂中的归一化吸收(a图)和荧光发射(b图)光谱如图1所示。 cyo-net2的最大吸收波长大约在716nm附近，对应的最大摩尔消光系数为1.37
×
105m-1
cm-1
， 最大荧光发射波长为746nm，荧光量子产率为0.23。化合物cys-net2最大吸收与发射波长 分别在760nm和800nm，荧光量子效率为0.18，摩尔消光系数为1.17
×
105m-1
cm-1
。化合 物cyse-net2最大吸收与发射波长分别在776nm和818nm，荧光量子效率为0.11，摩尔消 光系
小时以除去多余的盐，n
3-mpeg-methoxy和dmso，并冷冻干燥得到cyse-mpeg
5k
，产率为 95％。1h nmr(400mhz,meod,δppm):8.18(d,j＝13.3hz,1h),7.69-7.61(m,3h),7.57-7.48 (m,2h),7.45-7.39(m,2h),7.26(s,1h),6.99(d,j＝7.8hz,1h),6.49(d,j＝13.7hz,1h),4.62(s, 2h),4.38(s,2h),4.15(s,2h),4.06-3.54(m,mpeg),3.50(dd,j＝9.3,4.5hz,4h),3.40(s,3h), 3.27(d,j＝5.0hz,2h),2.87(s,2h),2.70(s,2h),2.33(s,2h),2.01(s,2h),1.82(s,6h),1.30(t,j ＝6.9hz,6h)ppm。modi-tof-ms,m/z:found 5000～6000。
[0043]
实施例3：不同氧族部花菁类化合物cyx-net2(x＝o,s或se)的光动力及光热效应
[0044]
对荧光染料cyx-net2的单线态氧产生能力进行了考察。选用1,3-二苯基异苯并呋喃 (dpbf)作为单线态氧的捕获剂。dpbf自身在415nm处有吸收峰，当存在单线态氧时，dpbf 与单线态氧发生反应，破坏其共轭结构，使得410nm处的紫外吸收峰下降，其反应历程如下 所示：
[0045][0046]
选用波长匹配的吲哚菁绿(icg,indocyanine green)作为标准单线态氧参照物，dpbf作为 单线态氧捕获剂，用紫外分光光度法测试，结果如图2所示。由图2a-d可以看出，在甲醇溶 剂中，用波长为750nm，功率为5mw/cm2的激光照射1分钟，荧光染料cyse-net2在光照 后迅速产生单线态氧，表现为410nm处的dpbf吸收峰快速下降，而cys-net2溶液中的dpbf 吸收峰些微下降，cyo-net2几乎无变化。根据如下公式可以算出化合物cyo-net2、cys-net2和cyse-net2的单线态氧产率分别为0.9％、2.5％和14.8％。结果显示cyse-net2相对于 cyo-net2、cys-net2更适用于光动力。
[0047][0048]
φ
δ
表示单线态氧产率；上标sample和icg分别表示材料和对照品；s表示dpbf在410 nm处吸收值的变化随时间作图的斜率；f＝1-10-od
，od值是750nm处材料和icg的吸光度。
[0049]
光热效应：选用750nm激发光源(0.5w
·
cm-2
)对50μm的cyx-net2的pbs缓冲液进 行光照150秒，再关闭激光器，使其冷却至初始温度，每秒记录一次温度。由图2e可以看出， 当溶液起始温度为25℃时，经激光照射后，溶液温度分别可以升到41℃(cyo-net2)，53℃ (cys-net2)和63℃(cyse-net2)，而纯pbs缓冲液的温度无明显变化。通过计算得知其热转 换效率依次为27.5％(cyo-net2)，38.5％(cys-net2)，42.2％(cyse-net2)，说明cyse-net2在 肿瘤光热方面更具优势。
[0050]
光热稳定性测试，即在一定光功率密度下，重复测量升温/冷却过程，通过相同条件下， 每次升温的变化量来确定材料的光热稳定性。如图2f所示，结果显示cyse-net2在经历5个 循环后温度无法继续上升，这可能是部花菁共轭结构被热效应和单线态氧破坏所致。
[0051]
实施例4：不同氧族部花菁类化合物cyx-net2(x＝o,s或se)的共定位实验
[0052]
造影实验中所用4t1细胞在含有10％胚胎小牛血清(fbs,invitrogen)，青霉素(100units/ml) 和链霉素(100mg/ml)的dulbecco’s modified eagle medium(dmem,invitrogen)，37℃，5％ co2的空气中培养。
[0053]
