一种基于网络药理学筛选PGG抗胃癌关键靶点的方法
一种基于网络药理学筛选pgg抗胃癌关键靶点的方法
技术领域
1.本发明公开一种基于网络药理学的关键通路与关键靶点筛选方法，涉及细胞生物学领域，具体涉及一种生物信息学手段结合细胞生物学方法和体内外药效学探讨验证pgg在胃癌中的应用潜力。
背景技术：
2.胃癌是一种异质性很强的疾病，是一个多因素参与、多步骤演变的复杂病理过程。国家和地区不同，胃癌的发生情况也不同，目前导致胃癌发生的主要因素包括环境、遗传、幽门螺旋杆菌、饮食、社会经济地位等。临床研究表明，联合对非转移性胃癌和胃食管腺癌患者有效，围手术期化疗或术后化疗加放化疗被列为胃癌指南中的首选方法。以上方法虽然可以抑制胃癌的发展但是会产生很大的毒副作用在一定程度上影响患者的健康，因此临床上一直寻新的方案。
3.1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖(pgg)，是一种来自于多种药用植物如五倍子、牡丹、芍药中的可水解多酚鞣酸单体化合物。文献报道pgg具有抗病毒、抗炎、抗糖尿病、抗癌等多种生理活性。pgg可抑制肺癌、前列腺癌、黑素瘤、乳腺癌等多种肿瘤细胞生长，被认为是潜在的抗肿瘤活性物质。dong研究发现在hepg2、mcf-7和a549细胞中，pgg可以通过激活自噬上游信号mapk8/9/10引发细胞自噬促进细胞衰老发挥其抗癌活性然而其体内抗胃癌作用及分子机制仍不明确。
4.网络药理学是一种借助于数据库在分子水平上来预测药物作用机制的一种方法。网络药理学可以通过目标分子所延伸出的分子网络、网络靶点等信息揭示生物系统与药物之间复杂的关系为生物活性物质的发现、机理研究以及新药的研发等领域提供了新的思路。前期许多药物均通过网络药理学揭示了其内在关联。因此，现有技术中需要一种采用细胞实验并结合网络药理学方法探究1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖胃癌的分子机制。
技术实现要素：
5.本发明所要解决的技术问题是：提供一种筛选pgg抗胃癌作用关键通路与关键靶点的方法，通过网络药理学以及结合体内外实验验证pgg抗胃癌作用机制，将体外药效学的实验结果与网络药理学获得的关键靶点以及相关通路进行对应，确定其潜在的分子机制，为后续的开发应用提供参考。
6.本发明提供一种基于网络药理学筛选pgg抗胃癌关键靶点的方法，包括以下步骤，且以下步骤顺次进行，
7.s1、胃癌及pgg靶点的预测：
8.在genecard、omim和disgenet三个疾病数据库以“gastric cancer”为关键词筛选得到胃癌相关靶点。以“pentagalloylglucose”为关键词在swisstargetprediction和pharmmapper数据库中筛选得到pgg相关靶点；两者交集得到pgg抗胃癌的潜在靶点。
9.s2、pgg抗胃癌靶点网络构建及hub基因的筛选：
10.将交集靶点输入到string数据库选择物种为“homo sapiens”，最低关系分数设置为0.4，除去游离的蛋白得到蛋白互作图，将其导入cytoscape3.7.1中利用cytohubba插件中的mcc计算方法筛选出排名前20的靶基因；
11.s3、hub基因的验证：
12.关键靶基因使用pdb数据库获取对应蛋白的三级结构保存为pdb格式，chem3d软件将pgg二维结构转换成三维结构保存为mol2格式，使用autodock vina将hub蛋白与pgg进行分子对接；kaplan-meier生存曲线分析hub基因对胃癌患者的预后价值，黑折线代表基因在胃癌中低表达，红折线代表基因在胃癌中高表达；
13.s4、go、kegg分析：
14.将hub基因输入到david数据库中得到go和kegg结果，得到的结果使用rstudio进行绘图。
15.s5、胃癌体外模型的构建：
16.取小鼠胃癌(mfc)细胞，37℃、5％ co2的培养箱中培养。培养基为补加10％灭活胎牛血清、100u/ml青霉素以及10mg/l链霉素；细胞贴壁后吸出培养基，用pbs清洗两次，继续培养；当细胞生长至80％-90％用胰蛋白酶进行消化，传代，每1～2天传代一次；取对数生长期细胞备用；
