一种改性生物炭固定化多环芳烃降解混合菌剂及其制备与应用
1.本发明属于环境污染生物处理技术领域，涉及一种改性生物炭固定化多环芳烃降解混合菌剂的及其制备及与应用。
背景技术：
2.多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，pahs)是一类广泛存在于环境中的有机污染物，由两个或两个以上稠合苯环组成的芳香族碳氢化合物，主要源于石油、煤等化石燃料以及木材、天然气、秸秆等有机物的不完全燃烧或在还原条件下经热分解而生成，土壤是环境中pahs的最终去向。多环芳烃具有长期残留性、生物蓄积性以及致癌、致畸、致突变的特性，由于高疏水性和高立体化学稳定性的特点，它极易在环境中累积并在食物链中进行富集，对人类的健康和生态环境的安全构成极大的威胁。环境中的pahs可通过呼吸道、皮肤、消化道进入人体，对肝、肾等脏器以及神经系统、生殖系统产生损害作用，且伤害人体免疫系统。因此，对pahs污染土壤的修复尤为重要。
3.微生物修复是一种低成本、高效益和环境友好的修复方法。然而，在实际应用中直接向污染土壤中投加游离微生物的修复方法，由于游离微生物难以适应复杂环境而不能有效发挥作用，导致游离微生物活性低，降解效果不理想。微生物固定化技术是微生物修复的一种，与游离微生物降解相比具有生物量高、不易流失和抗毒害能力强的优点，在pahs污染环境修复中受到广泛关注。
4.生物炭是由农业废弃物等生物质热解产生的富碳固体，具有多孔结构和大的比表面积，有利于微生物附着生长并能够抵御不良条件侵害。生物炭表面丰富的营养元素能为微生物生长提供营养。然而，有限的吸附能力限制了生物炭在实际中的应用。因此将改性生物炭作为固定化载体负载混合菌剂用于污染土壤中pahs修复是一种绿环保、且高效的修复技术。
技术实现要素：
5.本发明的首要目的在于提供一种改性生物炭固定化多环芳烃降解混合菌剂。
6.本发明的另一目的在于提供所述改性生物炭固定化多环芳烃降解混合菌剂的制备方法。
7.本发明的再一目的在于提供所述改性生物炭固定化多环芳烃降解混合菌剂的应用。
8.本发明的目的通过以下技术方案实现：
9.一种改性生物炭固定化多环芳烃降解混合菌剂，包括mno2改性生物炭、以及固定在mno2改性生物炭上的微生物菌，所述的微生物为恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)和黄孢原毛平革菌(phanerochaete chrysosporium burdsall)。
10.所述的mno2改性生物炭通过包括以下步骤的方法制备得到：将生物炭和mnso4加入
到水中充分混合，搅拌下再滴入kmno4溶液，混匀后静置老化，过滤、洗涤、干燥，得到mno2改性生物炭。其中，kmno4溶液的浓度优选为10-20g/l；mnso4与kmno4的摩尔比优选为1.5:1；静置老化的条件优选为室温静置24-48h；干燥的条件优选为80-90℃、7-9h。
11.所述的改性生物炭固定化多环芳烃降解混合菌剂的制备方法，包括以下步骤：将灭菌的mno2改性生物炭加入到灭菌的培养基中充分浸润，加入黄孢原毛平革菌和恶臭假单胞菌进行培养，得到改性生物炭固定化多环芳烃降解混合菌剂。其中，培养基与改性生物炭的比例优选为1-2ml/g；浸润的时间优选为10-15h；黄孢原毛平革菌和恶臭假单胞菌的加入比例优选为1:1。
12.进一步的，所述的改性生物炭固定化多环芳烃降解混合菌剂的制备方法中，以10％(w/w)的比例加入黄孢原毛平革菌悬液、恶臭假单胞菌悬液的混合菌悬浊液，适量补充培养基，在30℃条件下培养7-9d。其中，黄孢原毛平革菌悬液的密度优选为2
×
108cfu/ml，恶臭假单胞菌悬液的密度优选为2
×
108cfu/ml，黄孢原毛平革菌和恶臭假单胞菌的加入比例优选为1:1。
13.进一步的，所述的培养基的配方为：蔗糖4.0g/l，酵母膏0.3g/l，kh2po
4 0.05g/l，mgso4·
h2o 0.025g/l，(nh4)2hpo
4 0.2g/l，ph为7.1～7.2。
14.所述的改性生物炭固定化多环芳烃降解混合菌剂在降解多环芳烃中的应用。
15.所述的改性生物炭固定化多环芳烃降解混合菌剂在修复多环芳烃污染土壤中的应用。
16.进一步的，所述的多环芳烃包括萘、菲、芘。
17.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
18.(1)本发明采用mno2改性生物炭，提高了生物炭比表面积和吸附能力，使微生物可附着面积增加。另外，二氧化锰可以作为金属催化剂，提高生物炭对污染物的选择性和去除能力。
19.(2)本发明采用mno2改性生物炭，提高了菌剂的保存时间，相比于游离菌剂，30d后mno2改性生物炭固定化菌剂的酶活性明显更高。
20.(3)本发明采用mno2改性生物炭固定化多环芳烃降解混合菌剂对多环芳烃的降解率高，试验60天对萘的降解率达到99.3％；对菲的降解率达到95.26％；对芘的降解率达到63.06％。
