chaps

去污剂：TritonX

在生物学或生物化学实验室使用的去污剂都是作用比较温和的表

面活性剂（=表面活性成分），是用来破坏细胞膜（裂解细胞）以释放

细胞内的可溶性物质。它们可以破坏蛋白质-蛋白质、蛋白质-脂质、

脂质-脂质之间的连接，使蛋白质发生结构上的变性，防止蛋白质结晶，

另外在免疫学实验中还可避免非特异性吸附。去污剂根据其特性可以

分为好几类，因此科学研究中去污剂的选择很关键，取决于后续研究

的具体内容。

实际应用中有众多不同的去污剂可以选择。为了某些特殊的应用，

新的去污剂被不断开发出来[1]。在这篇综述中，对一些最常用的去污

剂的特点和应用进行了论述。

去污剂是由一个疏水尾端基团和一个极性亲水头端基团组成的有

机化合物（图一A）。在一定的温度条件下，以特定浓度溶解于水时，

去污剂分子会形成胶束，疏水基团部分位于胶束内部，而极性亲水基

团则在其外部（图一B）。因此，胶束的疏水中心会结合到蛋白的疏水

区域。一个胶束中，去污剂分子的聚集数目，是用来评价膜蛋白溶解

度的一个重要参数[2]。去污剂分子疏水区域的长度和其疏水性成正比，

且去污剂的疏水区域非常恒定，而极性头端亲水基团是可变的，可据

其特点，把去污剂分为三类：离子型（阴离子或阳离子型），两性离

子型和非离子型（见表一）。在特定的温度下，表面活性剂分子缔合

形成胶束的最低浓度，称之为临界胶束浓度（CMC）。当去污剂低于

临界胶束浓度时，只有单体存在；当高于临界胶束浓度时，胶束、单

体以及其余不溶于水的非胶束相共存。同样，胶束形成的最低温度称

为临界胶束温度（CMT）。因此，温度和浓度是去污剂两相分离和溶

解性的重要参数。一般来说，低亲脂或憎油的去污剂的临界胶束浓度

会较高。

种类化合物

离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS），脱氧胆酸钠，胆酸钠，肌氨酸

非离子去污tritonX-100，十二烷基麦芽糖苷，洋地黄皂苷，tween

剂20，tween80

两性离子去

污剂

CHAPS

离液剂尿素

表一：去污剂的分类。

离子去污剂

离子去污剂是由一个亲水链和一个阳离子或阴离子的极性头端基

团组成。此类去污剂的临界胶束浓度一般高于非离子去污剂。此类去

污剂活性较强。

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图1.去污剂单体的一般结构，改编自Anatrace。

十二烷基硫酸钠（SDS）阴离子去污剂SDS是一种非常高效的表

面活性剂，几乎可以使所有的蛋白质溶解。它可以破坏蛋白质的非共

价键，从而使蛋白质变性，并丧失天然构象和功能。SDS以质量比

1.4:1与蛋白质结合（或一个SDS阴离子结合二个氨基酸分子），因此

即使蛋白质样品处于等电点，SDS也能掩饰蛋白质此带电情况，使其

带负电。这是被广泛使用的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理所在。通

常，为了在SDS存在时完全裂解细胞，样品必须经过超声处理或若干

次通过19G的针头，从而确保DNA的完全降解。SDS会使蛋白质变

性并破坏其三维结构，因此当研究中需要蛋白质的活性或蛋白质的相

互作用存在时，不能使用SDS。当使用离子去污剂时，此外还要注意

一些事项，因为在不同离子强度的缓冲液中，它们的特性会随之改变

（比如说，当氯化钠浓度从0增加到500mM时，去污剂的临界胶束