选用4t1细胞用2μm cyx-net2在37℃下孵育30分钟后用pbs(20mm,ph 7.4)洗涤三 次。再用150nm共染试剂(包括mito-tracker green，lyso-tracker green和dapi)孵化30分 钟，然后再用pbs(20mm,ph 7.4)洗涤三次成像。红通道激发波长：670nm；发射波长范 围：680-800nm。绿通道激发波长：488nm；发射波长范围，492-630nm。蓝通道激发 波长：405nm；发射波长范围，420-450nm。共定位实验在leica tcs sp8激光共聚焦荧光显 微镜上使用63倍油镜拍照。共染试剂购买自赛默飞公司，并按说明书操作进行实验。由图3 可以看出，线粒体商业染料mito-tracker green和cyx-net2共孵育30分钟后发现两者的荧光 可以很好的重叠，红绿荧光叠加后呈现出黄，其pearson’s共定位系数分别为0.89 (cyo-net2)，0.89(cys-net2)和0.91(cyse-net2)，而lyso-tracker green和dapi与之共孵育 后的pearson’s共定位系数均小于0.7，说明cyx-net2染料靶向线粒体。上述结果可能是由 于线粒体膜电位呈负性，带正电荷的部花菁结构利于靶向线粒体。
[0054]
实施例5：不同氧族部花菁类化合物cyx-net2(x＝o,s或se)的细胞光疗效果
[0055]
细胞内ros检测实验：选用商用活性氧检测试剂盒dcfh-da(2
′
,7
′‑
二氯荧光黄双乙酸盐) 作为细胞内活性氧检测的指示剂，4t1细胞为考察对象。dcfh-da本身并不发射荧光，当被 4t1细胞摄取后细胞内的酯酶可将其水解为dcfh，dcfh不能穿透细胞膜因此探针容易被 标记在细胞内。当细胞内存在活性氧时，dcfh会被氧化成荧光物质dcf，在488nm光激发 下，dcf在525nm处会有荧光发射，其荧光强度和活性氧浓度成正比。将浓度为cyx-net2溶液或者pbs(ph＝7.4)分别与4t1细胞在37℃，含有5％co2的空气中孵育2h后，用pbs 缓冲液洗涤去多余材料。加入dcfh-da，30分钟后，用750nm激光器照射5分钟，然后将 其用于成像试验。由图4a可以看出cyo-net2和cys-net2组的细胞呈现弱的绿荧光，而 cyse-net2组的细胞呈现强的绿荧光，结合荧光强度图4b，表明相较于其他组细胞， cyse-net2组细胞内产生了大量的单线态氧。
[0056]
mtt实验：利用mtt检测方法研究了化合物cyx-net2对4t1细胞的暗毒性和光毒性。 将4t1细胞接种到96孔板上，接种密度约为每孔1
×
105个细胞。接种完后在培养箱中继续 培养24小时待细胞贴壁后吸去孔内的培养液加入不同浓度的4t1细胞，继续培养6小时后用 20mw/cm2能量的750nm激光器光照5分钟。光照结束后继续培养24小时。然后每个孔加 入40μl浓度为2.5mg/ml的mtt溶液。孵育4小时后吸去孔内溶液，加入150μl二甲亚 砜(dmso)来溶解甲臜晶体，使用酶标仪(thermo scientific,varioskan flash)测得490nm处各 孔吸光度od值。以不加药对照组细胞生长存活率为100％，计算公式：细胞存活率％＝加药 组od/对照组od
×
100％。
[0057]
测试结果表明，如图4c，在避光情况下，化合物cyx-net2(x＝o,s,se)分别与细胞共 孵育24小时，细胞的半抑制浓度ic
50
为12.08μm,8.02μm和5.33μm，而在光照条件下， 细胞存活率显著降低，细胞的半抑制浓度ic
50
分别为》4μm,2.17μm和0.26μm，对应的 pi值(ic
50(light)
/ic
50(dark)
)分别为《3.02,3.70和20.50，证明相较于cyo-net2和cys-net2，化 合物cyse-net2产生了明显的光毒性，具有更好的光动力效果。
[0058]
活死细胞染实验：将cyse-net2溶液与4t1细胞在37℃下孵育4h后，用pbs缓冲液 洗涤去多余材料，然后加入活细胞和死细胞的染剂钙黄绿素(calcein am)和碘化丙啶 (propidium iodide，pi),用750nm激光器照射5分钟后，用于成像。由图4d可以看出，不光 照时，细胞呈现绿荧光，而经过光照后，细胞呈现红荧光，并且细胞形态发生了明显变 化，再次证明cyse-net2具有良好的光疗效果。
[0059]
实施例6：聚乙二醇修饰的硒代部花菁类化合物cyse-mpeg
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的光热效应
[0060]
参照实施例3方法，考察cyse-mpeg
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的光热效应，结果如图5a和5b所示。计算得cyse-mpeg
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的热转换效率为40.5％，说明cyse-mpeg