17.s6、pgg抑制胃癌细胞的增殖、周期、线粒体膜电位、活性氧含量及凋亡：
18.将标品pgg配制成不同浓度分别对胃癌细胞进行处理，进行细胞增殖实验、细胞周期检测、细胞凋亡检测、线粒体膜电位检测以及细胞内活性氧浓度检测；
19.s7、胃癌体内模型的构建：
20.体内实验：在湖北省疾病预防控制中心实验动物中心获取雌雄各半共40只6周龄的spf级balb/c小鼠(18
±
2g)在23℃室温条件下饲养于武汉轻工大学动物中心，光照循环，自由获取水与食物，实验前正常饲养一周适应环境；将生长状态良好的对数生长期细胞，调整细胞浓度至1
×
107cells/ml，取0.2ml的细胞悬液注射于小鼠腋下建立小鼠模型；
21.s8、pgg诱导小鼠体内胃癌的凋亡及抑制相关信号通路：
22.4天后随机将小鼠分成5组每组8只，实验组分别使用15mg/kg和30mg/kg的pgg、20mg/kg的5-fu和pbs按照两天一次的频率进行腹腔注射，隔天记录小鼠体重与肿瘤大小，饲养至第14天使用乙醚对小鼠进行麻醉，取血处死；收集小鼠肝、脾、肾与肿瘤分别置于4％的甲醛固定液与-80℃的冰箱中；所有实验流程均按照美国国立卫生研究院的《实验室动物护理和使用指南》，并经武汉轻工大学伦理委员会批准；对脏器进行he切片染，初步观察pgg体内毒性；对小鼠肿瘤组织进行tunel染观察pgg体内诱导肿瘤凋亡情况；在通路验证方面分为两个层次—基因层面进行实时荧光定量pcr，蛋白层面则采用蛋白质印迹法
23.步骤s4基因通路的验证主要是经过go和kegg富集分析所得到的pi3k-akt、mapk信号通路。
24.步骤s6人源胃癌(hepg2)细胞进行增殖实验为，将标品pgg分别溶于少量的二甲亚枫之中，用培养基稀释成0μm、12.5μm、25μm、50μm、100μm、200μm，对照组加入相同浓度、体积的五氟尿嘧啶；将对数生长的鼠源胃癌(mfc)细胞接种于96孔板，每组五个复孔；培养24小时后将孔内培养基吸出，pbs清洗两次，加等量不同浓度(0μm、12.5μm、25μm、50μm、100μm、200μm)的pgg以及五氟尿嘧啶(阳性对照组)孵育24以及48小时，到时间后甩出孔板的含药
培养基，pbs清洗后每孔加入10μl的cck-8溶液放置培养箱中孵育三个小时，将孔板置于酶标仪读取450nm处的吸光度，根据吸光度计算细胞增殖抑制率。
25.步骤s6鼠源胃癌(mfc)细胞进行细胞周期实验为，使用dna含量检测试剂盒(购自北京索莱宝科技有限公司)进行细胞周期检测。收集对数生长期的hepg2细胞按照每孔1
×
106个接种于六孔板，每孔1ml的培养基，培养箱孵育24h以后加入不同浓度的含药培养基分别处理24h和48h。到时间后用预冷的pbs洗涤细胞，调整细胞浓度在1
×
106个/ml，1500rmp，5min离心收集细胞(上清液合并一同离心)。离心过后除去上清液，细胞中加入预冷的70％的乙醇500μl固定两小时至过夜。染前除去固定液加入100μl的rnasea溶液重悬，37℃水浴30min，加入400μl的pi染液4℃避光孵育30min，流式细胞仪检测。
26.步骤s6鼠源胃癌(mfc)细胞进行细胞凋亡实验为，梯度浓度的pgg孵育小鼠胃癌mfc细胞48h，同时设立阴性对照组。2-8℃，1000rpm/min离心5min收集悬浮细胞。预冷pbs洗涤细胞两次，加入400μl 1
×
annexin v结合液重新悬浮细胞，调整浓度至1
×
106cells/ml。在细胞悬浮液中加入5μl annexin v-fitc染液，轻轻混匀后于2-8℃避光条件下孵育15分钟。加入5-10μl pi染液后轻轻混匀于2-8℃避光条件下孵育2-5分钟立即用流式细胞仪检测。
27.步骤s6鼠源胃癌(mfc)细胞进行线粒体膜电位实验为，取六孔板每孔接种1
×
106个细胞，12h后用含有梯度浓度的pgg处理细胞48h；吸出含药培养基，pbs清洗两遍后加入胰酶消化液收集细胞于1.5ml离心中；调整细胞浓度为1
×
106cells/ml，取0.5ml细胞培养液重悬细胞；加入0.5ml的jc-1染工作液，颠倒混匀，37℃孵育20min；加入1ml jc-1染工作液，充分混匀；细胞培养箱中37℃孵育20min，孵育结束后吸除上清，用jc-1染缓冲液(1