浓度会从8mM降至0.5mM。另外，SDS在温度较低时会发生沉淀，

这是因为它属于去污剂中临界胶束温度最高的一种，而且这种沉淀现

象在钾盐存在的情况下会更加明显。SDS的这种特性可以用来去除蛋

白质样品中的SDS[3]。

脱氧胆酸钠和胆酸钠即使没有一个极性头端基团，但是也归入离

子去污剂的类别，是因为它们的极性基团分布在分子链的各个部分。

它们可以用来溶解细胞膜。

由于离子去污剂存在极性头部基团，因此不能通过离子交换色谱

法去除它。

非离子去污剂

非离子型去污剂和离子型不同，它们的头端基团是没有极性的亲

水基团。它们被认为是比较温和的表面活性剂，它们可以破坏蛋白质-

脂质以及脂质-脂质之间的连接，但是不能破坏蛋白质-蛋白质的连接，

而且大多非离子去污剂不能使蛋白质变性。因此，这种去污剂可以使

蛋白质溶解和分离，但却保留了蛋白质的天然构象、功能以及它们的

相互作用。在分离膜蛋白的应用中，这是此类去污剂的优势所在。

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图2.一些常用去污剂的结构和原理，改编自G-

Biosciences。

Triton家族

TritonX-100是一个非离子表面活性剂的重要代表，并应用于大

多免疫沉淀实验中。这个家族的所有成员(TritonX100,TritonX114,

NonidetP40,IgepalCA-630)非常相似，仅仅在每个胶束(分别为9.6,

8.0,9.0and9.5）的平均单体数量和基于PEG的头端基团的大小分布

上有区别[4]。TritonX100来源于聚氧乙烯，并含有一个苯基疏水基

团。TritonX100临界胶束浓度较低，因此不易通过透析法去除。其浊

点是64摄氏度，在此温度下，可以观察到两相分离。

十二烷基麦芽糖苷（DDM）

十二烷基麦芽糖苷（DDM）是一种糖苷表面活性剂，越来越多地

被用来分离需要保留活性的疏水性膜蛋白。已证明在此应用中，DDM

比CHAPS或NP-40要高效地多[5]。DDM糖链的亲脂位点、

0.17mM的高临界胶束浓度以及在胶束界面形成的水样的微环境，这

对于溶解和保持细胞膜疏水蛋白的稳定性非常关键。

洋地黄皂苷

从紫色毛地黄（洋地黄紫癜）中提取，可以用于分离真核细胞膜

疏水蛋白。肌氨酸和TritonX-100可以溶解细菌内部蛋白，但不是外

部的细菌胞膜。

Tween家族

Tween-20和Tween-80是具有脂肪酸的酯基团和长聚氧乙烯链

的聚山梨酯表面活性剂。它们临界胶束浓度很低，一般都是温和的表

面活性剂，不仅不影响蛋白质活性，而且溶解蛋白的能力也高。它们

不是细胞裂解液的常见组分，但是通常见于免疫印迹和酶联免疫吸附

实验中的洗涤缓冲液，因为它们可以最大程度地减少非特异性结合的

抗体以及去除不结合的部分。

大多数离子去污剂会干扰紫外线（UV)分光光度法，特别是Triton

X100，因为此类去污剂都含有一个可以吸收紫外线的苯环。因此，

280nm紫外线波长下检测蛋白质吸光度会变的不准确。

两性离子去污剂

两性离子去污剂头端基团是亲水性，含有正负电荷各一个，因此

呈现电中性。它们一般是比非离子型更强烈的表面活性剂。最典型的

例子是3-1-烷磺酸，它比CHAPS更常见。它的临界胶束浓度（室温

下6mM）高，可以通过透析的方法高效去除。在2-4%浓度的等电聚

焦和二维电泳的样品制备中，经常使用。CHAPSO和CHAPS不同，

CHAPSO含有一个极性更强的头端基团，可以使它的可溶性更高。因

