细粒棘球绦虫

３３０ 中国人兽共患病学报

Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ ２０１０。２６（４）

文章编号：１００２—２６９４（２０１０）０４—０３３０—０３

细粒棘球绦虫（中国大陆株）亲肌肉抗原重组蛋白

的免疫保护性研究＊

马 锐 ，师志云 ，李昭宇 ，王娅娜。，李宗吉。，赵巍

摘 要：目的 探讨细粒棘球蚴（Ｅｃｈｉｎｏｃ ＣＵＳ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ，Ｅｇ）亲肌肉抗厚重组蛋白的免疫保护性及其作为候选疫苗的潜

在价值。方法 ＩＣＲ小鼠随机分为蛋白免疫组和庄剂对照组，每隔２ｗ皮下免疫１次，在第３次免疫后２周，用Ｅｇ原头蚴进

行攻击感染，感染后２０ｗ剖杀小鼠，检获棘球蚴包囊，计算免疫保护力，并用ＥＩ ＩＳＡ法测定血清中ＩｇＧ及其亚型和ＩｇＥ水平。

结果 与佐剂对照组比较，蛋白免疫组小鼠的免疫保护力为９４．４６ ；与免疫前比较，免疫后和攻击感染后蛋白免疫组小鼠血

清ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３和ＩｇＥ水平均明显升高（Ｐ＜０．０５），ＩｇＧ２ｂ降低（Ｐ＜Ｏ．０５）。结论 细粒棘球绦虫亲肌肉抗原重组蛋自能

诱导小鼠产生一定的保护性免疫，是潜在的疫苗候选抗原分子。

关键词：细粒棘球蚴；Ｅｇ ｍｙｏｐｈｉｌｉｎ重组蛋白；免疫保护

中图分类号：Ｒ３８３．３文献标识码：Ａ

Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅｇ ｍｙｏｐｈｉｌｉｎ ａｇａｉｎｓｔ

Ｅｃ ｆ ＤｃＤｃｃ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｍａｉｎｌａｎｄ ｓｔｒａｉｎ）ｉｎ ｍｉｃｅ

ＭＡ Ｒｕｉ ，。，ＳＨＩ Ｚｈｉ—ｙｕｎ ，ＬＩ Ｚｈａｏ—ｙｕ。，ＷