nmec

疏水性多肽合成纯化研究

1.前言

在固相多肽合成（SPPS）中，多肽的溶解性是合成和纯化过程中的主要问

题。如果在合成过程中肽形成如α-螺旋、β-折叠这些二级结构，会使肽溶解性变

差，促使肽链聚集，导致氨基酸偶联不完全，形成缺失肽。肽链的聚集这种情况

在合成和纯化过程中都会发生[1,2]。

固相多肽合成发展过程中，人们提出了很多关于提高多肽溶解性、减少肽链

聚集对合成反应的文献。（1）逐步固相多肽合成方法[3]的提出，克服了在液相合

成过程中出现的肽链溶解性差的问题；（2）使用增溶性侧链保护基团[4,6]，可以

大大抑制肽链在溶液中的聚集倾向，提高偶联反应效率；（3）合成过程中引入

假脯氨酸，也可以有效抑制了β-折叠的形成，增加肽链在溶液中的溶解性[5,12]。

（4）还有其他如提高反应温度、微波合成等方法也可以促进偶联反应的进行。

多肽通常以酸性水溶液为流动相，用反相HPLC进行纯化。如果粗肽在水或

水/乙腈溶液中溶解性好，会有利于纯化的进行。因此，肽链中含有His、Lys、

Arg这几种亲水性氨基酸可以增加肽链在水溶液中的溶解性。相反，如果出现肽

链聚集或难溶，粗肽的纯化会受到很大的影响。因此，对于疏水性强的肽，我们

需要肽链进行修饰，提高它在溶液中的溶解性。

2.合成方法优化

2.1加入增溶性保护基团

2.1.1肽骨架氨基保护基Hmb及其衍生物

HMB

HMB是Fmoc固相多肽合成中一种亚氨基保护基团，该基团在固相合成重

复酰化、去保护的循环过程中非常稳定。肽链中引入HMB保护基团，可以使偶

联化反应更完全，提高反应效率。合成过程中，游离的氨基酸羧基先跟苯环上2

位羟基偶联，然后通过O→N酰基转移偶联到肽链上。其机理如图2。

OH

HNC

H

R

CO

2

H

MeO

图1.肽骨架氨基保护基：Nα-2-hydroxy-4-methoxybenzyl(Hmb)