此，CHAPSO可以用于完整细胞膜蛋白的溶解。

离液剂

各类离液剂是同类物质的表面活性剂，它们可以打破非共价的相

互作用（氢键，偶极-偶极相互作用，疏水相互作用），使蛋白质发生

可逆性变性。单独使用尿素，或与硫脲或其它去污剂联合使用，在二

维电泳或在蛋白组学研究中配制蛋白质的酶消化液中广泛使用。此外，

在使用尿素的时候需注意不能加热样品至37摄氏度以上，这会导致蛋

白质的氨甲酰化[6]。

用于分离膜蛋白的去污剂

很多人对膜蛋白的分离比较感兴趣，但是分离膜蛋白和分离胞质

蛋白、胞核蛋白不同，会出现一些特殊的问题。主要原因有膜蛋白表

达水平低且很难溶于水溶液，细胞膜具有比较复杂的脂质层及亲水、

疏水区域。为了提高膜蛋白的溶解性，首先应该选择临界胶束浓度较

高的去污剂，另外缓冲液的体积也要足够大，这样才可以加足够多的

去污剂去溶解样品中所有的膜蛋白。根据此链接[2]，每一个膜蛋白分

子至少需要一个胶束，这样才足以模拟细胞膜的脂质环境（图1C-1D)。

原则上，通过调整温度和缓冲液中的盐浓度，以及利用去污剂的两相

分离的特性，可以使膜蛋白有效地溶解。此时，被胶束包绕的膜蛋白

和去污剂一起发生沉淀，可溶性蛋白保留在上清中。去污剂缓冲液出

现两相分离的温度，称之为浊点。除了温度的影响，浊点还受缓冲液

中其它一些因素的影响，比如甘油和盐类（例如，TritonX114的浊点

是23摄氏度，但是如果在去污剂缓冲液中添加了20%的甘油，浊点会

降到4摄氏度）。当某个蛋白质的稳定性受高温影响时，这就显得非

常重要。

去污剂的选择

良好的去污剂首先应该能够充分裂解细胞，溶解其中的蛋白，并

对后续的实验研究没有影响。对于想要得到保留天然构想的还是变性

的蛋白质，这才是第二考虑的问题。没有一种去污剂可以适用于所有

的实验研究，即使应用于同一种实验技术，去污剂效果的好坏还取决

于实验所分离的蛋白质（表格1）。因此，通过尝试和失败经验，可以

帮助我们找到最合适的去污剂，此外，还可以尝试使用去污剂的混合

物。需要再强调的是，配置新鲜的去污剂缓冲液也很重要，可以防止

久置的去污剂缓冲液发生水解和氧化。

去污剂

单体

分子

量Da

胶束分

子量

Da

临界胶

束浓度

(mM)

25℃

聚集

数

浊点

(℃)

平均胶

束质量

强

度

透析

（去

除）

应用

十二烷基硫

酸钠（SDS）

28918,0007-1062>10018,000

强

烈

是

细胞裂

解,电

泳,WB,

杂交

TritonX-

100

62590,0000.2-0.9

100-

155

6580,000

温

和

否

酶联免

疫测定,

IP,溶

解膜蛋

白

3-[7]-1-

丙磺酸

（CHAPS）

6156,150610>1006,150

温

和

是IEP,IP

乙基苯基聚

乙二醇（NP-

40）

68090,0000.059

45-

50

温

和

否IEP

十二烷基麦

芽糖苷

（DDM）

5110.159850,000

蛋白结

晶

Tween-2012280.0676

温

和

否

WB,酶

联免疫

吸附法,

酶联免

疫测定

洋地黄皂苷122970,000<0.56070,000

温

和

否

溶解细

胞膜

表二.常用去污剂的特性和主要应用。注：WB,免疫印迹;IP,免疫

沉淀;IEF,等电子聚焦;

