内参基因

柑橘内参基因的稳定性评价

RT-qPCR因其灵敏度高、特异性强、可用于低丰度mRNA的表

达分析而成为广泛应用的基因表达分析技术。为了确保试验结果的准

确性和可靠性，RT-qPCR需要选用合适的内参基因来消除不同样品

在RNA产量、质量以及反转录效率上可能存在的差别，从而实现对

不同样品中RNA的定量和数据归一化。作为基因表达分析时用于衡

量目的基因表达量的参照标准，内参基因常为表达相对稳定的持家基

因。但最近的研究表明，在不同的组织、器官，不同的发育阶段以及

不同处理条件下，这些持家基因的表达也会发生变化，盲目地选用持

家基因作为内参基因，就会导致基因表达分析结果准确性降低甚至得

到相反或错误的结论。因此选择合适、稳定的内参基因非常关键。

geNorm、NormFinder、BestKeeper等程序以及DeltaCT法已广泛应

用于内参基因的筛选与评价。Xie等将这上述4种分析方法整合成一

个网上综合分析工具——RefFinder，用于各种试验条件下内参基因的

筛选与评价，能够得到与单独使用各分析方法一致的结果，并能综合

评价上述4种分析方法的结果，避免了单个分析方法分析的片面性。

目前，国内外研究者已应用上述分析方法在多种植物中进行了内参基

因的筛选。前人对柑橘内参基因也进行了一些初步筛选，在干旱胁迫

下的Swingle枳柚（Poncirustrifoliata×Citrusparadisi）中、在感染柑

橘脚腐病菌（Phytophthoraparasitica）后的枳（iata）、酸橘（C.

sunki）以及2者的杂种中分别筛选过一些内参基因，但都是局限于少

数试验条件下的分析。Mafra等分析了候选内参基因在柑橘不同器官

及不同生物胁迫下的稳定性，结果表明不同试验条件下最佳的内参基

因组合不相同。Yan等在6个不同基因型的柑橘叶中，从7个候选内

参基因中筛选出最稳定的3个内参基因，到冰糖橙的不同器官中进行

验证时，也发现它们的表达差异很大且稳定性顺序与在不同基因型中

的也不一致。因此根据特定的试验条件选择可靠的内参基因很有必要。

于是我们基于柑橘中常用基因表达分析的要求，以湖南省特色主栽品

种冰糖橙的4种不同器官（根、茎、叶、果实）及干旱、低温、溃疡

病、衰退病胁迫下的冰糖橙叶片为试材，分析了6个候选内参基因的

表达稳定性情况，旨在为上述各种试验条件选定稳定表达的内参基因，

从而为柑橘研究中的基因表达分析提供较为可靠的内参基因。

1材料和方法

1.1植物材料与胁迫处理

1.2方法

1.2.2引物设计与合成候选内参基因的引物来自Yan等设计的

引物，由上海生工合成。

2结果与分析

3讨论

本研究的候选内参基因选自Yan等在不同柑橘基因型中表达相

对稳定的基因（M1.0），而且Tomas等的研究表明在特定的试验条件

与特定组织中表达稳定的内参基因在其同源物种的相同组织及相同

试验处理下表达也相对稳定，因此本研究筛选出的枳砧冰糖橙不同组

织和不同逆境胁迫下的内参基因组合也将会对其他基因型柑橘有一

定参考价值。此外，前人的研究[10，19-20]，建议根据特定的试验

内容进行内参基因的选择；Tomas等研究证明根据特定的试验条件筛

选的内参基因，其表达稳定性强于在各种条件下表达都稳定的基因；

本研究中在对所有柑橘样品进行整体分析时也发现候选内参基因的

表达稳定性下降，因此为了获得较为稳定的表达分析结果，建议根据

不同的试验内容进行柑橘内参基因的选择。另外本研究在利用

geNorm软件的Vn/n+1值进行最佳内参基因数目的确定时发现，在

候选内参基因相对不稳定时，V值远离异于默认值，此时选择内参基

因组合就不太必要。但当候选内参基因相对稳定，V值落在默认值附

近时，建议选择合适的内参基因组合。

本研究所用的内参基因稳定性评价软件中，DeltaCT法与

Normfinder表现出高度的一致性；geNorm与Normfinder在整体分

析、不同器官分析、溃疡病、衰退病感染下的分析中表现出高度的一

致性，但在干旱、低温胁迫的分析中则出现了一定差异；BestKeeper

的分析与上述3种方法的分析差异较大。上述各种软件计算结果的差

异源于算法的不同，geNorm根据各候选内参基因在各样品中表达情

况的相似度进行排序，而NormFinder则根据组内方差与组间方差进

行排序；只有一个内参基因在组间与其他内参基因的表达表现出差异，

而这个内参基因自身在组间各样品中没差异时，geNorm会最先排除

这个基因，NormFinder则会将其排到最前面；因此当内参基因本身

在组间各样品间的差异较少时，geNorm与Normfinder的分析结果

差异较大；Bestkeeper则直接依赖于Cq值的配对相关分析，是最直

接反应原始数据的，在对内参基因的稳定性进行排序上没有geNorm

与Normfinder有效，通常用其进行初步筛选，这也许是BestKeeper

与其他算法差异较大的原因。为减少算法不同所导致的单个软件分析

的片面性，本研究进一步利用一个网上综合分析工具—RefFinder，对

各组数据进行分析，一方面验证各软件的分析结果，另一方面对候选

内参基因进行综合评价。

本研究中UBQ1经多次试验去除离异值后对其Cq平均值作图发

现，它的表达相对较稳定。但因其表达丰度过低，其Cq值处于判断

有无扩增的临界值（30～40）内，极易因样品的异质性产生随机效应

而导致错误的判断[22-24]，同时理想内参基因应中度表达[25-27]，

Cq值应在15～30[26-27]，故本试验舍弃UBQ1作为柑橘的内参基

因。理想内参基因需中度表达[25-27]，也要求表达水平需与目的基因

相近[25-27]。假如目的基因表达水平极低，则用中度表达的内参基因

就不太适合，此时低丰度表达的内参基因就较为合适。这时如何避免

由于低丰度表达带来的Cq值的不稳定性就尤为重要。对于稳定表达

的低丰度内参基因的筛选还有待进一步研究。