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实时荧光PCR-技术⼤简析！

实时荧光PCR（real-timePCR）因其全封闭扩增，简单快速，重复性好，⽆扩增后处理以及易于⾃动化等优点，⼴受

⼤家欢迎。在分⼦诊断领域中，实时荧光PCR⽅法涉及的领域包括感染性疾病、肿瘤、遗传病等多⽅⾯。那么实时荧光

PCR技术是如诞⽣的呢？下⾯，由⼩编带领⼤家⼀起了解⼤⽜们是如何经过精密的研究⼀步⼀步探索出来这项技术。

1983年

1983年美国科学家KaryMullis发明PCR⽅法，⽤于放⼤扩增特定的DNA⽚段，可看作是⽣物体外的特殊DNA复制。

1985年

1985年，Cetus公司从温泉中分离的嗜热菌（Thermusaquaticus）株中纯化出耐热DNA聚合酶（后⾯简称Taq酶）。

该酶耐⾼温的性质极⼤地提⾼了PCR扩增的效率，使得PCR真正变为现实，为其⾃动化铺平了道路。但是PCR技术也

有其相应的局限性，就是对扩增产物分析时需要开盖处理，容易造成污染。为了解决这⼀问题RussHiguchi进⾏了⼀系

列相关研究。

1992年

1992年，Higuchi在⼀次报告中提出了实时荧光定量PCR技术。通过检测溴化⼄锭的含量实时监控整个PCR反应的进

程。之后经过不断的研究，通过对PCR反应的数学函数关系、相应的算法以及对标准品的运⽤，就可以对待测样品中的

⽬标基因进⾏准确定量。

1996年

1996年ABI公司推出世界上第⼀台定量PCR仪7700型。设备由荧光定量系统和计算机组成，通过荧光染料或荧光探

针，对PCR产物进⾏标记跟踪，结合相应的软件对结果进⾏分析，可以实现计算待测样品的初始模板量。由此，实时荧

光PCR技术开始更⼴泛的应⽤。

提到实时荧光PCR技术，⾸先映⼊你脑海的是不是TaqMan探针⽅法和染料⽅法？其实，实时荧光PCR技术⽐你想象的

更丰富。下⾯就让⼩编带你进⼊实时荧光PCR的世界，⼀起领略这项技术的丰富多彩。

实时荧光PCR基本原理

⽬前的实时荧光PCR技术主要是基于荧光共振能量转移（fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET)的原理，⼀

对合适的荧光物质可以构成⼀个能量供体(donor)和能量受体(acceptor)对,其中供体的发射光谱与受体的吸收光谱重

叠，当它们在空间上相互接近到⼀定距离(1~10nm)时，激发供体⽽产⽣的荧光能量正好被附近的受体吸收，使得供体

发射的荧光强度衰减，受体荧光分⼦的荧光强度增强。

图⼀.荧光共振能量转移原理图

实时荧光PCR技术种类

染料法

SYBRGreenI是⼀种⽐较常见的荧光染料，可以⾮特异的结合双链DNA⼩沟，它可以嵌合进DNA双链，但不结合单

链。当SYBRGreenI在溶液⾯未结合双链DNA时，仅产⽣很少的荧光，当它结合双链DNA时，就发射出很强的荧光信

号。由于SYBRGreenI能和任何双链DNA结合，⽆法区分引物⼆聚体或⾮特异性扩增产物，⼀般需要配合熔解曲线分

析来排除假阳性。

图⼆.SYBRGreenI作⽤原理

TaqMan探针

TaqMan探针是⼀个与模板特异性结合的荧光探针，它的5'端标记有荧光报告基团(Reporter,R)，3'端标记有荧光淬灭基

团(Quencher,Q)。当探针完整的时候，荧光基团和淬灭基团距离很近，使得荧光基团发射的荧光被淬灭。随着PCR的

进⾏，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5'-3'外切酶活性会切割探针，释放的5'端报告基团游离于反应

体系中，它不受3'端荧光淬灭基团影响，荧光信号就可以被仪器检测，积累荧光。也可以说每扩增⼀条DNA链，就形成

⼀个荧光分⼦，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成同步。该技术⽬前应⽤较为⼴泛，包括⼈或动物病原体检测、⽣

物制品鉴定等领域。

图三.TaqMan探针作⽤原理

双杂交探针

双杂交探针(dualhybridizationprobe)实时荧光PCR就是在两条寡核苷酸杂交探针上分别标记荧光供体基团和荧光受体

基团，两基团的激发光光谱有⼀定程度的重叠。对两条探针的要求是，其与靶核酸的杂交位置应相互邻近。当两条探针

与靶基因同时杂交时，两个荧光基团靠得很近，其间的距离在1~10nm(通常为1~5个碱基)，依据FRET原理，在供体基

团⼀定波长的激发光作⽤下，发⽣能量传递，从⽽激发受体基团发射另⼀种荧光，荧光强度和PCR反应中DNA合成量

成正⽐。由于两个不同的探针必须杂交到正确的靶序列时，才能检测到荧光，因此，该⽅法的特异性增强。

图四.双杂交探针作⽤原理

分⼦信标

分⼦信标(molecularbeacon,MB)探针由两端分别共价标记有荧光基团和淬灭基团的单链DNA分⼦组成，分⼦信标的环

部分和靶核酸互补，⽽探针的两头由于互补⽽成为茎。当分⼦信标为茎环结构时，淬灭基团和荧光基团距离很近，报告

基团的荧光信号被淬灭基团吸收，从⽽抑制报告基团产⽣荧光。在PCR变性阶段，该探针的茎部打开形成⼀条单链，当

溶液中存在特异性模板时，在复性阶段该探针即可与模板杂交，使得5'端荧光基团和3'端淬灭基团分离，荧光信号得以

释放。该⽅法可以⽤于基因定量分析、疾病基因检测和诊断等。

图五.分⼦信标作⽤原理

蝎型探针

蝎型探针(ScorpionsProbes)由探针、引物以及PCR终⽌⼦组成。探针部分和分⼦信标相似，也是5'端有⼀个荧光基

团，3'端有⼀个淬灭基团，并且呈现茎环结构，与分⼦信标所不同的是，蝎形探针带有⼀段特异引物，可与相应的靶核

酸结合，在TaqDNA聚合酶的作⽤下聚合延伸，得到扩增产物，⽽所带探针部分正好可以与延伸端的特异产物中互补序

列杂交结合，因此，如有扩增存在，在不断变性复性过程中，蝎形探针即可不断与扩增⼦杂交，茎环结构打开，荧光基

团不再被淬灭⽽被发射出来，荧光强度与扩增产物的含量呈正⽐。蝎形探针中特异探针序列呈环状结构，由⼀个不可扩

增的单体即PCR终⽌⼦连接于PCR引物的5'端，PCR终⽌⼦可防⽌扩增蝎形探针的茎环部分。

图六.蝎型探针作⽤原理

今天实时荧光PCR技术就介绍到这⾥，希望⼩编上⾯的介绍可以让你对实时荧光PCR技术有更深⼊的了解，下⾯再给

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