rep

犬圆环病毒Rep蛋白的原核表达

汪伟;孙文超;曹亮;易驰喆;郑敏;鲁会军;金宁一

【摘要】Caninecircovirusisanewlydiscoveredcircovirusinrecent

rtoestablishtheCai-neCVELISAmethod,thegenequence

ofRepproteinwasamplifiedbyusingtheCaineCVgenomeas

productwasclonedintothepET-28aprokaryotic

expressionvectorandtherecombinantplasmidwasnamedpET(28a)-

ombinantplasmidwastransferredintocompetentcellsBL21,

-PAGE

analysisshowedthatrecombinantRepproteinwascorrectlyexpresdin

nblotanalysisshowedthattherecombinant

study,pET(28a)-Reprecombinantprokaryot-icexpressionplasmidwas

successfullyconstructed,anddhighlevelsofexpressioninEscherichiacoli

rklaidthefoundationforthepreparationof

antibodiesagainsttheRepprotein.%犬圆环病毒(CanineCV)是一种新发现的圆

环病毒.制备针对CaineCVRep的抗体,为建立CaineCVELISA检测方法及研究

Rep蛋白的功能奠定基础.以CaineCV基因组作为模板,扩增出Rep基因序列.PCR

产物克隆至pET-28a原核表达载体上,获得了重组质粒pET(28a)-Rep.将重组质粒

转入大肠埃希菌BL21感受态细胞后进行诱导表达,SDS-PAGE分析表明重组Rep

蛋白在大肠埃希菌BL21中获得表达.Westernblot分析表明,重组蛋白能与Anti-

His标签抗体发生特异性反应.该研究构建了pET(28a)-Rep重组原核表达质粒,并

在大肠埃希菌中获得表达,为进一步制备Rep的抗体奠定了基础.

【期刊名称】《动物医学进展》

【年(卷),期】2018(039)007

【总页数】4页(P28-31)

【关键词】犬圆环病毒;Rep蛋白;原核表达

【作者】汪伟;孙文超;曹亮;易驰喆;郑敏;鲁会军;金宁一

【作者单位】军事兽医研究所,吉林长春130122;军事兽医研究所,吉林长春

130122;温州大学病毒学研究所,浙江温州325035;军事兽医研究所,吉林长春

130122;广西动物疫病预防控制中心,广西南宁530001;广西动物疫病预防控制中

心,广西南宁530001;军事兽医研究所,吉林长春130122;军事兽医研究所,吉林长春

130122

【正文语种】中文

【中图分类】S852.659.2;S858.292

犬圆环病毒(Caninecircovirus，CanineCV)在分类学上属于环状病毒科

(Circoviridae)环状病毒属(Circovirus)的成员，为无囊膜的单股环状DNA病毒，

基因组的大小约为2063bp。CaineCV基因组包括两个主要的编码框，分别编码

复制酶(Rep)蛋白和核衣壳(Cap)蛋白。CaineCV于2012年首次被报道后[1]，陆

续在意大利和德国发现[2]。已有病例报道称CaineCV是引起犬淋巴结肉芽肿和坏

死性血管炎的致病因子，临床症状主要表现为呕吐、出血性腹泻等[2]。目前，欧

美各国均已经对CaineCV开展相关研究，而我国对该病毒的研究比较滞后。2016

年孙文超等[3-4]对我国CaineCV的流行状况进行了首次报道。CanineCV的

ORF1编码框全长912bp，编码由303个氨基酸组成的复制酶(Rep蛋白)，Rep

蛋白主要参与病毒的复制，但对其功能和作用机制尚不明确。为了对CaineCV的

Rep蛋白进行深入研究，本研究以犬圆环病毒基因组为模板序列，设计了特异性

引物，通过PCR扩增出Rep基因的完整序列，连接至pET-28a载体上，通过大

肠埃希菌原核表达系统表达Rep蛋白，为制备Rep蛋白的亚单位疫苗和建立

CanineCV的ELISA检测方法奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

大肠埃希菌BL21、DH5α感受态细胞，2×TaqPCRMasterMix，

TIANampGenomicDNAKit试剂盒，均购自天根生化科技有限公司；蛋白胨、

酵母粉、琼脂粉、琼脂糖、氨苄青霉素、卡那霉素等，均购自生工生物工程(上海)