21.(4)产品无毒，对环境友好。
附图说明
22.图1为本发明实施例提供的一种mno2改性生物炭固定化菌剂的制备方法的流程图。
23.图2为本发明实施例中处理的土壤酶活性分析图。
24.图3为游离混合菌剂、mno2改性生物炭固定化混合菌剂对萘污染土壤的去除性能。
25.图4为游离混合菌剂、mno2改性生物炭固定化混合菌剂对菲污染土壤的去除性能。
26.图5为游离混合菌剂、mno2改性生物炭固定化混合菌剂对芘污染土壤的去除性能。
具体实施方式
27.以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
28.下述实施例中所使用的恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)372-24m(cgmcc 1.1003)购于中国普通微生物菌种保藏管理中心、黄孢原毛平革菌(phanerochaete chrysosporium burdsall)bkmf-1767购于中国典型培养物保藏中心。
29.实施例1 mno2改性生物炭固定化混合菌剂的制备
30.一种mno2改性生物炭固定化菌剂的制备方法的流程如图1所示，其具备包括以下步骤：
31.(1)mno2改性生物炭的制备
32.将2.0g木质生物炭c和0.2333g mnso4·
h2o放入烧杯中，并加入100ml去离子水混合，将该悬浮液超声混合30min以确保两者充分接触。之后将烧杯放至磁力搅拌器上进行搅拌，将10ml去离子水溶解的kmno4(0.1454g)缓慢逐滴加入搅拌的悬浮液中，滴加过程中会发现黑的生物炭悬浮液中出现了暗棕沉淀，滴完之后再搅拌30min，然后将混合后的溶液于露天环境下静置老化24h，老化后的上清液清澈透明。最后用去离子水进行过滤、洗涤、抽滤，将所得粉末在80℃下干燥8h，得到改性比为1:10的mno2改性生物炭mn-c(1:10)。
33.(2)mno2改性生物炭固定化混合菌剂的制备
34.配制固定化增殖培养基：称取4.0g蔗糖、0.3g酵母膏、0.05g kh2po4、0.025g mgso4·
h2o、0.2g(nh4)2hpo4，溶解于1000ml蒸馏水中，调节ph为7.1～7.2，于121℃条件下灭菌20min。
35.称取一定量实施例1制备的mno2改性生物炭于锥形瓶中进行灭菌，以1ml/g的比例加入灭菌后的固定化增殖培养基，浸润12h。以10％(w/w)的比例加入黄孢原毛平革菌(真菌)和恶臭假单胞菌(细菌)悬液的混合菌悬浊液，黄孢原毛平革菌悬液密度为2
×
108cfu/ml，恶臭假单胞菌悬液密度为2
×
108cfu/ml，混合菌接种比例为1:1，适量补充增殖培养基，在培养箱中30℃培养7d，得到mno2改性生物炭固定化混合菌剂。将制备的固定化混合菌剂用去离子水洗涤三次，再悬浮在去离子水中。
36.实施例2 mno2改性生物炭固定化混合菌剂降解萘的性能
37.(一)模拟污染土壤的配制
38.于湖北省武汉市郊区取用农用土壤为供试土壤。选取具有代表性的pahs萘进行人工土壤染毒。配制一定浓度萘的丙酮溶液，加入土壤中，于通风橱中每天进行翻堆搅拌，老化该土壤一到两周，最终得到萘含量皆为20mg/kg的污染土壤。本实验有三个处理组，分别在烧杯中加入200g污染土壤，每个处理组做3份平行实验，加去离子水以保持土壤含水量50％。
39.(二)方法
40.三个处理组分别为空白组、加入50ml游离混合菌和50ml实施例2制备的mno2改性生物炭固定化混合菌剂(固定混合菌)，其中，两种混合菌液中黄孢原毛平革菌的密度均为1
×
108cfu/ml，恶臭假单胞菌的密度均为1
×
108cfu/ml。在30℃黑暗环境中进行为期60d的降解试验。培养30天时取样部分土壤用于土壤酶活性检测，结果如图2所示。在第7、14、21、60天检测土壤中萘的浓度，降解试验结果如图3所示。
41.通过比较三个处理组的酶活性，加入mno2改性生物炭固定化混合菌剂的处理组明显较高，并且对萘的降解效果最好，试验60d的降解率达到99.3％，表明采用mno2改性生物炭固定化混合菌剂可以有效提高混合菌在土壤中的活性，对土壤中的萘具有良好的降解效果。
42.实施例3 mno2改性生物炭固定化混合菌剂降解菲的性能
43.(一)模拟污染土壤的配制
44.于湖北省武汉市郊区取用农用土壤为供试土壤。选取具有代表性的pahs菲进行人工土壤染毒。配制一定浓度菲的丙酮溶液，加入土壤中，于通风橱中每天进行翻堆搅拌，老化该土壤一到两周，最终得到菲含量为40mg/kg的污染土壤。本实验有三个处理组，分别在烧杯中加入200g污染土壤，每个处理组做3份平行实验，加去离子水以保持土壤含水量50％。
45.(二)方法
46.三个处理组分别为空白组、加入50ml游离混合菌和50ml实施例2制备的mno2改性生物炭固定化混合菌剂(固定混合菌)，其中，两种混合菌液中黄孢原毛平革菌的密度均为1
