两种ER阳性HER-2阴性乳腺癌CDK4/6抑制剂耐药株及其构建方法和用途
两种er阳性her-2阴性乳腺癌cdk4/6抑制剂耐药株及其构建方法和用途
技术领域
1.本发明属于生物医学技术领域，具体涉及两种er阳性her-2阴性乳腺癌cdk4/6抑制剂耐药株及其构建方法和用途。
背景技术：
2.目前主要的体外诱导耐药株的方式有两种：化疗药物间歇刺激法与梯度递增法。药物浓度递增法，从低浓度开始，一般为亲本株ic50，逐渐增加药物浓度，最终使得细胞能够在一定浓度的药物的培养液中持续稳定生长并传代。剂量循序渐进，细胞培养的外环境逐渐改变，细胞较易耐受，状态较好，缺点在于诱导耐药过程耗时很长，且其化疗药物的作用方式与临床上化疗药物大剂量短疗程的化疗原则存在一定的差异；药物大剂量间歇冲击法，优点是与临床上大剂量化疗药物冲击的方式相接近，但是缺点在于大剂量药物冲击法的药物浓度很高，细胞培养由于外环境骤变，细胞可能难以耐受，细胞状态较难控制，给予细胞较高浓度的抗肿瘤药物，作用短暂时间后换用不含药物的培养基让其继续生长且耐药性能不稳定。因此需要对这两种诱导方法进行改进，以期获得更加有效的体外诱导耐药方法。
3.cdk4/6抑制剂作用靶点为cdk4/6-cyclind复合物，抑制其活性，从而抑制下游的rb的磷酸化，抑制e2f转录因子释放，从而使细胞阻滞在g1期，影响细胞增殖。
4.mcf-7和t47d细胞是乳腺癌细胞株，该细胞株er阳性、her-2均为阴性，属于er阳性her-2阴性乳腺癌细胞株。该细胞株是目前研究乳腺癌，特别是er阳性乳腺癌十分常用的一种细胞株。国内外建立乳腺癌对高剂量cdk4/6抑制剂乳腺癌的耐药细胞株仍较少见，也只见于低剂量的cdk4/6抑制耐药株对于由高剂量cdk4/6抑制剂间歇冲击联合剂量递增诱导的er阳性乳腺癌耐药细胞株未见报道。建立该细胞株能够为肿瘤耐药相关研究提供必要的研究模型，具有实用价值。
技术实现要素：
5.本发明的目的在于提供两种er阳性her-2阴性乳腺癌细胞耐药细胞株cdk4/6i-r-mcf-7、cdk4/6i-r-t47d及其制备方法和应用。
6.本发明所采取的技术方案是：
7.本发明的第一方面，提供一种er阳性her-2阴性乳腺癌cdk4/6抑制剂耐药株，所述耐药株命名为人乳腺癌细胞耐药株cdki-r-mcf-7；保藏编号为cctcc no：c202297。
8.本发明的第二方面，提供一种er阳性her-2阴性乳腺癌cdk4/6抑制剂耐药株，所述耐药株命名为人乳腺癌细胞耐药株cdki-r-t47d；保藏编号为cctcc no：c202295。
9.在本发明的一些实施方式中，所述cdk4/6抑制剂为帕博西利和/或阿贝西林。
10.本发明的第三方面，提供本发明第一方面或第二方面所述的耐药株在筛选、制备抗肿瘤药物中的应用。
11.本发明的第四方面，提供本发明第一方面或第二方面所述的耐药株在筛选、制备肿瘤耐药逆转药物中的应用。
12.本发明的第五方面，提供本发明第一方面或第二方面所述的耐药株在筛选、制备化疗药物中的应用。
13.本发明的第六方面，提供本发明第一方面或第二方面所述的耐药株在构建肿瘤耐药模型中的应用。
14.本发明的第七方面，提供本发明第一方面或第二方面所述的耐药株在肿瘤耐药机制及其相关信号通路的研究中的应用。
15.在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤为乳腺癌。
16.本发明的第八方面，提供本发明第一方面或第二方面所述的耐药株的制备方法，以er阳性her-2阴性乳腺癌细胞株为亲本细胞，采用浓度逐步提高的cdk4/6抑制剂诱导，获得er阳性her-2阴性乳腺癌cdk4/6抑制剂耐药株。
17.在本发明的一些实施方式中，所述er阳性her-2阴性乳腺癌细胞株为mcf-7和t47d7细胞株。
18.在本发明的一些实施方式中，所述制备方法的具体步骤为：
19.(1)将er阳性her-2阴性乳腺癌细胞培养至对数生长期，在培养基中加入cdk4/6抑制剂至5μm/l；
