its序列

利用ITS进行菌种鉴定是目前较多采用的方法。ITS是内源转录间隔区(Internally

TranscribedSpacer)的英文缩写,位于rRNA编码基因18S,5.8S和28S之间的小基因片段。其优

点有:具有高拷贝数,整个序列的长度在600～800bp，利用rDNA通用引物能够很容易被扩增出来；

同时包含保守与变异序列,能根据保守序列中的变异位点设计特殊引物进行特异性扩增比较，

rRNA基因(rDNA)在微生物的鉴定应用中，具有检测微生物种水平的多态性特征。这些rDNA高度保

守地分布在染色体的不同位置，在每个单倍染色体基因组中的拷贝数超过200个,这使得保守区域

能够很容易被扩增出来。每个重复的rDNA序列的存在方式为由一前一后的18SrDNA小亚基单元

(SSU),5.8SrDNA,28SrDNA大亚基单元(LSU)组成,已设计出通用引物来扩增ITS序列分析相关

真菌种水平之间的差异。本研究通过丝状真菌ITS保守序列的扩增,同源序列的对比分析,结合传

统鉴定方法,对从土壤中分离筛选的一株丝状真菌进行了分析鉴定,并对鉴定结果和方法进行了比

较分析。

种内变异还显示在rDNA基因间内转录间隔区Ⅰ和Ⅱ（分别为ITSⅠ和ITSⅡ）的片段大小上。

ITS区在核糖体DNA中进化较快，可在同一属间甚至群体间发生变化。其中ITSⅡ区在种间变异性较

高（22％），种内变异性较低（＜3％）。选择的两对引物均以ITS区的序列为靶目标，其中

引物①（ITS1和ITS4）扩增的是ITSⅠ区、5.8SrDNA和ITSⅡ区的基因序列，可以鉴别出念珠菌属

的3个菌种；

引物②（ITS4和ITS86）扩增的是5.8SrDNA和28SrDNA之间的ITSⅡ区的保守顺序，可以鉴别出念

珠菌属的7个菌种。因而笔者更推荐采用引物②，它不仅有很强的通用性，能识别更多菌种，而且

具有更高的属种特异性。

5.8SrDNA

18SrDNA

26SrDNA

ITSⅠ

ITSⅡ

1、通用引物①：

ITS15'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG一3’

ITS45'-TCCTCCGCTTATTGATATGC一3’

通用引物②

ITS45'-TCCTCCGCTTATTGATATGC一3’

ITS865'-GTGAATCATCGAATCTTTGAAC一3’

2、反应体系（50μL）

10×buffer5μL

Mg2＋4μL

dNTPs4μL可以加到一起，再分装

上游引物（ITS4）2μL

下游引物（ITS86）2μL加完试剂后，稍加离心。

Taq酶0.5μL

ddH2O30.5μL

模板DNA2μL

3、PCR程序

94℃预变性5min

94℃50S

51℃退火50S30个循环

72℃2min

72℃延伸10min

-20℃保存备用,1%琼脂糖电泳检测。