一种钛表面制备复合涂层的方法
1.本发明属于医用植入体材料技术领域，涉及钛植入体，具体涉及一种钛表面制备复合涂层的方法。
背景技术：
2.钛及其合金具有密度小、强度高、韧性好、无毒、弹性模量低、良好的耐蚀性、低x射线吸收率等，因而在医用金属材料中占有越来越重要的地位，在临床上得到了广泛的应用。但由于钛植入体缺乏足够的生物活性，与宿主骨的作用仍是以机械嵌合为主，初期稳定性及长期成功率仍然不能让人满意。
3.按照骨结合理论，植入体与宿主组织形成良好的骨性结合是种植成功的关键。如何迅速实现良好的骨整合，对于实现植入体的种植成功率和长期稳定性十分重要。最新研究表明，医用生物材料表面物理形貌和化学性质对生物材料的性能共同起着决定性的作用，对种植体表面进行合适改性，有利于组织细胞，特别是成骨样细胞在种植体表面的附着生长，促进骨整合发生。
4.本发明的目的即是为了解决钛植入体存在的上述问题，而对钛表面进行改性，研发了一种在钛表面制备丝素蛋白/丝素蛋白衍生肽/羟基磷灰石复合涂层的方法。
技术实现要素：
5.本发明的目的是提供一种钛表面制备复合涂层的方法。
6.本发明是通过以下技术方案实现的：一种钛表面制备复合涂层的方法，步骤为：（1）再生丝素蛋白溶液的制备：将丝素纤维在cacl2/水/乙醇的三元溶液中，搅拌溶解成丝素蛋白混合溶液，在透析袋中用去离子水透析3-5天，去除杂质后离心除去不溶性颗粒，上清液保存在4℃，即得再生丝素蛋白溶液；（2）医用纯钛预处理：医用纯钛片分别用丙酮、无水乙醇和去离子水超声清洗，然后用hf和hno3的混合液浸泡钛片，除去表面不同成分的氧化钛膜，再用去离子水超声清洗，氮气吹干置于干燥器中备用，得到酸预处理的钛片pti；（3）医用钛表面活化：将酸预处理的钛片置于piranha溶液中，在55-65℃下反应25-40min，氧化处理构建富含羟基的氧化层的羟基化钛ti-oh，去离子水超声清洗，氮气吹干置于干燥器中；（4）聚多巴胺修饰活化钛表面：将ti-oh浸泡在盐酸多巴胺溶液中反应20-30h，反应完成后，分别在丙酮、无水乙醇和去离子水中超声清洗，氮气吹干置于干燥器中；（5）丝素蛋白衍生肽的制备：将α-糜蛋白酶溶解在sf的水溶液中，形成凝胶状沉淀cp组分，离心、水洗后冷冻干燥，将上清液冻干，回收可溶性多肽cs粉末；（6）复合涂层的制备：将cs粉末加入到得到的sf溶液中，然后均匀滴加到聚多巴胺修饰的钛表面，烘干后进行电沉积，电解液为ca(no3)2和 (nh4)h2po4的混合液，样品充当阴
极在室温下浸泡在电解液中沉积，烘干后在tris缓冲液中浸泡，然后用去离子水洗涤，即得。
7.进一步地，所述的三元溶液是由cacl2：水：乙醇按照摩尔比为1:8:2配成的混合溶液。
8.所述的透析袋截留分子量为8000-14000mw，去除杂质后，3000r/min离心5min除去不溶性颗粒。
9.所述的hf的溶液浓度为0.54mol/l，hno3的浓度0.29mol/l，两者的体积比为1：1，钛片在搅拌条件下浸泡5min。
10.所述的piranha溶液体积比为h2so4：h2o2=7：3。
11.所述的盐酸多巴胺溶液ph为8.5，tris为10mm。
12.所述的α-糜蛋白酶与底物的比例为1：100。
13.所述的cs粉末按照5mg/ml的比例加入到3 wt% sf溶液中，然后以15μl/cm2的比例均匀滴加到聚多巴胺修饰的钛表面，65℃烘干。
