磷脂酰肌醇

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)影响转化生长因子(TGF-β1)促肺纤

维化形成的研究

刘旭

【摘要】目的探讨转化生长因子(TGF-β1)通过调节磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)分子

影响肺纤维化进程的重要机制.方法应用博来霉素构建KM鼠肺纤维化模型,设置联

合TGF-β1+SB-431542组、单纯TGF-β1组、联合TGF-β1+LY294002组、对

照亚组、空白组,于建模后3、7、14、28d检测各组羟脯氨酸(HYP)含量；应用免

疫组化技术检测各组磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)蛋白表达；应用方差分析法比较各

组PI3K表达差别.结果相对空白组,实验各组PI3K明显高表达,主要分布在细胞核

外；单纯TGF-β1组,PI3K及羟脯氨酸(HYP)含量明显高于其余联合TGF-β1+

LY294002组.结论PI3K可能参与TGF-β1调节肺纤维化过程的机制,抑制PI3K的

表达,可能可以阻碍肺纤维化疾病发展.

【期刊名称】《湖北科技学院学报（医学版）》

【年(卷),期】2012(026)004

【总页数】3页(P286-288)

【关键词】磷脂酰肌醇3-激酶;转化生长因子;肺纤维化

【作者】刘旭

【作者单位】咸宁卫校附属医院,湖北咸宁437100

【正文语种】中文

【中图分类】R563

多数研究报道［1，2］，在众多致纤维化细胞因子中，转化生长因子β-1(TGF-β1)

是公认最重要的调控因子。TGF-β1可促进肺成纤维细胞(FB)过度增殖、分化，继

而促进胶原蛋白等细胞外基质(ECM)在肺间质和肺泡间过度积聚，导致肺纤维化的

发生和发展。PI3K/AKT是人体细胞生长发育的重要信号调节机制。它介导参与细

胞生长、发育、分裂、分化、死亡，甚至细胞间功能同步等多种细胞过程。PI3K

信号通路主要由激活粘附斑激酶(FAK)、PI3K、Akt等构成，它们通过调节整合素

等信号转导，而产生一系列的细胞增殖、迁移和粘附等功能，甚至能够增加I型胶

原蛋白的表达。近来研究表明［3］:TGF-β1可以激活PI3K信号途径，并且通过

该信号通路对细胞增殖、迁移、分泌产生影响。目前，TGF-β1与PI3K信号通路

的关系如何影响肺纤维化具体机制尚不清楚，本研究即针对该机制在肺纤维化过程

中的影响进行探讨。

1材料与方法

1.1动物、试剂与仪器

健康雌性6周龄KM小鼠88只，体质量(20±2)g，购自江苏大学实验动物中心。

盐酸博来霉素(BLM)粉剂购自日本花药株式会社;PI3K抑制剂LY294002，特异性

抗体anti-PI3K/P85alpha，TGF-β1特异性抑制剂SB-431542，TGF-β1购自

SantaCruz公司;人胚肺成纤维细胞(HELF)系HFL-I细胞株(中科院细胞库)。

1.2实验方法

1.2.1PF制备模型及分组

将88只小鼠随即分为实验组76只(随即分为TGF-β1亚组、LY294002亚组，各

28只，对照亚组20只)、空白组12只。造模方法参照文献，气管内注射

BLM3.5mg/kg，空白组同法经气管内注入相应体积的生理盐水。TGF-β1亚组为:

联合TGF-β1+SB-431542组，单纯TGF-β1组，随机各14只;LY294002亚组为:

联合TGF-β1+LY294002组，随机各14只;对照亚组为:相同体积盐水，其中

TGF-β1，SB-431542，LY294002浓度为我们预实验总结数据，即TGF-

β1:100pmol/L，SB-431542:100mmol/L，LY294002:15μmol/L。造模后第3、

7、14、28d分别处死4组小鼠各3只，取出并分离其肺组织备用。

1.2.2肺组织的处理

氯氨酮腹腔注射麻醉后无菌开胸，于右心室插入套管针，拔去针头，左心耳剪一

3mm左右切口，同时套管与输液器相连，向右心室灌注加入肝素的生理盐水，直

至肺脏发白，血管冲洗干净;分离左肺下叶，注入4%多聚甲醛2ml见胸膜展平;结

扎气管后固定。常规酒精梯度脱水，石蜡包埋，切片，片厚5μm;用37℃生理盐

水灌洗右肺6次，回收灌洗液。经无数纱布滤过后，放入无菌离心管中，经离心、

甩片及HE染色;余组织－80℃冻存。用于Western-blot及应用氯氨T氧化-比色

法检测羟脯氨酸(HYP)。

1.2.3免疫组织化学法

通过免疫组织化学法检测TGF-β1亚组、LY294002亚组、对照亚组、空白组

PI3K蛋白的表达，Anti-PI3K/P85:1∶150。应用双盲法进行评估，SABC染色法

(×100)，结果以棕黄色连续或灶性颗粒分布为表达阳性，在显微镜下随机选择10

个高倍镜(400×)视野计数，每个区域计数100个，共1000个细胞，计算出阳性

细胞的百分数。根据染色强度着色细胞百分数积分之积判断结果，即:≤4分为(－);

