免疫组化sp法

一、定义

免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合

的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）

显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研

究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术

(immunocytochemistry)。

二、原理

抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，免疫组织化学正是利用了这一原理。

先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫

动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。

由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗

体结合的部位显示出来，以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或

定量的研究。

三、分类

免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白

法、免疫金法及放射免疫自显影法等。

这些常用免疫组织化学方法的原理如下：

1.免疫荧光细胞化学技术

将已知抗体标上荧光素,以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原,在荧光显

微镜下观察.当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后会发出一定波长的

荧光,从而可以确定组织中的抗原定位或定量.

2.免疫酶细胞化学技术

是目前免疫组织化学研究中最常用的技术．基本原理是先以酶标记的抗体与组织

或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的

颗粒，通过光镜或电镜，对细胞或组织内的相应抗原进行定位或定性研究．

3.免疫胶体金技术

就是用胶体金标记一抗，二抗或其他的能特异性的结合免疫球蛋白的分子（如葡

萄球菌A蛋白）等作为探针对组织或细胞内的抗原进行定性，定位或定量研究．由

于胶体金的电子密度高，多用于免疫电镜的单标记或多标记的定位研究．

四、作用

实验所用的标本

实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理切片和组

织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。其中石蜡切片

是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，

有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对

组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标

本制作方法。

实验所用的抗体

免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体，单克隆抗体是一个B

淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体

是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B

淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。

常用的染色方法

根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是

以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏

感性更高，有利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物

素—抗生物素染色法最常用。

五、步骤

免疫组化（SP法）操作步骤

1．切片常规脱蜡至水。如需抗原修复，可在此步后进行

2.缓冲液洗3min/2次。

3.为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色，将切片放在

HydrogenPeroxideBlock中孵育10-15分钟。

4.缓冲液洗5min/2次。

5.滴加UltraVBlock，在室温下孵育5分钟以封闭非特异性的背

景染色。

（注：孵育不要超过10分钟，否则会导致特异性染色降低。如果一抗

的稀释液中含有5－10%正常羊血清，这一步可以省略。）

6.缓冲液洗5min/2次。

7.滴加一抗工作液37℃孵育1－2小时。（具体孵育时间和温度由

试验者最终决定）

8.缓冲液洗5min/2次。

9．滴加PrimaryAntibodyEnhancer（增强子），在室温下孵育20分

钟。

10．缓冲液洗5min/2次。

11．滴加HRPPolymer（酶标二抗），在室温下孵育30分钟。

（注：HRPPolymer对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明

的小瓶中。）

12．缓冲液洗5min/2次。

13．向1mlDABPlusSubstrate（或AECPlusSubstrate)中滴加

1-2滴DABPlusChromogen（或AECPlusChromogen），混匀后滴加到切

片上，孵育3－15分钟。（具体时间由染色深浅决定。）

14．自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。

免疫组化操作步骤

⑴、石蜡切片脱蜡至水。

⑵、3%H2O2室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。

⑶、蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟x2（如需抗原修复，可在此步后

进行）。

⑷、5-10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟，倾

去血清，勿洗。滴加一抗工作液，37℃孵育1-2小时或4℃过夜。

⑸、PBS冲洗，5分钟x3次。

⑹、滴加适量生物素标记二抗工作液，37℃孵育10-30分钟。

⑺、PBS冲洗，5分钟x3次。

⑻、滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37℃

孵育10-30分钟。

⑼、PBS冲洗，5分钟x3次。

⑽、显色剂显色3-15分钟（DAB3,3,二氨基联苯胺（DAB）染色剂类

或NBT/BCIPBCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒）

⑾、自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。

免疫组化染色步骤

冰冻切片4-8μm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS

洗，5分钟x3，用过氧化氢孵育5-10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。