20.(2)用1μm/l的药物浓度维持直至存活细胞能在此浓度稳定生长、传代；
21.(3)传一代后继续予以5μm/l直至存活细胞能在此浓度稳定生长、传代；
22.(4)增加培养基中cdk4/6抑制剂的有效浓度，直至存活细胞能在此浓度稳定生长、传代；
23.(5)重复步骤(2)～(4)直到获得能在15μm/l cdk4/6抑制剂中稳定生长、传代及复苏的细胞株。
24.在本发明的一些实施方式中，步骤(1)、(2)、(3)的培养条件为：32～42℃、3～7％co2、90～98％湿度条件。
25.在本发明的一些实施方式中，步骤(2)中，每次增加的cdk4/6的浓度为5μm/l。
26.本发明采用人er阳性乳腺癌细胞株mcf-7为诱导对象，采用药物高剂量间歇冲击联合逐步递增cdk4/6抑制剂(帕博西利、阿贝西林)浓度，持续作用的体外诱导法建立了人er阳性乳腺癌耐药细胞株cdk4/6i-r-mcf-7、cdk4/6i-r-t47d耐药株。遵循的原则为：
27.(1)采取阶段性强刺激的给药模式，将整个诱导周期分为多个阶段，每个阶段采取高剂量给药，并将每一阶段分为诱导期和复苏期两个部分，诱导期的主要目的是选择耐药细胞，淘汰敏感细胞；而复苏期的目的是实现耐药性的传递和耐药细胞的扩增。在下一阶段，将采用更高强度的给药方式，强度的提升是大跨度的，这也是有别于传统梯度递增法中的地方。
28.(2)给药强度控制标准。在阶段性强刺激的给药模式下，给药强度的控制是最为关键的环节。通过给药时间和终浓度来作为控制手段，最佳的给药强度以形成阶段性的单克隆耐药落为标准。诱导期间大量的敏感株被淘汰，极少数的耐药性细胞得以被选择，而复苏期间，这些耐药性细胞因具有选择优势而得以增殖，形成以单克隆耐药落为特点的扩增形式，从而保证耐药性的有效传递。
29.本发明一种改良的体外诱导耐药方法在诱导周期上是阶段性的，在给药强度上是大跨度的，以形成阶段性的耐药性单克隆落为特点，从而降低了损失率，大大提高了筛选效率，实现了间歇刺激法与梯度递增法两种传统诱导耐药方法的整合。
30.本发明的有益效果是：
31.本发明提供了两种er阳性乳腺癌耐药细胞株cdk4/6i-r-mcf-7、cdk4/6i-r-t47d，保藏编号分别为cctcc no：c202297、cctcc no：c202295；本发明通过细胞形态学观察、生长曲线、细胞耐药指数测定、评价er阳性乳腺癌耐药细胞株cdk4/6i-r-mcf-7、cdk4/6i-r-t47d的生物学特性，证实了本发明成功建立了cdk4/6i-r-mcf-7、cdk4/6i-r-t47d耐药株，对帕博西利的耐药指数(ri)为10、9.19，属于高度耐药；除帕博西利之外，对阿贝西林具有交叉耐药，对阿贝西林耐药指数(ri)分别为3.83、4.69；可用于提供耐药肿瘤细胞模型、研究耐药肿瘤细胞形态学及生物学特点、研究肿瘤耐药机制、分析化疗药物敏感性及筛选化疗药物、制备抗肿瘤药物开发肿瘤耐药逆转药物、研发更有效的肿瘤方法等；具有较高的生产和应用价值。
附图说明
32.图1是本发明实施中2倒置显微镜下cdk4/6i-r-mcf-7细胞观察图(
×
200)。
33.图2是本发明实施例2中倒置显微镜下cdk4/6i-r-t47d细胞观察图(
×
200)。
34.图3是本发明实施例2中mtt法检测帕博西利(palbo)作用mcf-7亲本株组细胞及cdk4/6i-r-mcf-7细胞72h的增殖抑制率示意图。
35.图4是本发明实施例2中mtt法检测帕博西利(palbo)作用t47d亲本株组细胞及cdk4/6i-r-t47d细胞72h的增殖抑制率示意图。
36.图5是实施例2中流式细胞学检测mcf-7亲本株和cdk4/6i-r-mcf-7组细胞未处理组和帕博西利(palbo)处理组的细胞周期各阶段细胞比例统计。
37.图6是实施例2中流式细胞学检测t47d亲本株和耐药株cdk4/6i-r-t47d细胞未处理组和帕博西利(palbo)处理组的细胞周期各阶段细胞比例统计。