14.所述的电解液ph为4，由0.042 m ca(no3)2和0.025 m(nh4)h2po4混合制成，电极间距为2 cm，沉积时间为15min。
15.本发明将医用纯钛片经处理去除表面的二氧化钛膜，得到酸预处理的钛片pti，然后用piranha溶液处理，氧化处理构建富含羟基的氧化层的羟基化钛ti-oh，多巴胺通过tio2层直接为多巴胺的氧化自聚合提供活性位点以便生成均匀的聚多巴胺层，之后利用聚多巴胺层在碱性环境下由邻苯二酚转化成的醌结构，可以与丝素蛋白及其衍生肽的氨基发生迈克尔加成或者席夫碱反应，生成牢固的共价结合；随后的电沉积过程中，沉积的钙离子，磷酸根离子与蛋白质多肽分子结合，在随后的碱浴过程中形成丝素蛋白/丝素蛋白衍生肽/羟基磷灰石复合涂层，且所形成的复合涂层形貌是主要是片状并逐渐连接成网状多孔结构。
16.对比丝素蛋白/羟基磷灰石复合涂层、丝素蛋白/2%丝素蛋白衍生肽/羟基磷灰石复合涂层、丝素蛋白/5%丝素蛋白衍生肽/羟基磷灰石复合涂层、和5%丝素蛋白衍生肽/羟基磷灰石复合涂层，可以发现丝素蛋白/羟基磷灰石涂层呈球状沉积，丝素蛋白/2%丝素蛋白衍生肽/羟基磷灰石涂层呈窄片状沉积，丝素蛋白/5%丝素蛋白衍生肽/羟基磷灰石涂层呈片状沉积，且中间孔隙较小，5%丝素蛋白衍生肽/羟基磷灰石涂层呈片状沉积，且中间孔隙较大，结果如图1、2所示。
17.分析对比丝素蛋白/5%丝素蛋白衍生肽/羟基磷灰石复合涂层截面eds图谱和5%丝素蛋白衍生肽/羟基磷灰石复合涂层截面eds图谱，可以发现丝素蛋白/5%丝素蛋白衍生肽/羟基磷灰石复合涂层截面含有少量n元素，证明蛋白质多肽与羟基磷灰石复合，结果如图3、4所示。
18.综上所述，本发明首先在活化钛表面的聚多巴胺涂层之上构建丝素蛋白及其衍生肽涂层，通过聚多巴胺层共价固定丝素蛋白及其衍生肽，其次通过电化学沉积磷灰石结构，并与蛋白质多肽层混合，在钛表面构建仿生类骨结构。
19.与现有技术相比，本发明复合涂层具有良好的间充质干细胞的相容性，诱导干细胞成骨分化能力，能提高纯钛表面的生物活性和成骨活性，具有广泛的临床应用潜力，制备工艺较为简单，生产成本较低，具有较好的推广应用价值。
附图说明
20.图1依次为丝素蛋白/羟基磷灰石复合涂层；丝素蛋白/2%丝素蛋白衍生肽/羟基磷灰石复合涂层；丝素蛋白/5%丝素蛋白衍生肽/羟基磷灰石复合涂层；5%丝素蛋白衍生肽/羟基磷灰石复合涂层。
21.图2依次为丝素蛋白/5%丝素蛋白衍生肽/羟基磷灰石复合涂层截面sem图，5%丝素蛋白衍生肽/羟基磷灰石复合涂层截面sem图；图3为丝素蛋白/5%丝素蛋白衍生肽/羟基磷灰石复合涂层截面eds图谱；图4为5%丝素蛋白衍生肽/羟基磷灰石复合涂层截面eds图谱。
具体实施方式
22.下面结合实施例和附图对本发明做进一步描述：实施例11)再生丝素蛋白溶液的制备：将75g家蚕生丝放入3l质量浓度为0.05%的na2co3水溶液中，于100
ꢀ°
c沸水中处理30min，重复3次，使蚕丝脱胶，充分洗涤干燥后得到纯丝素纤维。将纯丝素纤维加入三元溶液中（由cacl2/水/乙醇摩尔比为1:8:2配成）溶液中，在72
ꢀ°
c搅拌溶解成丝素蛋白混合溶液。将所得到的丝素混合溶液装入透析袋(8000~14000 mw)中，用去离子水透析4天，去除杂质然后用3000r/min离心5min除去不溶性颗粒，上清液保存在4℃。