ONC

H

R

CO

2

H

MeO

Fmoc

Fmoc

ONC

H

R

CO

MeO

H

N

H

Resin

O

HNC

H

R

CO

MeO

N

H

Resin

CHR'CO

Fmoc

OHNC

H

R

CO

MeO

N

H

Resin

CHR'CO

Fmoc

Piperidine/DMF

Fmoc-CHR'COOH

HBTU/DIEA

intramolecularacyl

transfer

图保护的肽反应机理图

n等[6]使用N-（2-羟基-4-甲氧苯基）基团(Hmb)作为肽骨架上的可逆

保护基，有效抑制肽链间的聚集，提高困难肽的反应效率。他们在选定的肽序

中引入了N,O-bis-Fmoc-N-(2-hydroxy-4-methoxybenzyl)保护的氨基酸，然后用六

氢吡啶/DMF溶液脱去HMB和肽链氨基上的Fmoc，游离的氨基酸上的羧基先与酚

羟基反应，再通过O→N转移与肽链中的氨基偶联。这样不但可以增强氨基酸偶

联效果，还能抑制β-折叠的形成。

但是使用Hmb保护基团存在一定的缺点：1.由于该基团在酸性条件下不稳

定，用TFA裂解的时候该基团也会脱去，不能得到Hmb保护的粗肽，从而降低了

粗肽在溶液中的溶解性。2.由于Hmb空间位阻较大，除了Gly和Ala外，其他氨

基酸的偶联速度都比较慢。

AcHmb

由于Hmb保护基团在酸性条件下不稳定，用TFA裂解的时候该基团也会脱

去，不能得到Hmb保护的粗肽，从而降低了粗肽在溶液中的溶解性。要解决这个

问题，人们对Hmb中的2-羟基进行了修饰。AcHmb是在Hmb保护基的羟基上引入

了乙酰基，修饰后的AcHmb在TFA裂解时要比Hmb基团稳定。

OHNC

H

R

CO

MeO

AcN

H

Resin

图3.肽骨架氨基保护基AcHmb

l等[2,7,8,9]在这方面进行了尝试，他们在合成疏水性的β-淀粉蛋白

（1-43）中使用Hmb保护的Gly、Phe等氨基酸，肽链偶联完后用乙酸酐和DIPEA

在DMF中对Hmb进行乙酰化反应，然后用TFA裂解后得到AcHmb保护的粗肽，

最后成功的合成并纯化了该难溶的蛋白质。使用这种方法消除了肽链聚集的倾

向，大大的增加了肽链的溶解性，有利于肽的纯化。

D1AEFRHDSGYEVHHQKLVF-F20AEDV-G25SNK-G29AII-G33LMVG-GVVIAT43

AcHmbAcHmb

AcHmbAcHmbAcHmb

图保护的肽模型图

2,5-Hnb和Hnb

对于一些含有β-支链氨基酸的困难肽，使用Hmb作为保护基时，由于O→N

转移效率较低，从而限制了合成效率。基于这种情况，a等[10]提出

了使用2,5-Hnb和Hnb作为氨基保护基，可以提高O→N转移效率，从而提高了含

有侧链功能基和β-支链氨基酸的偶联反应效率。

OH

HNC

H

R

CO

2

H

NO

2

OHHNC

H

R

CO

2

H

NO

2

图5.保护基Nα-2-hydroxy-6-nitrobenzyl(Hnb),Nα-2-hydroxy-5-nitrobenzyl(2,5-Hnb)

表,Hnb和2,5-Hnb保护下氨基酸的偶联效率比较

Nα-(auxiliary)Val-Ala-Gly-Phe

Nα-acylationyield(%)

auxiliaryt(h)glycinephenylalaninevaline

1(HMb)1654NDa

67217<1

24775423

2(2,5-Hnb)1>983711

6>999142

24>999795

3(Hnb)1663831

6878675

24949493

aNDindicatesNα-acylationproductnotdetected

a等人使用Hnb保护基方法合成和困难肽STAT-91(699-709)：

TGYIKTELISV。图5是各个氨基酸残基的偶联效率曲线图，

图6.使用Hnb保护基与没有使用保护基的氨基酸残基偶联效率比较

2.1.2.侧链保护基

聚乙烯乙二醇

Mutter,M等[4]提出了在疏水性肽模型Ac-[Lys(R)Val]

n

-NH的链末端(Ⅱ)、链中

间(Ⅲ)和每个Lys中(Ⅰ)分别引入增溶性的聚乙烯乙二醇基团。作为对比，他们在

肽模型的所有Lys上接上Ac(Ⅳ)。实验证明，由于肽链Ⅳ在反应中形成二级结构，

在较高的反应温度下氨基酸也不能偶联完全。相比之下，肽链上只要连上一个聚

乙烯乙二醇基团，就可以增加肽链在溶液中的溶解度，抑制肽链在溶液中的聚集

倾向，促进了肽链增长反应的进行。

Ⅰ:

Ac-[Lys(P)-Val]n-NH2Ia:n=5;Ib:n=6

Ⅱ:

Ac-Lys(P)-Val-[Lys(Ac)-Val]3-Lys(P)-Val-NH2

Ⅲ:

Ac-[Lys(Ac)-Val]2-Lys(P)-Val-[Lys(Ac)-Val]2-NH2

Ⅳ:

Ac-[Lys(Ac)-Val]4-NH2

Ac=Acetyl;Lys=lysine;Val=valine;P=poly(ethyleneglycol)monomethyl

ether

图7.肽模型图

2.2.引入假脯氨酸

困难肽合成过程中，由于肽链增长过程中会形成分子内或分子间氢键，导致

二级结构形成，影响肽链的合成。但人们发现当肽链中有脯氨酸存在时，肽基本

上可以成功合成出来。这是因为脯氨酸中有一个的环结构，这种结构可以阻碍分

子内氢键形成，破坏肽链的二级结构。因此，研究人员提出了使用假脯氨酸二肽

用于困难肽的合成。

后来，TorstenWo1hr等提出了用Ser,Thr,Cys等氨基酸合成与脯氨酸结构类

似的假脯氨酸[5,11]。合成路线如图4所示。

RouteA

Ser,Thr,Cys=XaaRouteB

N

X

H

R''

R'

R

CO

2

H

=Xaa(ΨR',R''Pro)

Fmoc-Xxx-F

(or-NCA)

Fmoc-Xxx-OPfp

Fmoc-Xxx-Xaa-OH

H+

O

R''

R'

O

R''

R'