股份有限公司；pMD18-T载体，购自宝生物工程(大连)有限公司；

CanineCVJZ98/2014毒株、pET-28a质粒，本实验保存。

1.2方法

1.2.1引物设计以GenBank中收录的CanineCVJZ98/2014毒株序列(登录号：

KT946839)为参考序列，设计引物扩增Rep基因的特异性引物。上游引物

F(BamHⅠ)：5′-GCGGGATCCATGGCTCAAGCTCAGGTTGA-3′；下游引物

R(XhoI)：5′-CCCTCGAGGTAGTTATACATGAAAGGGAAC-3′，目的片段大小

为912bp，引物序列由吉林库美生物有限公司合成。

1.2.2基因组样品的制备参照TIANampGenomicDNAKit试剂盒说明书提取

病毒基因组。

1.2.3PCR反应及基因克隆以提取的基因组样品为模板进行PCR。反应条件：

95℃预变性3min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，共30个循环；最后72℃

延伸10min。琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，回收纯化后连入pMD18-T载体，

4℃连接过夜。连接产物转化大肠埃希菌DH-5α感受态细胞，37℃摇床培养

45min后，涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上培养13h。从平板上挑取单菌落

至含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养12h，少量提取质粒后用XhoⅠ和

BamHⅠ酶切鉴定，酶切结果正确样品送吉林库美生物有限公司测序。

1.2.4原核表达载体的构建将测序正确的阳性质粒及pET-28a原核表达载体分

别经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物，4℃连接过夜。

连接产物转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞，涂布在含有卡那霉素的LB平板上培

养13h。从平板上挑取单菌落至含卡那霉素的LB液体培养基中培养12h，少量

摇菌后小提，质粒双酶切鉴定后送吉林库美生物有限公司测序，将测序正确的阳性

质粒命名为pET(28a)-Rep。

1.2.5重组蛋白的原核表达将pET(28a)-Rep质粒转化大肠埃希菌BL21感受

态细胞后，涂布在含有卡那霉素的LB平板上培养14h。从平板上挑取单菌落至

含有卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养12h，保存至4℃冰箱作为母液备用。

将母液按1∶500的比例接种到新鲜培养液中，培养至OD600nm值在0.4～0.8

之间，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，继续培养6h后收取样品。样品加入

buffer沸水浴5min，SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝染色鉴定诱导表达产物。

1.2.6Wsternblot鉴定诱导表达产物SDS-PAGE电泳后，凝胶通过半干转膜

仪将蛋白转移至PVDF膜上，用含50mL/L小牛血清的脱脂乳封闭2h后，加入

鼠源Anti-His标签抗体孵育2h后TBST洗3次，加入HPR标记的羊抗鼠二抗孵

育2h后TBST洗3次，AEC显色。

2结果

2.1Rep基因的PCR扩增

以CanineCV基因组作为模板，PCR扩增出Rep基因的全长序列，条带大小约为

900bp，与预期相符。将目的条带连接在pMD18-T载体上后送测序，将测序正

确的阳性质粒命名为T-Rep(图1)。

2.2重组质粒的构建

将T-Rep质粒以及pET-28a载体分别经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切后，琼脂糖电

泳鉴定正确。胶回收纯化后4℃连接过夜，连接产物转化大肠埃希菌DH5α。将菌

液涂布在含有卡那霉素的LB平板上，培养12h后挑菌。挑取单菌落用液体LB培

养12h后小提，双酶切鉴定为阳性。测序结果显示目的基因已正确连接在pET-

28a载体上，将测序正确的阳性质粒命名为pET(28a)-Rep(图2)。

标准DL2000;1.基因组样品；2.阴性对照

kerDL2000;csample;vecontrol

图1Rep基因的PCR扩增

Fig.1PCRamplificationofRepgene

标准DL2000;1.质粒

kerDL2000;ds

图2pET(28a)-Rep质粒双酶切鉴定

Fig.2IdetificationofpET(28a)-Repplasmidsbydoubleenzymedigestion

2.3原核表达产物的鉴定

在转有重组质粒pET(28a)-Rep的大肠埃希菌BL21感受态细胞中加入终浓度

0.5mmol/LIPTG，置于37℃恒温摇床培养，7h后取样进行SDS-PAGE电泳。

将菌液超声裂解，取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析鉴定，通过与空载体和0h

的诱导产物对比，发现转有pET(28a)-Rep质粒的重组菌能正确表达带有His标签

的Rep蛋白，条带大小约为35ku，与预期相符。重组蛋白主要集中在沉淀中，

表明重组蛋白主要以包涵体的形式表达(图3)。

2.4原核表达产物的Wsternblot鉴定

在SDS-PAGE电泳后，将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜上后，用Anti-His标签抗