23.（2）医用纯钛预处理：医用纯钛片分别用丙酮、无水乙醇和去离子水在超声机各超声清洗30min，除去钛表面的杂质污垢；用hf(0.54mol/l)和hno
3 (0.29mol/l)的的配成的混合液(体积比为1：1)浸泡钛片，不断搅拌5min，除去表面不同成分的氧化钛膜，然后用去离子水超声清洗10min，氮气吹干置于干燥器中备用，得到酸预处理的钛片。
24.（3）医用钛表面活化：将步骤2）酸预处理的钛片置于100ml的piranha溶液(体积比h2so4：h2o2=7：3)中，在60℃下进行反应30min，氧化处理构建富含羟基的氧化层的羟基化钛(ti-oh)，即活化钛，去离子水超声清洗10min，氮气吹干置于干燥器中备用。
25.（4）聚多巴胺修饰活化钛表面：配制浓度为2mg/ml的盐酸多巴胺溶液(ph=8．5，tris=10mm)，将步骤3）活化钛浸泡在盐酸多巴胺溶液中在37℃振荡反应24h。反应完成后，聚多巴胺修饰钛(ti-pda)分别在丙酮、无水乙醇和去离子水在超声机各超声清洗10min、氮气吹干置于干燥器中备用。
26.（5）丝素蛋白衍生肽的制备：将α-糜蛋白酶(酶与底物的比例为1：100)溶解在sf的水溶液中。在37℃下24h后形成凝胶状沉淀(cp组分)，离心、水洗2次后冷冻干燥。将上清液冻干，回收可溶性多肽(cs组分)。
27.（6）丝素蛋白/羟基磷灰石复合涂层的制备：将所得3 wt% sf溶液以15μl/cm2的比例均匀滴加到步骤4）得到的聚多巴胺修饰的钛表面，65℃烘干。所得样品直接进行电沉积，电解液(ph=4)由0.042 m ca(no3)2和0.025 m(nh4)h2po4组成。电极间距为2 cm，沉积时间为15min。样品充当阴极在室温下浸泡在电解液中沉积，然后取出并放入烘干箱中烘干。为了得到羟基磷灰石，沉积的钛片在60
°
c的10 mm tris缓冲液(ph=8.5)中浸泡2小时，然后用去离子水洗涤。
28.实施例2
（1）再生丝素蛋白溶液的制备：将75g家蚕生丝放入3l质量浓度为0.05%的na2co3水溶液中，于100
ꢀ°
c沸水中处理30min，重复3次，使蚕丝脱胶，充分洗涤干燥后得到纯丝素纤维。将纯丝素纤维加入三元溶液中（由cacl2/水/乙醇摩尔比为1:8:2配成）溶液中，在72
ꢀ°
c搅拌溶解成丝素蛋白混合溶液。将所得到的丝素混合溶液装入透析袋(8000~14000 mw)中，用去离子水透析4天，去除杂质然后用3000r/min离心5min除去不溶性颗粒，上清液保存在4℃。
29.（2）医用纯钛预处理：医用纯钛片分别用丙酮、无水乙醇和去离子水在超声机各超声清洗30min，除去钛表面的杂质污垢；用hf(0.54mol/l)和hno
3 (0.29mol/l)的的配成的混合液(体积比为1：1)浸泡钛片，不断搅拌5min，除去表面不同成分的氧化钛膜，然后用去离子水超声清洗10min，氮气吹干置于干燥器中备用，得到酸预处理的钛片(pti)。
30.（3）医用钛表面活化：将酸预处理的钛片置于100ml的piranha溶液(体积比h2so4：h2o2=7：3)中，在60℃下进行反应30min，氧化处理构建富含羟基的氧化层的羟基化钛(ti-oh)，去离子水超声清洗10min，氮气吹干置于干燥器中备用。