H+

Fmoc-Xxx-Xaa(ΨR',R''Pro)-OH

图4假脯氨酸合成机理

Ser,Thr,Cys与醛或酮进行环化反应可以得到假脯氨酸。在TFA裂解下，假

脯氨酸发生开环反应，还原成原来的氨基酸。

在肽序中引入假脯氨酸，可以破坏链增长过程中形成的如β-折叠等二级结

构，从而增加肽的溶解性以及增强反应动力学。假脯氨酸很容易通过Ser,Thr,Cys

成环得到，可以作为可逆增溶性保护基团，应用于所有肽合成策略中。

n等[12]分别在困难肽合成过程中分别引入Hmb和假脯氨酸作为

保护基团，对比它们对困难肽合成的影响，数据如表1所示。研究发现Hmb和假

脯氨酸这两种基团都可以抑制分子内和分子间氢键形成，提高肽的反应效率，最

终提高了粗肽的纯度。

表2.不同实验方法实验数据对比

PeptideSequenceMolecular

weight

Synthesis

method

%Purity

byHPLC

1H-MEDSTYYKASKGC-NH21481.7Standard27

2H-MEDSTYYKASKGC-NH21481.7Hmb39

3H-MEDSTYYKASKGC-NH21481.7Pudoproline45

4H-MEDST(PTyr)YKASKGC-NH21561.1Standard25

5H-MEDST(PTyr)YKASKGC-NH21561.1Hmb50

6H-MEDST(PTyr)YKASKGC-NH21561.1Pudoproline54

7H-PKYLQNTLKLATGMRNVPEKQTT-OH2646.4Standard24

8H-PKYLQNTLKLATGMRNVPEKQTT-OH2646.4Hmb43

9H-PKYLQNTLKLATGMRNVPEKQTT-OH2646.4Pudoproline78

同时，他们发现使用在肽链中引入假脯氨酸的合成效果优于使用HMB作为

保护基的合成效果，这可能是由于HMB保护的氨基酸偶联速度较慢，氨基酸偶

联不完全导致合成粗肽纯度较低。

使用假脯氨酸二肽有以下优点：热力学稳定性，可以在室温下保存很长时间，

在肽链合成中很稳定；具有很好的溶解性；酸条件下不稳定，裂解时可以还原

成目标肽。因此，使用假脯氨酸是合成疏水性肽较好的策略。

2.3.使用新型树脂载体

在困难多肽合成过程中，随着肽链的增长，会形成β-折叠等二级结构，肽树

脂的溶解性和肽链末端氨基的反应活性会明显的降低。因此，提高树脂的溶胀性

能可以提高肽的合成效率，降低这种问题对肽合成的影响。人们提出使用一些新

型两亲的、柔韧性高的树脂载体，如四甘醇二丙烯酸脂（TTEGDA）和己二醇二

丙烯酸脂（HDODA）聚苯乙烯交联树脂[13,14]。

O

O

CH

2

OCH

2

O+

CH

2

CHCH

2

CHCH

2

CHCH

2

C

O

CH

2

CH

2

CHCH

2

CHCH

2

CHCH

2

C

O

O

O

6

STYRENE

1,6-HEXANEDIOLDIACRYLATE(HDODA)

Bz

2

O

2

+ClCH

2

OCH

3

CH

2

Cl

2

ZnCl

2

/THF

CH

2

Cl

80

等[15]合成了PS-HDODA树脂以及相应的氯甲基化PS-HDODA

树脂。该树脂在溶液的溶胀性能很高，表3中列出了PS-HDODA与DVB-PS在各

种溶液中的溶胀性能比较。树脂溶胀性能提高，使氨基酸更容易接近树脂上的功

能团，从而提高偶联反应效率。他们使用该树脂合成了硫氧还蛋白中的三段困

难肽序，(1)AILVDFWA(T22–29)；(2)IGRGIPTLLLF(T71–81)；(3)TLLLF

(T77–81)，并得到较高转化率和粗肽纯度。

表-HDODA与DVB-PS在各种溶液中的溶胀性能比较

SolventDVB-PS

(ml/g)

HDODA

(ml/g)

