t载体

pGEM-T载体使用说明

概述

经TaqDNA聚合酶扩增后的PCR产物末端都带有单个A。正是基于这一原理，pGEM质粒经

EcoRV切成平端后，在开口端加上一个T制成T载体，一方面避免了自身环化，另一方面由

于T-A互补，从而提高了T载体与PCR产物之间的连接效率。由于T-A克隆只需纯化PCR产物，

因而操作较为简便。

pGEM-Tvector含丝状噬菌体f1的复制起始区，用于产生环状ssDNA；含有T7和SP6RNA聚

合酶启动子；在多克隆区域具有编码β-半乳糖苷酶的基因(LacZ)，插入失活α-肽可在指示平

板上通过蓝、白菌落直接筛选重组菌落。

pGEM-TVector图谱

ThepromoterandmultiplecloningquenceofthepGEM-TVector

产品特点

1.克隆PCR产物

2.通过多克隆区域两侧的T7和SP6RNA聚合酶启动子进行体外转录

3.产生ssDNA

4.通过蓝、白菌落筛选重组体

5.多克隆区域提供选择克隆的酶切位点

包装及组成

pGEM-T载体(50ng/µl)20µl20次

操作方法

A.连接

在0.2ml或0.5ml反应管中加入下列成分

pGEM-T50ng

纯化的PCR产物10-50ng

T4连接酶2-3weissunits

10×连接缓冲液1µl

补超纯水至总体积为10µl，可以16℃或4℃过夜。

B.转化

1、将50µl感受态细胞JM109或DH5α于冰浴上解冻。

2、将5µl连接产物与感受态细胞混匀，冰浴30分钟。

3、42℃热休克90秒，立即冰浴3-5分钟。

4、加入400µl预冷的LB液体培养基，37℃轻摇培养45-60分钟。

5、取200µl在LB固体培养基（+Amp/IPTG/X-Gal）上铺板，自然干燥5-10分钟，37℃倒

置培养过夜。

C.鉴定

经12-16小时培养后，培养皿上生长着许多白色和蓝色菌落，蓝色菌落只含有载体，而

白色菌落为DNA重组子（载体+插入片段）。可通过PCR、限制性酶切或测序进一步鉴定阳

性克隆。

注：具有3'→5'外切核酸酶活性的高保真DNA聚合酶如Pfu、Vent聚合酶不能用于T-A克

隆。

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