31.（4）聚多巴胺修饰活化钛表面：配制浓度为2mg/ml的盐酸多巴胺溶液(ph=8．5，tris=10mm)，将ti-oh浸泡在盐酸多巴胺溶液中在37℃振荡反应24h。反应完成后，聚多巴胺修饰钛(ti-pda)分别在丙酮、无水乙醇和去离子水在超声机各超声清洗10min、氮气吹干置于干燥器中备用。
32.（5）丝素蛋白衍生肽的制备：将α-糜蛋白酶(酶与底物的比例为1：100)溶解在sf的水溶液中。在37℃下24h后形成凝胶状沉淀(cp组分)，离心、水洗2次后冷冻干燥。将上清液冻干，回收可溶性多肽(cs组分)。
33.（6）丝素蛋白/丝素蛋白衍生肽/羟基磷灰石复合涂层的制备：将cs粉末按照2mg/ml的比例，加入到得到的3 wt% sf溶液中，得到含2%cs的sf溶液的混合溶液。将所得混合溶液以15μl/cm2的比例均匀滴加到聚多巴胺修饰的钛表面，65℃烘干。所得样品直接进行电沉积，电解液(ph=4)由0.042 m ca(no3)2和0.025 m(nh4)h2po4组成。电极间距为2 cm，沉积时间为15min。样品充当阴极在室温下浸泡在电解液中沉积，然后取出并放入烘干箱中烘干。为了得到羟基磷灰石，沉积的钛片在60
°
c的10 mm tris缓冲液(ph=8.5)中浸泡2小时，然后用去离子水洗涤实施例3（1）再生丝素蛋白溶液的制备：将75g家蚕生丝放入3l质量浓度为0.05%的na2co3水溶液中，于100
ꢀ°
c沸水中处理30min，重复3次，使蚕丝脱胶，充分洗涤干燥后得到纯丝素纤维。将纯丝素纤维加入三元溶液中（由cacl2/水/乙醇摩尔比为1:8:2配成）溶液中，在72
ꢀ°
c搅拌溶解成丝素蛋白混合溶液。将所得到的丝素混合溶液装入透析袋(8000~14000 mw)中，用去离子水透析4天，去除杂质然后用3000r/min离心5min除去不溶性颗粒，上清液保存在4℃。
34.（2）医用纯钛预处理：医用纯钛片分别用丙酮、无水乙醇和去离子水在超声机各超声清洗30min，除去钛表面的杂质污垢；用hf(0.54mol/l)和hno
3 (0.29mol/l)的的配成的混合液(体积比为1：1)浸泡钛片，不断搅拌5min，除去表面不同成分的氧化钛膜，然后用去离子水超声清洗10min，氮气吹干置于干燥器中备用，得到酸预处理的钛片(pti)。
35.（3）医用钛表面活化：将酸预处理的钛片置于100ml的piranha溶液(体积比h2so4：
h2o2=7：3)中，在60℃下进行反应30min，氧化处理构建富含羟基的氧化层的羟基化钛(ti-oh)，去离子水超声清洗10min，氮气吹干置于干燥器中备用。
36.（4）聚多巴胺修饰活化钛表面：配制浓度为2mg/ml的盐酸多巴胺溶液(ph=8．5，tris=10mm)，将ti-oh浸泡在盐酸多巴胺溶液中在37℃振荡反应24h。反应完成后，聚多巴胺修饰钛(ti-pda)分别在丙酮、无水乙醇和去离子水在超声机各超声清洗10min、氮气吹干置于干燥器中备用。
37.（5）丝素蛋白衍生肽的制备：将α-糜蛋白酶(酶与底物的比例为1：100)溶解在sf的水溶液中。在37℃下24h后形成凝胶状沉淀(cp组分)，离心、水洗2次后冷冻干燥。将上清液冻干，回收可溶性多肽(cs组分)。