DCM5.210.0

DMF3.57.2

MeOH0.952.0

HMP4.09.1

后来，ar等[16]合成了1,4-丁二醇二异丁烯酸脂（BDDMA-PS）以

及相应的功能化树脂HMP-BDDMA-PS。他们使用这种树脂，成功合成了VAVAG,

VIVIG,QVGQVELG和VQAAIDYING等困难肽，得到较高的纯度和产率。

3.纯化方法优化

CH

3

CHCH

2

CCH

2

CHCH

3

C

O

CH

2

CH

3

CHCH

2

CCH

2

CHCH

3

C

O

O

O

CH

3

CH

3

4

3.1肽链上偶联可溶性片段

众所周知，疏水性很强的肽在纯化过程中会遇到很大的困难[17]。因此，人

们采用了很多方法对疏水性肽进行修饰，改善它们在溶液中的溶解性。其中一种

策略就是在疏水性肽的C端接上一段溶性强的肽，增加目标肽的溶解性。纯化完

后脱掉这溶解性的尾部肽就可以得到我们所要的目标肽。

DarrenR.等人[18]提出了在Boc固相多肽合成策略中，用对酸稳定碱不稳定的

2-羟乙酰胺为连接体，将疏水性很强的目标肽与溶解性强的肽连接起来，增强它

在水溶液中的溶解性，最终达到纯化的目的。

后来，等[19]提出了在Fmoc固相多肽合成策略中，使用4-羟

甲基苯甲酸(4-Hmb)[20]作为目标肽和尾部可溶性肽连接体，4-Hmb酯可以通过铯

盐方法或酸酐方法合成。4-Hmb酯连接体在肽合成和裂解过程中都很稳定，纯化

完成后，用碱性水溶液把4-Hmb酯连接体脱掉就可以得到目标肽。

H

2

N[HydrophobicPeptide]C

O

O

H

2

C

C

O

H

N[SolubilisingPeptide]COOH

图4.目标肽与可溶性连接的结构图

3.2加入增溶性保护基团Boc-Nmec侧链保护基

Boc-Nmec

Boc-Nmec（Boc-N-methyl-N-[2-(methylamino)ethyl]carbamoyl）是一种新型

的侧链保护基，该保护基之前是作为一种环化活性的酚类化合物药物前体合成中

的媒介进行研究[21]。最近KarolinaWahlstrom等人把该基团作为SPPS中氨基酸的

侧链保护基团进行研究[22,23]。

KarolinaWahlstrom等[22]提出了在固相合成中，Tyr侧链羟基上接一个新型的

侧链保护基团Boc-Nmec，得到Fmoc-Tyr(Boc-Nmec)-OH，并用于肽合成中。肽

链偶联完用TFA裂解的时候Boc基团会裂解下来，Nmec基团仍然连在Tyr上，该

基团末端形成氨基阳离子，增加了肽链的溶解性。纯化之后，Nmec保护基团在

中性或弱碱性条件下通过环化反应脱落下来。

O

O

H

N

Fmoc

HO

O

O

O

H

N

Fmoc

O

O

NO

N

Boc

O

OH

H

N

Fmoc

O

NO

N

Boc

a

b

图-Tyr(Boc-Nmec)-OH的合成：a.(1)p-nitrophenylchloroformate,DIPEA,DCM;(2)

mono-Boc-N,N’-dimethylethylenediamine,DIPEA,DCM;/HOAc.

Boc-Nmec-Hmb

KarolinaWahlstrom等[23]后来用类似的方法在Fmoc-Val-(Hmb)Gly-OBzl的2-

羟基上接上Boc-Nmec基团，制备Fmoc-Val-(Boc-Nmec-Hmb)Gly-OH，并用于固

相多肽合成中。Boc-Nmec-Hmb基团在合成过程中很稳定，用TFA裂解的时候Boc

基团会裂解下来，Nmec-Hmb基团仍然连在链骨架上。由于Nmec末端氨基会形

成阳离子，大大增加肽链的溶解性，有利于多肽的纯化。纯化之后，Nmec保护

基团可以在弱碱性条件下通过环化反应脱落下来，而Hmb可以用TFA脱掉。

O

HO

O

O

O

H

2

N

O

O

HN

HOO

O

N

HOO

O

O

N

H

Fmoc

O

N

OO

O

O

N

H

Fmoc

NO

N

Boc

OH

N

OO

O

O

N

H

Fmoc

NO

N

Boc

a

b

c,d

e

图-Val-(Boc-Nmec-Hmb)Gly-OH合成路线图：borohydrideinethanol;

-L-Val-OH/N,N’-diisopropylcarbodiimideinDCM;

c.p-nitrophenylchloroformate/diisopropylethylamineinDCM;

-Boc-N,N’-dimethylethylenamine/diisopropylethylamineinDCM;

e.H2/10%Pdoncharcoalinethanol.

OH

N

OO

O

O

N

H

R

Fmoc

NO

N

Boc

Peptideresin

N

OO

O

O

N

H

R

Peptide

NO

N

Boc

Peptide

N

OO

O

O

N

H

R

Peptide

NO

NH

2

Peptide

N

HOO

O

O

N

H

R

Peptide

N

N

O

Peptide

H

N

O

O

N

H

R

Peptide

a

b

c

d

图7.(Boc-Nmec-Hmb)保护的多肽合成路线图：(a)Peptidesynthesis;(b)TFA,RP-HPLC

purification;(c)DMF/water,N-methylmorpholine;(d)TFA,diisopropylsilane

4.小结

固相多肽合成（SPPS）中，疏水性肽是一种常见的困难肽。由于它溶解性

差，在合成过程中很容易形成二级结构，导致肽链聚集，大大影响了肽的合成效

果。要提高这类肽的合成效率，我们就需要破坏肽链中的二级结构，其中，在肽

链中引入HMB保护基和假脯氨酸是比较好的方法。

另外，疏水性肽在水或水/乙腈溶液很难溶解，我们在纯化这类肽时会遇到

很大的困难。因此，我们需要对肽进行修饰，增强它们在溶液中的溶解性。其中，

引入增溶性连接体或增溶性保护基是比较好的方法。

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