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继承了cyse-net2的光热转换能力， 更值得注意地是，相较于cyse-net2的较差光稳定性，cyse-mpeg
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在730nm的激光照射条 件下，在经历五个升温、降温循环过程中，cyse-mpeg
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的光热转换能力几乎没有改变，表 明cyse-mpeg
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具有高的光热转换能力和稳定性，其优于cyse-net2。
[0061]
浓度/光功率密度依赖性光热转换测试：如图5c所示，固定cyse-mpeg
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的浓度为50μm， cyse-mpeg
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在pbs中的温度变化与光功率密度表现出正相关的变化趋势。例如，当激光功 率密度为200mw/cm2,300mw/cm2和500mw/cm2时，相应的温度上升至33℃，40℃和60℃。 如图5d所示，固定激光功率密度为500mw/cm2时，随着cyse-mpeg
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浓度的增加， cyse-mpeg
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在pbs中的温度变化也相应的增加。当浓度分别为20μm，40μm和60μm时， 相应的温度上升至32℃，42℃和60℃。其中60℃足可以对癌细胞产生不可逆的杀伤作用(如 果温度超过43℃，肿瘤细胞会发生病变，细胞内蛋白错误折叠，如果长时暴露在此温度下会 造成肿瘤细胞不可逆的损伤,如果温度超过60℃，那么肿瘤细胞中的蛋白质会发生凝固，肿 瘤细胞被热消融)。
[0062]
实施例7：聚乙二醇修饰的硒代部花菁类化合物cyse-mpeg
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的细胞光疗效果
[0063]
参照实施例5的mtt实验方法，考察cyse-mpeg
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的细胞光疗效果。结果如图6a,6b所示。 在避光情况下，即使64μm的cyse-mpeg
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与细胞共孵育24小时，细胞的存活率依旧高达 87％，证明cyse-mpeg
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的暗毒性小。然而小分子cyx-net2系列染料的暗毒性比较大，其 ic
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值分别为12.08μm,8.02μm和5.33μm，这在活体生物中会给正常组织带来不可避免的 暗毒性伤害。值得注意地是，在用500mw/cm2的750nm激光照射5分钟后，与cyse-mpeg
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孵育的细胞存活率显著降低，ic
50
低至0.85μm，说明相较于小分子cyx-net2系列染料， cyse-mpeg
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的光稳定性、生物安全性和光疗效应更适用于活体肿瘤。
[0064]
实施例8：聚乙二醇修饰的硒代部花菁类化合物cyse-mpeg
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的肿瘤靶向荧光/光声成像
[0065]
实验方案：6-8周大的雌性荷4t1细胞瘤小鼠用于荧光活体成像，用异氟烷进行气体麻 醉，使用perkinelmer ivis lumina k series iii成像系统进行活体成像。成像实验激发光:780 nm，收集845nm通道的发射光。
[0066]
为了研究cyse-mpeg
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是否可以用于活体肿瘤造影，通过尾静脉注射的方式将对照小分 子cyse-net2(100μm,100μl)和cyse-mpeg
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(100μm,100μl)注射到荷4t1肿瘤的 balb/c小鼠中然后进行荧光和光声信号采集。结果如图7所示。活体荧光成像能力探究结果 如图7a所示，可以看出，在注射之前小鼠的肿瘤部位没有荧光，分别给药后，对照组的荧光 信号主要集中在肝脏区域，并未在肿瘤部位进行富集。而注射cyse-mpeg
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组小鼠可以在肿 瘤部位快速检测到荧光信号，这表明cyse-mpeg
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纳米粒子可以通过肿瘤epr效应富集到 肿瘤区
域，肿瘤区域的荧光信号在0.5小时左右达到最大值，然后降低(图7a,7c)。实验组给 药1小时，2小时和3小时后分别对小鼠进行解剖取肿瘤组织和其它正常组织进行荧光拍照， 结果显示，肿瘤部位的荧光信号最强，在肝、脾、肺、肾也能观察到荧光信号，而在肝和肾 部位荧光信号较强，可能与cyse-mpeg
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的代谢途径相关(图7b)。实验表明cyse-mpeg
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可以靶向肿瘤组织且其荧光可以穿透活体组织用于肿瘤组织荧光造影。
[0067]
在荧光成像模式下确定cyse-mpeg
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具有很好的肿瘤靶向和造影能力后，进一步对 cyse-mpeg
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在光声造影模式下的造影能力进行考察，使用光声/超声(pa/us vevo lazr-xfujifilm visualsonics)活体成像系统进行。与荧光成像类似，首先采集肿瘤区域在780nm激 光器下的光声信号pa780，如图7f,7g所示,相比于0小时肿瘤区域的光声信号，给药1小时 后，肿瘤区域光声信号pa780明显变强，并能持续几个小时都可观测到，然而注射小分子 cyse-net2对照组小鼠的肿瘤的光声信号却没明显变化，以上结果与荧光成像相符。这表明 cyse-mpeg
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可以有效的在肿瘤区域富集，实现了光声模式下肿瘤区域的成像造影，可以为 肿瘤临床提供更精确的时空信息。
[0068]
实施例9：聚乙二醇修饰的硒代部花菁类化合物cyse-mpeg
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的肿瘤光热成像
[0069]
实验方案：6-8周大的雌性荷4t1细胞瘤小鼠用于活体光热成像，使用美国flie红外热 成像仪进行热成像。尾静脉注射pbs溶液(组一)和cyse-mpeg
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(100μm,100μl,组二)至 荷瘤小鼠体内，1小时后使用0.5w/cm2的780nm激光器对肿瘤区域进行光照，记录肿瘤区 域的温度。
[0070]
鉴于材料溶液具有优越的光热效果，且cyse-mpeg
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具有良好的肿瘤富集能力，猜测其 可以用于肿瘤组织的光热，而近红外光在生物组织中具有较好的穿透性，可以杀死较深 处的肿瘤组织。材料的活体光热效果在荷4t1小鼠上进行评估。对小鼠注射pbs，cyse-net2和cyse-mpeg
5k 1小时后，用750nm(0.5w/cm2)激光对肿瘤部位进行照射，用热成像仪对 肿瘤部位的温度进行跟踪记录。如图8所示，注射cyse-mpeg
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的小鼠肿瘤部位温度在两分 钟内快速升高至53℃左右，并维持这个温度不变。在该温度下，对肿瘤细胞造成不可逆的杀 伤。相比之下，注射pbs溶液和cyse-net2并光照后的肿瘤温度只升高至34℃和41℃，温 度未超过肿瘤细胞损伤阈值(43℃)，并未对肿瘤区域造成破坏。实验结果表明，cyse-mpeg
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材料可以用于小鼠肿瘤光热。
[0071]
实施例10：聚乙二醇修饰的硒代部花菁类化合物cyse-mpeg
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的肿瘤光疗评估
[0072]
实验方案：6-8周大荷4t1细胞瘤小鼠用于光动力效果评估。将荷瘤小鼠随机分成3 个实验组。尾静脉注射pbs溶液(组一),cyse-net2(200μm,100μl,组二)和cyse-mpeg
5k (200μm,100μl,组三)进行黑暗处理或者各1小时后用0.5w/cm2的750nm激光器光照肿 瘤区域10分钟；小鼠每两天进行一次，两周后停止给药和光照，记录肿瘤体积和小鼠体 重。用游标卡尺测量肿瘤体积，肿瘤体积＝瘤长
×
瘤宽2
×
0.5，测量小鼠的体重。
[0073]
肿瘤及器官组织切片的h&e染实验：h&e染又称苏木精-伊红染，苏木精为碱性， 可将细胞核中核酸染成紫蓝；伊红染料为酸性主要将细胞株和细胞外基质的成为着成红。 对荷瘤小鼠进行后，按照章程处死小鼠，取每组小鼠的肿瘤、心、肝、脾、肺、肾等主 要器官，浸泡在福尔马林中，石蜡切片后进行h&e染，研究肿瘤和主要器官的病理情况。
[0074]
实验结果如图9b，对照组一和二中小鼠的瘤体积增加，其生长速度相似，说明
750nm 光照与注射pbs溶液/cyse-net2避光条件下对小鼠肿瘤发展影响不大。而注射cyse-mpeg
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后再使用750nm激光光照则小鼠肿瘤完全消失，在肿瘤位置上留下黑的结痂，结痂脱落后 长出新的皮肤(图9c)。如图9a,d，瘤体积和小鼠体重数据表明cyse-mpeg
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具有很好的光热 肿瘤能力且生物相容性较好、生物毒性小，在过程中小鼠体重没有明显减轻。
[0075]
cyse-mpeg
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作为一种潜在的肿瘤光热材料，对其生物毒性研究是非常必要的。本 发明通过组织学分析实验研究cyse-mpeg
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是否会导致其它器官炎症或者损伤。取对照组和 组的小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏进行h&e染。染结果如图9e，注射 cyse-net2(组一)小鼠避光和光照组的肝脏细胞出现炎症侵染，空泡化现象，可能是由于 cyse-net2的暗毒性较大，富集和停滞在肝脏所致。其他对照组和组小鼠心肌细胞结构正 常，无明显水肿。肝脏细胞无明显炎症侵染，肺泡和肺支气管结构清晰，肺泡壁血管无充血 现象，无明显纤维化及炎症症状，其它组织也未见明显损伤，同时只有注射cyse-mpeg
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的 光照组小鼠肿瘤出现细胞坏死和凋亡情况。因此cyse-mpeg
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具有较好的生物相容性和低毒 性，在实验所用的剂量下对小鼠无明显毒性，可用于活体肿瘤光热。
技术特征：
1.一种硒代部花菁类化合物，其特征在于具有如下结构：其中r代表-oh，-nh2或n,n-二乙胺基；x-代表阴离子。2.如权利要求1所述的硒代部花菁类化合物，其特征在于所述x-选自cl-、br-、i-、no
3-或pf
4-。3.一种聚乙二醇修饰的硒代部花菁类化合物，其特征在于具有如下结构：其中r代表-oh，-nh2或n,n-二乙胺基；x-代表阴离子，n＝3～200的整数。4.如权利要求3所述的聚乙二醇修饰的硒代部花菁类化合物，其特征在于r代表n,n-二乙胺基，n＝79。5.如权利要求4所述的聚乙二醇修饰的硒代部花菁类化合物，其特征在于所述x-选自cl-、br-、i-、no
3-或pf
4-。6.权利要求1或2所述的硒代部花菁类化合物或者权利要求3或4所述的聚乙二醇修饰的硒代部花菁类化合物在制备荧光染料或者肿瘤光疗药物中的应用。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述荧光染料为细胞和活体成像荧光探针。
技术总结
本发明公开了一类硒代部花菁类化合物，具有如下结构：或其中R代表-OH，-H2或,-二乙胺基；X-代表阴离子。本发明所述硒代部花菁类化合物吸收和发射波长均位于近红外区域(700nm-900nm)。有效靶向线粒体，可作为荧光染料用于细胞和活体成像以及肿瘤靶向的光动力/光热联合。的光动力/光热联合。