×
10
8c
fu/ml，恶臭假单胞菌的密度均为1
×
108cfu/ml。在30℃黑暗环境中进行为期60d的降解试验，培养30天时取样部分土壤用于土壤酶活性检测，结果如图2所示。在第7、14、21、60天检测土壤中菲的浓度，结果如图4所示。
47.通过比较三个处理组的酶活性，加入mno2改性生物炭固定化混合菌剂的处理组明显较高，对菲的降解效果最好，试验60d的降解率达到95.26％，表明mno2改性生物炭固定化混合菌剂可以有效提高混合菌在土壤中的活性，对土壤中的菲具有良好的降解效果。
48.实施例4 mno2改性生物炭固定化混合菌剂降解芘的性能
49.(一)模拟污染土壤的配制
50.于湖北省武汉市郊区取用农用土壤为供试土壤。选取具有代表性的pahs芘进行人工土壤染毒。配制一定浓度芘的丙酮溶液，加入土壤中，于通风橱中每天进行翻堆搅拌，老化该土壤一到两周，最终得到芘含量为60mg/kg的污染土壤。加去离子水以保持土壤含水量50％。本实验有三个处理组，每在烧杯中加入200g污染土壤，每个处理组做3份平行实验，加去离子水以保持土壤含水量50％。
51.(二)方法
52.三个处理组分别为空白组、加入50ml游离混合菌和50ml实施例2制备的mno2改性生物炭固定化混合菌剂(固定混合菌)，其中，两种混合菌液中黄孢原毛平革菌的密度均为1
×
10
8c
fu/ml，恶臭假单胞菌的密度均为1
×
108cfu/ml。在30℃黑暗环境中进行为期60d的降解试验，培养30天时取样部分土壤用于土壤酶活性检测，结果如图2所示。在第7、14、21、60天检测土壤中芘的浓度，结果如图5所示。
53.通过比较三个处理组的酶活性，加入mno2改性生物炭固定化混合菌剂的处理组明显较高，对芘的降解效果最好，试验60d的降解率达到63.06％，表明mno2改性生物炭固定化混合菌剂可以有效提高混合菌在土壤中的活性，对土壤中芘具有良好的降解效果。
54.上述实施例2-4中的模拟土壤为萘、菲、芘三种污染物同时处理的土壤，分别分析了三种污染物的降解效果。
55.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的
限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：
1.一种改性生物炭固定化多环芳烃降解混合菌剂，其特征在于：包括mno2改性生物炭、以及固定在mno2改性生物炭上的微生物菌，所述的微生物为恶臭假单胞菌和黄孢原毛平革菌。2.根据权利要求1所述的改性生物炭固定化多环芳烃降解混合菌剂，其特征在于：所述的mno2改性生物炭通过包括以下步骤的方法制备得到：将生物炭和mnso4加入到水中充分混合，搅拌下再滴入kmno4溶液，混匀后静置老化，过滤、洗涤、干燥，得到mno2改性生物炭。3.根据权利要求2所述的改性生物炭固定化多环芳烃降解混合菌剂，其特征在于：所述的kmno4溶液的浓度为10-20g/l。4.根据权利要求2所述的改性生物炭固定化多环芳烃降解混合菌剂，其特征在于：mnso4与kmno4的摩尔比为1.5:1。5.根据权利要求2所述的改性生物炭固定化多环芳烃降解混合菌剂，其特征在于：所述的静置老化的条件为室温静置24-48h；所述的干燥的条件为80-90℃、7-9h。6.权利要求1-5任一项所述的改性生物炭固定化多环芳烃降解混合菌剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将灭菌的mno2改性生物炭加入到灭菌的培养基中充分浸润，加入黄孢原毛平革菌和恶臭假单细胞菌进行培养，得到改性生物炭固定化多环芳烃降解混合菌剂。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：培养基与改性生物炭的比例为1-2ml/g；浸润的时间为10-15h；黄孢原毛平革菌和恶臭假单细胞菌的加入比例为1:1。8.权利要求1-5任一项所述的改性生物炭固定化多环芳烃降解混合菌剂在降解多环芳烃中的应用。9.权利要求1-5任一项所述的改性生物炭固定化多环芳烃降解混合菌剂在修复多环芳烃污染土壤中的应用。10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述的多环芳烃包括萘、菲、芘。
技术总结
本发明公开了一种改性生物炭固定化多环芳烃降解混合菌剂及其制备与应用，属于环境污染生物处理技术领域。本发明的改性生物炭固定化多环芳烃降解混合菌剂包括MnO2改性生物炭、以及固定在MnO2改性生物炭上的微生物菌，所述的微生物为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium burdsall)。本发明的菌剂具有良好的生物活性，可实现对土壤中多环芳烃的高效降解。效降解。效降解。