38.图7是本发明实施例2中mtt法检测阿贝西林(abema)作用mcf-7亲本株组细胞及cdk4/6i-r-mcf-7细胞72h的增殖抑制率示意图。
39.图8是本发明实施例2中mtt法检测帕博西利(abema)作用t47d亲本株组细胞及cdk4/6i-r-t47d细胞72h的增殖抑制率示意图。
具体实施方式
40.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
41.实施例1:人er阳性乳腺癌耐药细胞株cdk4/6i-r-mcf-7、cdk4/6i-r-t47d的诱导建立
42.本发明涉及的人er阳性乳腺癌帕博西利耐药细胞株cdk4/6i-r-mcf-7、cdk4/6i-r-t47d是按照如下方法建立获得：
43.(1)人er阳性乳腺癌mcf-7和t47d细胞株，复苏后用dmem培养液(含10％胎牛血清、青霉素100u/ml、链霉素100μg/ml)，于37℃、5％co2、95％湿度条件下培养；
44.(2)取对数生长期mcf-7细胞，换新鲜培养液，加入帕博西利(帕博西利冻干粉购自apexbio，批号：827022-32-2)，使其作用浓度为5μm/l，在37℃、5％co2、95％湿度条件下继续培养24小时后换液；
45.(3)用1μm/l的药物浓度维持直至存活细胞能在此浓度稳定生长、传代；
46.(4)传一代后继续予以5μm/l直至存活细胞能在此浓度稳定生长、传代；
47.(5)增加帕博西利的作用浓度(5μm/l-15μm/l)，每次增加的浓度为5μm/l，在37℃、5％co2、95％湿度条件下继续培养，24小时换液维持药物浓度直至存活细胞能在此浓度稳定生长、传代；
48.(6)重复步骤(3)、(4)、(5)直到获得能在15μmol/l、帕博西利中稳定生长、传代及复苏的cdk4/6i-r-mcf-7、cdk4/6i-r-t47d细胞株。
49.在诱导过程中，掌握适当的帕博西利增加浓度非常重要，理想状况是既通过增加药物浓度筛选出少数耐药细胞又不至于使全部细胞死亡，从而不断获得有更高耐药性的mcf-7和t47d细胞。经过探索，优选采用每阶段增加5μm/l帕博西利的方法取得了较好效果，历时7个月建立了cdk4/6i-r-mcf-7、cdk4/6i-r-t47d细胞株。并将得到的cdk4/6i-r-mcf-7、cdk4/6i-r-t47d细胞株于中国典型培养物保藏中心进行保藏，其中cdk4/6i-r-mcf-7的分类命名为人乳腺癌细胞耐药株cdki-r-mcf-7，保藏编号为cctcc no：c202297；cdk4/6i-r-t47d细胞株的分类命名为人乳腺癌细胞耐药株cdki-r-t47d，保藏编号为cctcc no：c202295；保藏时间为2022年7月19日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。
50.当细胞依次对5μm/l、10μm/l、15μm/lcdk4/6抑制剂帕博西利稳定耐药后，及时冻存该浓度耐药细胞于液氮中。冻存液由15％胎牛血清、5％dmso、80％l15培养液组成，冻存过程逐步降温，采取4℃30分钟
→
20℃1小时
→‑
80℃过夜
→
液氮的顺序进行。冻存细胞的复苏按以下程序进行：在一个25cm2的细胞培养瓶中加入至少10ml含10％胎牛血清的培养液；从液氮中取出装有细胞的冻存管，立即放入37℃水浴轻轻摇动使冻存物在1分钟内解冻，用酒精棉球擦拭冻存管外壁后拿入超净台；将解冻后的细胞悬液移入已加了培养液的培养瓶中，稍加摇动混匀，拧松瓶盖，平放入二氧化碳培养箱中，在37℃、5％co2、95％湿度条件下培养，约24小时细胞贴壁后换新鲜培养液3-5ml继续培养。
51.实施例2：人er阳性乳腺癌耐药细胞株cdk4/6i-r-mcf-7、cdk4/6i-r-t47d进行形态学观察及生物学特性鉴定
52.1、倒置相差显微镜观察细胞形态