38.（6）丝素蛋白/丝素蛋白衍生肽/羟基磷灰石复合涂层的制备：将cs粉末按照5mg/ml的比例，加入到得到的3 wt% sf溶液中，得到含5%cs的sf溶液的混合溶液。将所得混合溶液以15μl/cm2的比例均匀滴加到聚多巴胺修饰的钛表面，65℃烘干。所得样品直接进行电沉积，电解液(ph=4)由0.042 m ca(no3)2和0.025 m(nh4)h2po4组成。电极间距为2 cm，沉积时间为15min。样品充当阴极在室温下浸泡在电解液中沉积，然后取出并放入烘干箱中烘干。为了得到羟基磷灰石，沉积的钛片在60
°
c的10 mm tris缓冲液(ph=8.5)中浸泡2小时，然后用去离子水洗涤实施例4（1）再生丝素蛋白溶液的制备：将75g家蚕生丝放入3l质量浓度为0.05%的na2co3水溶液中，于100
ꢀ°
c沸水中处理30min，重复3次，使蚕丝脱胶，充分洗涤干燥后得到纯丝素纤维。将纯丝素纤维加入三元溶液中（由cacl2/水/乙醇摩尔比为1:8:2配成）溶液中，在72
ꢀ°
c搅拌溶解成丝素蛋白混合溶液。将所得到的丝素混合溶液装入透析袋(8000~14000 mw)中，用去离子水透析4天，去除杂质然后用3000r/min离心5min除去不溶性颗粒，上清液保存在4℃。
39.（2）医用纯钛预处理：医用纯钛片分别用丙酮、无水乙醇和去离子水在超声机各超声清洗30min，除去钛表面的杂质污垢；用hf(0.54mol/l)和hno
3 (0.29mol/l)的的配成的混合液(体积比为1：1)浸泡钛片，不断搅拌5min，除去表面不同成分的氧化钛膜，然后用去离子水超声清洗10min，氮气吹干置于干燥器中备用，得到酸预处理的钛片(pti)。
40.（3）医用钛表面活化：将酸预处理的钛片置于100ml的piranha溶液(体积比h2so4：h2o2=7：3)中，在60℃下进行反应30min，氧化处理构建富含羟基的氧化层的羟基化钛(ti-oh)，去离子水超声清洗10min，氮气吹干置于干燥器中备用。
41.（4）聚多巴胺修饰活化钛表面：配制浓度为2mg/ml的盐酸多巴胺溶液(ph=8．5，tris=10mm)，将ti-oh浸泡在盐酸多巴胺溶液中在37℃振荡反应24h。反应完成后，聚多巴胺修饰钛(ti-pda)分别在丙酮、无水乙醇和去离子水在超声机各超声清洗10min、氮气吹干置于干燥器中备用。
42.（5）丝素蛋白衍生肽的制备：将α-糜蛋白酶(酶与底物的比例为1：100)溶解在sf的水溶液中。在37℃下24h后形成凝胶状沉淀(cp组分)，离心、水洗2次后冷冻干燥。将上清液冻干，回收可溶性多肽(cs组分)。
43.（6）丝素蛋白衍生肽/羟基磷灰石复合涂层的制备：将cs粉末按照5mg/ml的比例，加入到去离子水中，得到含5%cs的水溶液。将所得的
溶液以15μl/cm2的比例均匀滴加到聚多巴胺修饰的钛表面，65℃烘干。所得样品直接进行电沉积，电解液(ph=4)由0.042 m ca(no3)2和0.025 m(nh4)h2po4组成。电极间距为2 cm，沉积时间为15min。样品充当阴极在室温下浸泡在电解液中沉积，然后取出并放入烘干箱中烘干。为了得到羟基磷灰石，沉积的钛片在60
°
c的10 mm tris缓冲液(ph=8.5)中浸泡2小时，然后用去离子水洗涤。
技术特征：
1.一种钛表面制备复合涂层的方法，其特征在于，步骤为：（1）再生丝素蛋白溶液的制备：将丝素纤维在cacl2/水/乙醇的三元溶液中，搅拌溶解成丝素蛋白混合溶液，在透析袋中用去离子水透析3-5天，去除杂质后离心除去不溶性颗粒，上清液保存在4℃，即得再生丝素蛋白溶液；（2）医用纯钛预处理：医用纯钛片分别用丙酮、无水乙醇和去离子水超声清洗，然后用hf和hno3的混合液浸泡钛片，除去表面不同成分的氧化钛膜，再用去离子水超声清洗，氮气吹干置于干燥器中备用，得到酸预处理的钛片pti；（3）医用钛表面活化：将酸预处理的钛片置于piranha溶液中，在55-65℃下反应25-40min，氧化处理构建富含羟基的氧化层的羟基化钛ti-oh，去离子水超声清洗，氮气吹干置于干燥器中；（4）聚多巴胺修饰活化钛表面：将ti-oh浸泡在盐酸多巴胺溶液中反应20-30h，反应完成后，分别在丙酮、无水乙醇和去离子水中超声清洗，氮气吹干置于干燥器中；（5）丝素蛋白衍生肽的制备：将α-糜蛋白酶溶解在sf的水溶液中，形成凝胶状沉淀cp组分，离心、水洗后冷冻干燥，将上清液冻干，回收可溶性多肽cs粉末；（6）复合涂层的制备：将cs粉末加入到得到的sf溶液中，然后均匀滴加到聚多巴胺修饰的钛表面，烘干后进行电沉积，电解液为钙磷比为1.67的ca(no3)2和 (nh4)h2po4的混合液，样品充当阴极在室温下浸泡在电解液中沉积，烘干后在tris缓冲液中浸泡，然后用去离子水洗涤，即得。2.根据权利要求1所述的钛表面制备复合涂层的方法，其特征在于，所述的三元溶液是由cacl2：水：乙醇按照摩尔比为1:8:2配成的混合溶液。3.根据权利要求1所述的钛表面制备复合涂层的方法，其特征在于，所述的透析袋截留分子量为8000-14000mw，去除杂质后，3000r/min离心5min除去不溶性颗粒。4.根据权利要求1所述的钛表面制备复合涂层的方法，其特征在于， 所述的hf的溶液浓度为0.54mol/l，hno3的浓度0.29mol/l，两者的体积比为1：1，钛片在搅拌条件下浸泡5min。5.根据权利要求1所述的钛表面制备复合涂层的方法，其特征在于，piranha溶液体积比为h2so4：h2o2=7：3。6.根据权利要求1所述的钛表面制备复合涂层的方法，其特征在于，所述的盐酸多巴胺溶液ph为8.5，tris为10mm。7.根据权利要求1所述的钛表面制备复合涂层的方法，其特征在于，所述的α-糜蛋白酶与底物的比例为1：100。8.根据权利要求1所述的钛表面制备复合涂层的方法，其特征在于，所述的cs粉末按照5mg/ml的比例加入到3 wt% sf溶液中，然后以15μl/cm2的比例均匀滴加到聚多巴胺修饰的钛表面，65℃烘干。9.根据权利要求1所述的钛表面制备复合涂层的方法，其特征在于，所述的电解液ph为4，由0.042 m ca(no3)2和0.025 m(nh4)h2po4混合制成，电极间距为2 cm，沉积时间为15min。
技术总结
本发明公开了一种钛表面制备复合涂层的方法，属于医用植入体材料技术领域，涉及钛植入体。步骤为：再生丝素蛋白溶液的制备；医用纯钛预处理，得到酸预处理的钛片pTi，置于Piranha溶液中，氧化处理构建富含羟基的氧化层的羟基化钛Ti-OH，在盐酸多巴胺溶液中反应；制备丝素蛋白衍生肽；将Cs粉末加入到SF溶液中，然后滴加到聚多巴胺修饰的钛表面，烘干后进行电沉积，然后用去离子水洗涤，即得。本发明复合涂层具有良好的间充质干细胞的相容性，能提高纯钛表面的生物活性和成骨活性，具有广泛的临床应用潜力，制备工艺较为简单，生产成本较低，具有较好的推广应用价值。具有较好的推广应用价值。具有较好的推广应用价值。