×
)洗涤2次；加入0.5ml jc-1染缓冲液重悬，流式细胞仪检测。
28.步骤s6鼠源胃癌(mfc)细胞进行细胞内活性氧含量变化实验为，取六孔板每孔接种1
×
106个细胞，12h后用含有梯度浓度的pgg处理细胞48h。胰酶消化收集细胞，用1ml pbs洗涤两次，1000rpm/min收集细胞沉淀。加入用无血清培养液稀释的dcfh-da(终浓度为10μm)荧光探针重悬细胞，调整细胞浓度1
×
106cells/ml。取一份不加探针，只加入培养基的细胞设为阴性对照管。取一份已加入探针的细胞，同时加入活性氧供氢体诱导细胞设为阳性对照管。37℃孵育细胞1h，1000rpm/min收集细胞，pbs洗涤后重悬细胞，流式细胞仪检测。
29.步骤s8鼠源胃癌(mfc)细胞进行he染为，将组织从固定液中取出修缮平整后进行脱水与石蜡包埋，并于石蜡切片机上切成4μm厚的切片，切片脱蜡至水，苏木素-伊红对切片染，染结束脱水使用中性树胶进行封片；取新石蜡切片脱蜡至水，使用蛋白酶k工作液进行抗原修复，滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，加试剂tdt，dutp，37℃水浴孵育2h，切片放入3％双氧水溶液，室温避光孵育15min阻断内源性过氧化物酶，切片加适量试剂converter-pod覆盖组织，清洗后加入dab显并使用苏木素进行复染，脱水封片。
30.步骤s8鼠源胃癌(mfc)细胞进行tunel染为，hepg2细胞与pgg共同孵育48h,加入1ml的pbs洗2次，转移至1.5ml离心管内。加入100μl细胞裂解液(10mm tris-cl ph 8.0，1mm edta，20％sds，5mmdtt，10mm pmsf)于冰上裂解30min，超声10次每次2s。12000rpm、4℃离心5min，收集上清，用bca蛋白定量试剂盒测定蛋白含量。蛋白样品加入1/4样品体积的蛋白上样缓冲液，95℃变性5min，待冷却至室温后12000rpm、4℃离心5min。蛋白样品在10％ sds-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，待蛋白maker跑开后切胶，在100v、90min、冰浴条件下转
膜。pvdf膜用tbst(5％脱脂牛奶)的室温封闭1h，加入一抗4℃孵育夜。用tbst洗三次，每次5min。加入二抗，室温孵育约1h。tbst洗涤三次，每次持续5min。加入ecl发光底物用凝胶成像仪扫描分析。
31.步骤s8鼠源胃癌(mfc)细胞进行实时荧光定量pcr实验为，取肿瘤组织30mg置于含有trizol的匀浆管中冷冻匀浆，匀浆结束后转移匀浆管上清至2ml ep管中；管中加入200μl氯仿，剧烈震荡，4℃，12000rpm/min，离心15min，将最上层清液约300μl转移至新ep管，加入600μl的异丙醇上下颠倒后，离心得到rna沉淀，使用75％的乙醇清洗沉淀，清洗结束离心晾干沉淀，加入50μl的depc水溶解沉淀；紫外分光光度计测定rna的浓度。使用试剂盒除将rna逆转录成cdna加入设计好的引物，以β-actin作为内参基因按照两步法程序(95℃(30s)，5℃(5s)，60℃(30s)，40个循环)进行定量分析。
32.步骤s8鼠源胃癌(mfc)细胞进行实时western blot实验为，肿瘤组织从-80℃取出解冻，剪碎后放入盛有组织蛋白提取试剂的匀浆管中低温匀浆，匀浆完成后冰浴30min使其裂解彻底，4℃，12000rpm/min离心15min收集上清总蛋白，使用bca蛋白浓度检测试剂盒测定上清总蛋白的浓度，根据蛋白的浓度确定样品蛋白上样量为40μg，并在蛋白样品中加入5
×
蛋白上样缓冲液，95-100℃沸水浴5min；配置分离胶与浓缩胶，取出上样梳将样品按照设计加入至上样孔。预先使用甲醇活化pvdf膜，按照按照正负极方位摆放转膜所需的三层结构，在100v的恒压下进行转膜，转膜完成后加入封闭液封闭1h，封闭完成加入预先稀释的一抗，4℃孵育过夜，回收抗体，并加入tbst清洗，加入预先稀释好的二抗，室温孵育30min，tbst清洗四次后检测，滴加新鲜预混的ecl溶液至蛋白侧，暗室曝光，胶片扫描存档，用image j分析软件进行灰度分析。
33.通过上述设计方案，本发明可以带来如下有益效果：一种分析pgg抗胃癌作用机制的方法，通过网络药理学以及结合体外实验验证pgg抗胃癌作用机制，将体内外药效学的实验结果与网络药理学获得的关键靶点以及相关通路进行对应，确定其潜在的分子机制，为后续的开发应用提供参考。
34.进一步的，网络药理学挖掘出pgg抗癌靶点328个，进一步筛选验证获得20个hub基因，通过对hub基因进行go、kegg分析推测pgg抗胃癌的作用机制可能与pi3k-akt信号通路、mapk信号通路有关。
35.pgg在体外可以显著抑制mfc细胞的增殖及克隆。随着pgg浓度由0μm梯度升至200μm小鼠mfc细胞凋亡率及活性氧含量也逐渐增加，线粒体膜电位逐渐降低，细胞生长被阻滞在s期。细胞实验可知pgg通过影响细胞周期，降低线粒体膜电位释放活性氧诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤的作用。
36.pgg在体内显著抑制小鼠胃癌异位移植瘤的生长，对小鼠脏器无显著毒性且其能促进肿瘤细胞的凋亡，能激活小鼠体内的免疫系统。qrt-pcr、western blot对预测通路进行验证发现pgg通过阻碍pi3k/akt信号通路和mapk-p38信号通路激活线粒体途径诱导肿瘤发生内源性凋亡发挥抗胃癌作用。
37.本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
38.通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其
它目的、特征和优势将变得更加明显。
39.图1为本发明一种基于网络药理学筛选pgg抗胃癌关键靶点的方法网络药理学获取pgg-靶-胃癌网络图。
40.图2为本发明一种基于网络药理学筛选pgg抗胃癌关键靶点的方法网络药理学关键靶点hub基因网络图。
41.图3为本发明一种基于网络药理学筛选pgg抗胃癌关键靶点的方法网络药理学go功能富集示意图。
42.图4为本发明一种基于网络药理学筛选pgg抗胃癌关键靶点的方法网络药理学kegg功能富集示意图。
43.图5为本发明一种基于网络药理学筛选pgg抗胃癌关键靶点的方法体外药效学考察pgg对鼠源胃癌(mfc)细胞增殖抑制的影响。
44.图6为本发明一种基于网络药理学筛选pgg抗胃癌关键靶点的方法体外药效学考察pgg对mfc细胞周期的影响。
45.图7为本发明一种基于网络药理学筛选pgg抗胃癌关键靶点的方法体外药效学分析pgg对mfc细胞凋亡的影响。
46.图8为本发明一种基于网络药理学筛选pgg抗胃癌关键靶点的方法体外药效学分析pgg对mfc细胞线粒体膜电位的影响。
47.图9为本发明一种基于网络药理学筛选pgg抗胃癌关键靶点的方法体外药效学分析pgg对mfc细胞活性氧含量的影响。
48.图10为本发明一种基于网络药理学筛选pgg抗胃癌关键靶点的方法体内药效学考察pgg对小鼠抑瘤率的影响。
49.图11为本发明一种基于网络药理学筛选pgg抗胃癌关键靶点的方法体内实验分析pgg对小鼠肿瘤细胞凋亡的影响。
50.图12为本发明一种基于网络药理学筛选pgg抗胃癌关键靶点的方法分析pgg抗胃癌信号通路基因mrna变化。
51.图13为本发明一种基于网络药理学筛选pgg抗胃癌关键靶点的方法分析pgg抗胃癌信号通路关键蛋白变化。
具体实施方式
52.下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
53.实施例
54.本实施例用于说明一种基于网络药理学筛选pgg抗胃癌关键靶点的方法，包括网络药理学分析，体内外药效学分析：
55.网络药理学分析
56.genecard、omim和disgenet三个数据库筛选得到胃癌相关基因11842个，获得胃癌相关靶基因11961个。pubchem数据库中获取pgg的二维结构，将化学结构导入pharmmapper、swisstargetprediction数据库共得到pgg靶基因372个。胃癌基因与pgg基因取交集得到328个交叉靶基因，为进一步展现靶基因与胃癌关系，使用cytoscape3.7.1软件构建了一个“pgg-gc-靶”网络，见图1。
57.交叉基因导入string数据库中得到含有328个节点，3442条边，平均节点自由度为21的蛋白互作图，把蛋白互作图导出为tsv格式输入到cytoscap-e3.7.1中，使用cytohubba插件将蛋白互作图计算筛选前20的hub基因，它们分别是：src、hras、akt1、rhoa、hsp90aa1、cdc42、mapk14、mapk8、egfr、igf1、mmp9、casp3、esr1、tp53、vegfa、igf1r、mmp2、alb、ar、fgf2，见图2。
58.autodock vina对接结果显示hub基因与pgg的结合自由能均小于0其中10个靶点结合自由能小于等于-9.0kcal/mol，说明大部分靶点与五没食子酰葡萄糖的结合能力较好。将hub基因输入kaplan-meier plotter数据库中，得出hub基因与疾病预后p值均小于0.05。综上证明hub基因与疾病和药物密切相关，见图3、4。
59.为了阐明pgg对胃癌的作用机制，通过r包和david数据库对20个hub基因进行go和kegg分析，go结果表明在生物过程方面与凋亡过程的负调控、血管内皮生长因子受体信号通路等有关，kegg结果显示的ras、rap1、neurotrophin、erbb信号通路主要下游mapk及pi3k/akt信号通路有关，推测pgg抗胃癌的潜在分子机制主要是通过阻滞pi3k/akt信号通路与mapk信号通路激活内源性凋亡。
60.体外药效学分析
61.pgg抑制胃癌细胞(mfc)的增殖实验：药物处理24h后pgg浓度为50μm时mfc细胞生长被显著抑制(p《0.05)，小鼠胃癌mfc细胞存活率随着药物浓度的升高而降低。药物处理48h后pgg浓度为25μm时mfc细胞生长被显著抑制(p《0.01)，pgg与5-fu没有显著差异。pgg孵育24h的ic50为239.88μm效果优于5-fu 288.40μm；5-fu处理48h的ic50为22.38μm效果优于pgg ic50 51.64μm，结果表明24h之内pgg效果优于5-fu，见图5。
62.用含有pgg和5-fu的含药培养基处理细胞10天结果，药物处理下的mfc细胞克隆能力受到显著抑制，随着药物浓度增加，细胞克隆能力越弱。25μm与50μm药物条件下5-fu效果好于pgg(p《0.01)，随着药物浓度升高至100μm和200μm两者抑制细胞克隆效果无显著差异。
63.pgg对胃癌细胞周期的影响：pgg处理小鼠胃癌mfc细胞48h后与空白对照组相比各个浓度下的细胞周期均出现不同变化，药物浓度在25μm以下g0/g1期无明显变化，s期数量增加(p《0.01)，g2/m期比例降低(p《0.05)。药物浓度升高至50-200μm后g0/g1期、g2/m期比例显著降低(p《0.001)，s期比例显著升高(p《0.001)，g2/m期比例显著降低(p《0.001)，见图6。以上结果说明pgg将细胞阻滞s期抑制小鼠胃癌mfc细胞的生长。
64.pgg对胃癌细胞凋亡的影响：随着pgg浓度的上升，小鼠胃癌mfc细胞的凋亡比例也不断增加，当pgg浓度达到200μm时与对照组相比晚期凋亡比例增加了25.53％，早期凋亡比例增加了31.38％与证明了pgg可以诱导小鼠胃癌mfc细胞的凋亡，见图7。本实验通过对细胞凋亡流式分析结果表明随着pgg浓度升高细胞凋亡率也不断上升。
65.pgg对胃癌细胞线粒体的膜电位影响：采用线粒体膜电位检测试剂盒(jc-1)检测癌细胞的线粒体膜电位情况。不同浓度的pgg对小鼠胃癌细胞处理48h，发现胃癌细胞的线粒体膜电位发生了变化，且随着浓度升高线粒体膜电位不断的降低，表明pgg导致胃癌细胞线粒体膜电位的降低诱导细胞凋亡，见图8。
66.pgg对胃癌细胞内活性氧含量影响：使用200μm pgg处理小鼠胃癌mfc细胞48h后检测细胞内活性氧的变化发现与空白组相比给药组细胞内活性氧含量显著增加(p《0.001)，
说明细胞凋亡伴随着活性氧的增加，见图9。
67.pgg对体内胃癌的影响：在体内通过腋下注射mfc细胞建立小鼠胃癌模型检测pgg在体内的效果。给药完成后将小鼠处死，对肿瘤及各脏器进行称重，与模型组相比pgg及5-fu给药组的肿瘤重量均小于模型组，不同浓度的pgg对小鼠胃癌移植瘤均有抑制作用，pgg高剂量组抑瘤率为54.71％，效果优于5-fu，见图10。
68.pgg对体肿瘤细胞凋亡的影响：对小鼠胃癌组织进行he染，染结果显示小鼠肿瘤组织与模型组相比出现大面积的核坏死及核碎裂。tunel染结果显示pgg高剂量组出现大面积的棕黄，表明高剂量能显著诱导小鼠胃癌肿瘤细胞凋亡，见图11。
69.pgg抗胃癌信号通路基因及蛋白表达影响：小鼠预测通路mrna结果显示与模型组相比，akt、pi3k、mtor比对照组表达水平显著降低(p《0.05)，egfr表达水平升高(p《0.05)，p38表达水平降低(p《0.05)，erk和jnk相比对照组无明显变化，见图12。蛋白表达结果显示，bax、cyto c、caspase3、caspase9相比对照组表达量显著升高(p《0.05)，bcl2表达量显著降低(p《0.001)，p-akt、p38、bcl-2蛋白表达下调(p《0.05)，c-caspase-3、bax表达上调(p《0.05)，见图13。
70.以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
技术特征：
1.一种基于网络药理学筛选pgg抗胃癌关键靶点的方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、胃癌及pgg靶点的预测：在genecard、omim和disgenet三个疾病数据库以“gastric cancer”为关键词筛选得到胃癌相关靶点；以“pentagalloylglucose”为关键词在swisstargetprediction和pharmmapper数据库中筛选得到pgg相关靶点；两者交集得到pgg抗胃癌的潜在靶点；s2、pgg抗胃癌靶点网络构建及hub基因的筛选：将交集靶点输入到string数据库选择物种为“homo sapiens”，最低关系分数设置为0.4，除去游离的蛋白得到蛋白互作图，将其导入cytoscape3.7.1中利用cytohubba插件中的mcc计算方法筛选出排名前20的靶基因；s3、hub基因的验证：关键靶基因使用pdb数据库获取对应蛋白的三级结构保存为pdb格式，chem3d软件将pgg二维结构转换成三维结构保存为mol2格式，使用autodock vina将hub蛋白与pgg进行分子对接；kaplan-meier生存曲线分析hub基因对胃癌患者的预后价值，黑折线代表基因在胃癌中低表达，红折线代表基因在胃癌中高表达；s4、go、kegg分析：将hub基因输入到david数据库中得到go和kegg结果，得到的结果使用rstudio进行绘图；s5、胃癌体外模型的构建：取鼠源胃癌(mfc)细胞，37℃、5％co2的培养箱中培养；培养基为补加10％灭活胎牛血清、100u/ml青霉素以及10mg/l链霉素；细胞贴壁后吸出培养基，用pbs清洗两次，继续培养；当细胞生长至80％-90％用胰蛋白酶进行消化，传代，每1～2天传代一次；取对数生长期细胞备用；s6、pgg抑制胃癌细胞的增殖、周期、线粒体膜电位、活性氧含量及凋亡：将标品pgg配制成不同浓度分别对小鼠胃癌细胞进行处理，进行细胞增殖实验、细胞周期检测、细胞凋亡检测、线粒体膜电位检测以及细胞内活性氧检测；s7、胃癌体内模型的构建：取雌雄各半共40只6周龄的spf级balb/c小鼠在23℃室温条件下饲养于武汉轻工大学动物中心，光照循环，自由获取水与食物，实验前正常饲养一周适应环境；将生长状态良好的对数生长期细胞，调整细胞浓度至1
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107cells/ml，取0.2ml的细胞悬液注射于小鼠腋下建立小鼠模型；s8、pgg诱导小鼠体内胃癌的凋亡及抑制相关信号通路：4天后随机将小鼠分成5组每组8只，实验组分别使用15mg/kg和30mg/kg的pgg、20mg/kg的5-fu和pbs按照两天一次的频率进行腹腔注射，隔天记录小鼠体重与肿瘤大小，饲养至第14天使用乙醚对小鼠进行麻醉，取血处死；收集小鼠肝、脾、肾与肿瘤分别置于4％的甲醛固定液与-80℃的冰箱中；对脏器进行he切片染，初步观察pgg体内毒性；对小鼠肿瘤组织进行tunel染观察pgg体内诱导肿瘤凋亡情况；在通路验证方面分为两个层次—基因层面进行实时荧光定量pcr，蛋白层面则采用蛋白质印迹法。2.根据权利要求1所述的一种基于网络药理学筛选pgg抗胃癌关键靶点的方法，其特征在于，所述s4基因通路的验证主要是经过go和kegg富集分析所得到的pi3k-akt、mapk信号
通路。3.根据权利要求1所述的一种基于网络药理学筛选pgg抗胃癌关键靶点的方法，其特征在于，步骤s6鼠源胃癌mfc细胞进行增殖实验为，将标品pgg分别溶于少量的二甲亚枫之中，用培养基稀释成0μm、12.5μm、25μm、50μm、100μm、200μm，对照组加入相同浓度、体积的五氟尿嘧啶；将s5对数生长的鼠源胃癌mfc细胞接种于96孔板，每组五个复孔；培养24小时后将孔内培养基吸出，pbs清洗两次，加等量0μm、12.5μm、25μm、50μm、100μm、200μm的pgg以及阳性对照组五氟尿嘧啶孵育24小时以及48小时，到时间后甩出孔板的含药培养基，pbs清洗后每孔加入10μl的cck-8溶液放置培养箱中孵育三个小时，将孔板置于酶标仪读取450nm处的吸光度，根据吸光度计算细胞增殖抑制率。4.根据权利要求1所述的一种基于网络药理学筛选pgg抗胃癌关键靶点的方法，其特征在于，梯度浓度的pgg孵育小鼠胃癌mfc细胞48h，同时设立阴性对照组，并收集细胞；pbs洗涤六孔板中的胃癌mfc细胞2次，胰酶消化1500rpm/min，5min离心收集孔板中细胞，调整细胞浓度至1
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106cells/ml，取1ml细胞悬液离心除去上清后，加入500μl的70％预冷乙醇固定细胞2h至过夜，染前使用pbs清洗细胞，把100μl rnase a溶液加入至清洗好的细胞沉淀中重悬细胞，37℃水浴30min，加入400μl pi染液混匀，4℃避光孵育30min，流式细胞仪检测。5.根据权利要求1所述的一种基于网络药理学筛选pgg抗胃癌关键靶点的方法，其特征在于，步骤s6鼠源胃癌mfc细胞进行细胞凋亡实验为，梯度浓度的pgg孵育小鼠胃癌mfc细胞48h，同时设立阴性对照组；2-8℃，1000rpm/min离心5min收集悬浮细胞；预冷pbs洗涤细胞两次，加入400μl 1
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annexin v结合液重新悬浮细胞，调整浓度至1
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106cells/ml；在细胞悬浮液中加入5μl annexin v-fitc染液，轻轻混匀后于2-8℃避光条件下孵育15分钟，加入5-10μl pi染液后轻轻混匀于2-8℃避光条件下孵育2-5分钟立即用流式细胞仪检测。6.根据权利要求1所述的一种基于网络药理学筛选pgg抗胃癌关键靶点的方法，其特征在于，步骤s6鼠源胃癌mfc细胞进行线粒体膜电位实验为，取六孔板每孔接种1
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106个细胞，12h后用含有梯度浓度的pgg处理细胞48h；吸出含药培养基，pbs清洗两遍后加入胰酶消化液收集细胞于1.5ml离心中；调整细胞浓度为1
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106cells/ml，取0.5ml细胞培养液重悬细胞；加入0.5ml的jc-1染工作液，颠倒混匀，37℃孵育20min；加入1ml jc-1染工作液，充分混匀；细胞培养箱中37℃孵育20min，孵育结束后吸除上清，用jc-1 1
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染缓冲液洗涤2次；加入0.5ml jc-1染缓冲液重悬，流式细胞仪检测。7.根据权利要求1所述的一种基于网络药理学筛选pgg抗胃癌关键靶点的方法，其特征在于，步骤s6鼠源胃癌mfc细胞进行细胞内活性氧含量变化实验为，取六孔板每孔接种1
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106个细胞，12h后用含有梯度浓度的pgg处理细胞48h；胰酶消化收集细胞，用1ml pbs洗涤两次，1000rpm/min收集细胞沉淀；加入用无血清培养液稀释的终浓度为10μm的dcfh-da荧光探针重悬细胞，调整细胞浓度1
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106cells/ml；取一份不加探针，只加入培养基的细胞设为阴性对照管；取一份已加入探针的细胞，同时加入活性氧供氢体诱导细胞设为阳性对照管；37℃孵育细胞1h，1000rpm/min收集细胞，pbs洗涤后重悬细胞，流式细胞仪检测。8.根据权利要求1所述的一种基于网络药理学筛选pgg抗胃癌关键靶点的方法，其特征在于，步骤s8鼠源胃癌mfc细胞进行he染为，将组织从固定液中取出修缮平整后进行脱水与石蜡包埋，并于石蜡切片机上切成4μm厚的切片，切片脱蜡至水，苏木素-伊红对切片染
，染结束脱水使用中性树胶进行封片；取新石蜡切片脱蜡至水，使用蛋白酶k工作液进行抗原修复，滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，加试剂tdt，dutp，37℃水浴孵育2h，切片放入3％双氧水溶液，室温避光孵育15min阻断内源性过氧化物酶，切片加适量试剂converter-pod覆盖组织，清洗后加入dab显并使用苏木素进行复染，脱水封片。9.根据权利要求1所述的一种基于网络药理学筛选pgg抗胃癌关键靶点的方法，其特征在于，步骤s8鼠源胃癌mfc细胞进行实时荧光定量pcr实验为，取肿瘤组织30mg置于含有trizol的匀浆管中冷冻匀浆，匀浆结束后转移匀浆管上清至2ml ep管中；管中加入200μl氯仿，剧烈震荡，4℃，12000rpm/min，离心15min，将最上层清液约300μl转移至新ep管，加入600μl的异丙醇上下颠倒后，离心得到rna沉淀，使用75％的乙醇清洗沉淀，清洗结束离心晾干沉淀，加入50μl的depc水溶解沉淀；紫外分光光度计测定rna的浓度；使用试剂盒除将rna逆转录成cdna加入设计好的引物，以β-actin作为内参基因按照两步法程序进行定量分析。10.根据权利要求1所述的一种基于网络药理学筛选pgg抗胃癌关键靶点的方法，其特征在于，鼠源胃癌mfc细胞进行实时western blot实验为，肿瘤组织从-80℃取出解冻，剪碎后放入盛有组织蛋白提取试剂的匀浆管中低温匀浆，匀浆完成后冰浴30min使其裂解彻底，4℃，12000rpm/min离心15min收集上清总蛋白，使用bca蛋白浓度检测试剂盒测定上清总蛋白的浓度，根据蛋白的浓度确定样品蛋白上样量为40μg，并在蛋白样品中加入5
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蛋白上样缓冲液，95-100℃沸水浴5min；配制分离胶与浓缩胶，取出上样梳将样品按照设计加入至上样孔；预先使用甲醇活化pvdf膜，按照按照正负极方位摆放转膜所需的三层结构，在100v的恒压下进行转膜，转膜完成后加入封闭液封闭1h，封闭完成加入预先稀释的一抗，4℃孵育过夜，回收抗体，并加入tbst清洗，加入预先稀释好的二抗，室温孵育30min，tbst清洗四次后检测，滴加新鲜预混的ecl溶液至蛋白侧，暗室曝光，胶片扫描存档，用image j分析软件进行灰度分析。
技术总结
本发明公开一种基于网络药理学筛选PGG抗胃癌关键靶点的方法，并采用体内外实验探讨验证。包括以下步骤：采用网络药理学方法预测PGG可能通过PI3K-AKT、MAPK信号通路抑制胃癌生长；CCK-8法和平板克隆实验分别用于检测细胞活力与细胞增殖，流式细胞术检测细胞周期、凋亡、线粒体膜电位变化以及细胞内活性氧含量变化，HE切片检测小鼠肿瘤病变，TUEL染检测小鼠肿瘤组织细胞凋亡；实时荧光定量以及免疫印记法检测PI3K-AKT、MAPK信号通路相关的基因和蛋白表达。通过对网络药理学预测的通路验证表明PGG可通过调控PI3K-AKT和MAPK-P38信号通路促肿瘤凋亡而发挥抗肿瘤作用，PGG被证明是胃癌的一种潜在药物。癌的一种潜在药物。癌的一种潜在药物。