53.cdk4/6i-r-mcf-7、cdk4/6i-r-t47d细胞经0.25％胰酶消化后，分别接种于6孔细胞培养板，每孔含有5
×
105个细胞，加入含10％特级胎牛血清的dmem培养基，置于37℃、5％co2的培养箱中培养24h，取对数生长期细胞，更换含有5μm/ml帕博西利的培养基，继续在37℃、5％co2的培养箱中培养24h后，在倒置相差显微镜下拍照，观察活细胞的形态，结果如图1所示，在倒置相差显微镜下观察活细胞形态并照像。可见cdk4/6i-r-mcf-7细胞呈多角形，细胞大小、形态均发生变化；cdk4/6i-r-t47d细胞细胞大小、形态均发生变化，细胞更细长，细胞内尤其是近胞膜处有较多深物质聚集(如图2所示)。
54.2、mtt法(又称mtt比法，是一种检测细胞存活和生长的方法)测定细胞耐药指数
(ic50、抑制率、耐药指数)分别取对数生长期mcf-7细胞和cdk4/6i-r-mcf-7细胞、t47d细胞和cdk4/6i-r-t47d细胞，细胞消化、计数接种于96孔培养板中，3000个细胞/孔，加入100μl培养基。置37℃、co2体积分数为5％的恒温培养箱中培养。培养24h后，用完全培养基稀释药物至所需浓度，mcf-7细胞和cdk4/6i-r-mcf-7细胞每孔加入100μl含有10％胎牛血清的dmem的含帕博西利培养基、t47d细胞和cdk4/6i-r-t47d细胞每孔加入100μl含有10％胎牛血清的1640的含帕博西利培养基。每组都设3个复孔，并设置调零孔(只含相应培养液，无细胞)和对照孔(只含细胞、培养液)。96孔细胞培养板置于37℃，5％co2培养箱中培养72小时后，每孔加入mtt(5mg/ml)10μl/孔，继续培养4h，小心吸弃培养液和mtt(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)溶液，加入dmso(二甲基亚砜)100μl/孔，振荡10分钟使充分溶解显。用全波长酶标仪测定吸光度值(a490)，实验重复3次，取平均值。按下式计算细胞生长抑制率。
55.生长抑制率＝(1-药物组吸光度/对照组吸光度)
×
100％；
56.根据生长抑制率，采用prism 8软件计算药物半数抑制浓度(ic50)，并按下式计算耐药指数(ri)。ri＝耐药细胞ic50/亲本细胞ic50，分析表明，mtt法检测mcf-7细胞和cdk4/6i-r-mcf-7细胞、t47d细胞和cdk4/6i-r-t47d细胞对帕博西利的ic50分别为1.05μm/l、10.5μm/l、0.8432μm/l和7.748μm/l。cdk4/6i-r-mcf-7细胞和cdk4/6i-r-t47d细胞对帕博西利的耐药指数(ri)分别为10、9.19，属于高度耐药(图3、图4)。
57.3、pi法检测细胞周期：收集对数生长期帕博西利处理24小时的mcf-7亲本株细胞和cdki-r-mcf-7及各自未处理细胞1
×
106个，用4℃保存的pbs洗涤细胞3次，弃上清，加入预冷的70％乙醇1ml并快速轻柔吹打细胞后置入-20℃冰箱2小时以上，充分固定细胞。850g，4℃离心5min，弃上清，加入pbs洗涤细胞2次，加入pi染液500μl，并充分吹打均匀，常温染0.5h，重悬细胞后用流式细胞仪检测，检测时激发波长为488nm，发射波长为575nm。流式细胞仪结果通过modfit软件进行细胞周期曲线拟合，统计细胞周期各阶段细胞比例，如图5、图6；帕博西利药物处理后，亲本细胞株g1期细胞显高于各自耐药细胞株(p值小于0.05)，说明亲株本细胞细胞周期发生了g1阻滞，而耐药株没有。图5、图6说明了cdk4/6抑制剂对耐药株无明显的周期抑制。
58.4、mtt法(又称mtt比法，是一种检测细胞存活和生长的方法)测定细胞耐药指数(ic50、抑制率、耐药指数)分别取对数生长期mcf-7细胞和cdk4/6i-r-mcf-7细胞、t47d细胞和cdk4/6i-r-t47d细胞，细胞消化、计数接种于96孔培养板中，3000个细胞/孔，加入100μl培养基。置37℃、co2体积分数为5％的恒温培养箱中培养。培养24h后，用完全培养基稀释药物至所需浓度，mcf-7细胞和cdk4/6i-r-mcf-7细胞每孔加入100μl含有10％胎牛血清的dmem的含阿贝西利培养基、t47d细胞和cdk4/6i-r-t47d细胞每孔加入100μl含有10％胎牛血清的1640的含阿贝西利培养基。每组都设3个复孔，并设置调零孔(只含相应培养液，无细胞)和对照孔(只含细胞、培养液)。96孔细胞培养板置于37℃，5％co2培养箱中培养72小时后，每孔加入mtt(5mg/ml)10μl/孔，继续培养4h，小心吸弃培养液和mtt(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)溶液，加入dmso(二甲基亚砜)100μl/孔，振荡10分钟使充分溶解显。用全波长酶标仪测定吸光度值(a490)，实验重复3次，取平均值。按下式计算细胞生长抑制率。
59.生长抑制率＝(1-药物组吸光度/对照组吸光度)
×
100％
60.根据生长抑制率，采用prism 8软件计算药物半数抑制浓度(ic50)，并按下式计算耐药倍数(ri)。ri＝耐药细胞ic50/亲本细胞ic50分析表明，mtt法检测mcf-7细胞和cdk4/6i-r-mcf-7细胞对阿贝西利的ic50分别1.104μm/l、4.229μm/l；t47d细胞和cdk4/6i-r-t47d细胞对阿贝西利的ic50分别为1.198μm/l、5.622μm/l。cdk4/6i-r-mcf-7细胞和cdk4/6i-r-t47d细胞的耐药指数(ri)分别为3.83、4.69，具有耐药性(图7、图8)。
61.综上，说明本高剂量耐药株不仅对帕博西利耐药，且对其他cdk4/6抑制剂具有耐药性，具有交叉耐药特性。
62.上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
技术特征：
1.一种er阳性her-2阴性乳腺癌cdk4/6抑制剂耐药株，所述耐药株命名为人乳腺癌细胞耐药株cdki-r-mcf-7；保藏编号为cctcc no：c202297。2.一种er阳性her-2阴性乳腺癌cdk4/6抑制剂耐药株，所述耐药株命名为人乳腺癌细胞耐药株cdki-r-t47d；保藏编号为cctcc no：c202295。3.根据权利要求1或2所述的耐药株，其特征在于，所述cdk4/6抑制剂为帕博西利和/或阿贝西林。4.权利要求1～3任一项所述的耐药株在筛选、制备抗肿瘤药物中的应用。5.权利要求1～3任一项所述的耐药株在筛选、制备肿瘤耐药逆转药物中的应用。6.权利要求1～3任一项所述的耐药株在筛选、制备化疗药物中的应用。7.权利要求1～3任一项所述的耐药株在构建肿瘤耐药模型中的应用。8.权利要求1～3任一项所述的耐药株在肿瘤耐药机制及其相关信号通路的研究中的应用。9.根据权利要求4～8任一项所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为乳腺癌。10.权利要求1～3任一项所述的耐药株的制备方法，以er阳性her-2阴性乳腺癌细胞株为亲本细胞，采用浓度逐步提高的cdk4/6抑制剂诱导，获得er阳性her-2阴性乳腺癌cdk4/6抑制剂耐药株。
技术总结
本发明公开了两种ER阳性HER-2阴性乳腺癌CDK4/6抑制剂耐药株及其构建方法和用途；所述耐药株命名为人乳腺癌细胞耐药株CDKi-R-MCF-7、人乳腺癌细胞耐药株CDKi-R-T47D；CDKi-R-MCF-7和CDKi-R-T47D耐药株对帕博西利的耐药指数(RI)分别为10、9.19，属于高度耐药；除帕博西利之外，对阿贝西林具有交叉耐药，对阿贝西林耐药指数(RI)分别为3.83、4.69；可用于提供耐药肿瘤细胞模型、研究肿瘤耐药机制、分析化疗药物敏感性及筛选化疗药物、制备抗肿瘤药物、开发肿瘤耐药逆转药物、研发更有效的肿瘤方法等；具有较高的生产和应用价值。具有较高的生产和应用价值。