去污剂的去除

残留去污剂的类型及浓度多少会对实验有一定影响，因此通常需

要降低或者清除残留的去污剂。为了实现此目标，可以使用尺寸排阻

层析法或者透析法，但这基于胶束大小要不同于所分离的蛋白质分子

大小，或者胶束要小（例如比较高的临界胶束浓度）到可以通过透析

管[2]。此外，还可使用非极性微球或树脂结合去污剂、环糊精包合物

[8]，使用离子交换色谱法或蛋白质沉淀法。但是，在去除去污剂后，

要格外注意防止蛋白质的沉淀和聚集。

来邦文献调查中的去污剂

来邦调查了关于去污剂应用的相关文献。下列表格列出了去污剂

的主要供应商及被应用的论文数目，可以发现大多去污剂都是来源于

SigmaAldrich公司。

去污剂

数

目

供应商

TritonX-10034

ThermoFisher,Amresco,JTBaker,

Packard,Sigma

Tween-2019

ThermoFisher,AmershamPharmacia,

Bio-Rad

十二烷基硫酸钠(SDS)13Amresco,Bio-Rad,e,Sigma

乙基苯基聚乙二醇（NP-40）6Roche,Sigma

3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基

氨基]-1-丙磺酸（CHAPS）

6

EMDMillipore/Merck/Calbiochem,

Sigma,JTBaker

洋地黄皂苷8EMDMillipore/Merck,Sigma

表三：来邦文献调查的主要去污剂。

TritonX-100

ThermoFisherPierce公司的TritonX-100常用来裂解细胞或组

织样品以用于免疫印迹实验[9,10]和免疫细胞化学[11]。来自

Amresco公司的30%TritonX-100可以用于大鼠脊髓组织的匀浆[12]。

JTBaker公司的TritonX-100可用于细胞的固定和破膜，从而使肌动

蛋白骨架可见[13]。Packard的Triton-X用来溶解免疫组织化学技术

中的一抗[14]。Sigma的TritonX-100，用于免疫组织化学技术中细

胞的破膜[15-23]、封闭液的配制[24-27]，用于免疫印迹实验中细

胞或组织样品的裂解和蛋白质的溶解[28,29]，还可应用于PCR实验

[30]、脂质体融合实验[31]、染色实验[32]。

Tween-20

在各种免疫学实验中，Tween-20经常用于洗涤缓冲液中，例如

TBS-T，PBS-T。Fisher公司的0.05%Tween可用于酶联免疫吸附实

验[33]。AmershamPharmacia的Tween20可用于免疫印迹实验

[34]。来源于Bio-Rad的Tween20可用来配制PBS-T缓冲液，用于

免疫印迹实验[29]或用于免疫组织化学实验中洗涤组织切片[35]。

Sigma公司的Tween-20可以用于免疫印迹[17,29],[36],[37],[38-

41]、酶联免疫吸附[42,43]、免疫共沉淀[41]、原位杂交[42]、多

重PCR[43]或其它实验技术[44,45]。

SDS

Amresco公司的SDS可用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳[46]。

Bio-Rad的十二烷基硫酸钠的可用来制备放射免疫沉淀实验中的分析

缓冲液[44]。e的SDS可用于免疫印迹实验中的缓冲液配

制[45]。SIGMA的SDS可用于制备体外辛酰化、Laemmli样品及

2D-DIGE实验的缓冲液[29,44,47-54]。

NP-40

Roche公司的NP-40可用于裂解细胞[55,56]。Sigma的NP-

40可用于制备放射免疫沉淀实验中的缓冲液[44]、细胞裂解液[53]、

以及免疫共沉淀实验中的RIPA缓冲液[23]。

CHAPS

来自Calbiochem的CHAPS（2%，质量体积比)可以用于鉴定卵

巢癌的循环蛋白标记物的实验中[33]。Sigma公司的CHAPS可用于

制备纯化小鼠重组蛋白proghrelin的缓冲液[57]、免疫共沉淀的缓冲

液[23]、裂解组织的缓冲液[55]。JTBaker的CHAPS可用余裂解细

胞以研究人ASF1蛋白分子与病毒的相互作用[58]。

洋地黄皂苷

MERCK公司的洋地黄皂苷可以用于免疫细胞化学实验中，以研究

质膜中PI4P的作用[59]。Sigma的洋地黄皂苷可用于细胞破膜，以

研究上皮细胞和间充质细胞对大肠杆菌Shiga毒素1的反应[58]，还

可用于制备提取液，以研究TNF-alpha对巨噬细胞的作用[60]。

其它

纯化蛋白时，Anatrace的n-decyl-beta-D-maltopyranoside可

以用5mM的浓度[61]，n-辛基-beta-D-吡喃葡萄糖苷[31]和

Affymetrix辛基糖新戊二醇（OGNPG）[62]可以用1%的浓度；

Sigma的胆甾醇半琥珀酸酯可用0.1%（质量体积比）的浓度[63]。