体检测带有His标签的重组Rep蛋白的反应原性。结果表明重组菌的表达产物能

与Anti-His标签抗体发生特异性结合，表明带有His标签的重组Rep蛋白得到正

确表达(图4)。

M.蛋白分子质量标准;-28a诱导前产物；-28a诱导后产物；3.重组菌

诱导产物沉淀；4.重组菌诱导产物上清

nmolecularweightMarker;-28apre-inducedproducts;-

28ainducedproducts;itateoftherecombinantbacteriainducedpr

oducts;atantoftherecombinantbacteriainducedproducts

图3重组Rep蛋白表达形式分析

Fig.3SDS-PAGEanalysisofrecombinantRepproteins

M.蛋白分子质量标准;-28a诱导前产物；-28a诱导后产物；3.重组菌

诱导前产物；4.重组菌诱导后产物

nmolecularweightMarker;-28apre-inducedproducts;-

28ainducedproducts;inantbacteriapre-

inducedproducts;inantbacteriainducedproducts

图4重组Rep蛋白Westernblot鉴定

Fig.4IdentificationofrecombinantRepproteinbyWesternblot

3讨论

自2012年Kapoor等首次报道犬圆环病毒以来，欧美各国陆续发现并报道了

CanineCV并开展了相关研究，而我国一直未见相关报道。直到2016年，孙文超

等人首次从犬血清中样品检测出CanineCV病毒，遗传进化分析表明我国发现的

CanineCV毒株与欧美各国发现的毒株位于不同的进化分支。LiL等[5]从感染犬细

小病毒的病犬粪便样品中用RT-qPCR方法成功检测到CanineCV病毒，进一步研

究表明感染CanineCV可引起病犬淋巴肉芽肿、坏死性血管炎以及出血性腹泻等

临床症状，但目前尚无直接证据表明CanineCV能独立引发上述临床症状。

DecaroN等[2]通过病理学剖检和电镜检查发现，CanineCV与圆环病毒属的其他

成员相似，均以淋巴细胞为主要侵害细胞[6]。已报道的CanineCV的基因组长度

均为2063bp，包含有3个阅读框，其中含有912bp碱基最大的阅读框ORF1

编码病毒的Rep蛋白，其分子量大小约为33ku，目前的研究表明，Rep蛋白主

要与病毒的复制有关，但Rep蛋白的具体功能和作用机制有待进一步研究。

已有研究表明Rep蛋白较为保守，通过对猪圆环病毒2型(PCV2)Rep蛋白的功能

的分析，可作为研究CanineCVRep蛋白功能及作用机制的参考。在PCV2上的

研究表明Rep蛋白是由PCV2基因组的最大编码框ORF1编码，在病毒转录过程

中ORF1转录本mRNA第417-799nt处发生了剪接，产生了一个截断的

Rep'蛋白，两者在病毒的复制过程中发挥协同作用[7-8]。两种蛋白的N端序列中

含有与CanineCV滚环复制相关的3个保守序列Ⅰ(FTLUI)、Ⅱ(HLQG)、

Ⅲ(YCSK)以及1个结合dNTPs的P环结构，这些序列的缺失或突变均会影响病

毒的增殖。CheungAK等[9-10]研究表明Rep和Rep'与细胞核中的dsDNA复

制原点结合后，使其颈环结构展开，暴露出九聚体序列，随后Rep/Rep'识别并切

割该序列，以滚环方式进行基因组复制。对PCV2Rep启动子区类干扰素刺激反

应元件(vISRE)进行点突变，发现突变株增殖能力相对亲本株大幅度下降和对干扰

素刺激的反应，这表明Rep启动区域vISRE可能在干扰素促进病毒增殖过程中发

挥调控作用[11]。张鑫[12]通过构建Cap蛋白和Rep蛋白的真核表达质粒，通过

共转染发现Cap蛋白和Rep蛋白存在共定位现象，推测Rep蛋白与Cap蛋白在

病毒复制过程发挥协同用。目前在PCV2上的研究表明，PCV2感染后可以诱导

Cap蛋白和Rep蛋白的产生，其中Cap蛋白包含主要的抗原中和表位，具有良好

的免疫原性，但是存在体外表达难度大、表达量低的缺点，其次针对PCV2的疫

苗产生的抗体主要针对Cap蛋白，不利于临床检测区分疫苗免疫与自然感染之间

的鉴别诊断问题。现有的研究表明Rep蛋白也可以诱导中和抗体的产生，且可以

在体外高效表达。Rep蛋白的这些特点有利于研制针对Rep蛋白的亚单位疫苗和

ELISA检测试剂盒[13-14]。

自2012年首次报道CanineCV后，欧美各国已逐步开展对CanineCV的研究，

然而至今对其临床症状、病理特征、致病机制及检测手段尚无明确报道。本试验以

CanineCV基因组为模板，成功扩增出病毒的Rep蛋白序列，并将其连接在pET-

28a载体上，构建了原核表达质粒pET(28a)-Rep。SDS-PAGE和Westernblot

鉴定结果表明带有His标签的重组Rep蛋白能以包涵体的形式在重组菌中获得高

效表达。该重组蛋白可用于制备Rep蛋白的抗体，为制备CanineCV的ELISA检

测试剂盒及CanineCV的防控奠定了基础。

参考文献:

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