＞4且≤8为(+);＞8且≤12为(++);＞12且≤16为(+++)。

1.3统计学处理

应用SPSS16.0软件进行统计学数据分析，数据均用表示。组间比较采用t检验，

多组间的比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1肺组织病理学检查

博来霉素注射后3d，HE染色(×40)，实验组各组小鼠肺小血管扩张、充血、肺泡

腔内出现红细胞及炎性细胞，肺间质内细胞增多，空白组小鼠无明显变化。7d后，

单纯TGF-β1，对照组，两组小鼠肺间隔轻中度间质细胞增多及胶原样物质明显增

生，肺组织结构紊乱;联合TGF-β1+SB-431542组，联合TGF-β1+LY294002组

两组胶原物质继续增生，空白组无明显变化。14～28d，单纯TGF-β1组肺间隔明

显增宽，肺泡间隔内成纤维细胞及胶原样物质明显增多，肺泡结构紊乱、萎陷;联

合TGF-β1+SB-431542组，联合TGF-β1+LY294002组，对照组三组小鼠肺泡

间隔继续增宽，空白组变化不明显。单纯TGF-β1组，羟脯氨酸(HYP)量明显高于

其他两实验组及对照组(P＜0.01);联合F-β1+SB-431542、TGF-β1+LY294002组

及对照组明显高于空白组(P＜0.05)。

2.2TGF-β1亚组、LY294002亚组、对照亚组、空白组PI3K蛋白表达

PI3K主要分布在细胞核外，呈棕黄色(图1)，经分析可知，TGF-β1组PI3K表达

明显高于其余3组，同时TGF-β1+LY294002组亦高于空白组，并且对照组也高

于空白组。

图1免疫组化观察PI3K表达及分布(SABC×100)

3讨论

近年来［4～6］，许多研究发现肺纤维化疾病越来越成为威胁人们身体健康的重

要疾病之一，国内外关于肺纤维化发展机制的研究也一直比较热门。较为认可的观

点是:肺成纤维细胞是肺纤维化发展过程中的主要效应细胞，其承担着合成和分泌

细胞外基质，同时肺纤维化过程以过度增生、合成胶原增多为主要特征。有研究证

实:TGF-β1是促成成纤维细胞形成的关键因子，是胶原合成最直接和有效的刺激剂。

甚至有报道称:肺内高浓度TGF-β1会导致肺组织细胞外基质沉积显著增加。目前

关于TGF-β1促成肺成纤维化细胞激活的具体机制了解仍然不够透彻，但有研究报

道，其可能与Smad家族的信号通路转导有关，并且受到多种细胞因子、生长因

子等调控，如PI3K等。

PI3K已发现可参与多种信号通路［6～8］，调节细胞各种功能。被激活时可作为

第二信使结合并激活多种细胞内靶蛋白，组成一个信号级联系统。近年来，关于

PI3K信号系统在肺相关疾病发展过程中的研究较热，主要发现其是多种生长因子

信号途径关键分子，多种生长因子通过它调控细胞增殖、凋亡、分泌、合成等。

本研究以TGF-β1与细胞质内信号通路重要信号分子PI3K关系为研究对象，通过

构建小鼠肺纤维化模型，探讨TGF-β1通过PI3K调控肺纤维化进展的可能机制。

研究发现，利用博来霉素能够成功构建小鼠肺纤维化模型，分析发现，实验组肺纤

维化发展过程呈现出典型的疾病过程，早期以肺泡炎症为主，炎性细胞侵润，继而

多形核白细胞、单核/巨核细胞等侵润，肺泡间隔增宽，肺组织结构受损，为典型

肺泡炎期;7～14d期间，实验组肺纤维组织增生，尤其TGF-β1最为明显，TGF-

β1+LY294002组肺纤维组织相对较少;28d时，TGF-β1组，小鼠稳定肺纤维化形

成，肺结构完全紊乱，炎性细胞明显减少;而TGF-β1+LY294002组，小鼠炎性细

胞依然较多，肺结构依然较清晰，但肺纤维化组织继续增多。通过分析对比各组羟

脯氨酸(HYP)量的变化，也证实我们病理观察结果，于14～28d期间，TGF-β1组

明显高于TGF-β1+LY294002组，并且两者都显著高于空白组(P＜0.05)。

结论提示:TGF-β1是肺纤维化进展过程中重要的因素，这与多数研究报道相符，同

时，我们发现PI3K可能可以影响TGF-β1促肺纤维化形成的进程，其可能是

TGF-β1促肺纤维化形成的重要机制之一。

在随后我们的分析中发现，相对对照组，空白组、实验各组PI3K明显高表达，表

明PI3K参与肺纤维化形成，是肺纤维化进展过程中重要的因素，同时通过分析

TGF-β1组与TGF-β1+LY294002组，发现无论病理结果抑或HYP量的变化，后

者都明显下降，在肺纤维化中后期表现尤为明显［8～10］，这说明抑制PI3K可

以影响肺纤维化发展，阻碍TGF-β1促肺纤维化形成，提示PI3K是TGF-β1促肺

纤维化形成机制的重要信号分子。肺纤维化是一种慢性进行性疾病，其病因复杂，

发病机理尚不十分清楚，探讨阐述其发病机制迫在眉睫。本研究通过对PI3K与

TGF-β1在肺纤维化过程中作用进行研究，部分地阐述了生长因子影响肺纤维化的

机制，为人们开展控制和治疗肺纤维化疾病提供了重要理论依据。

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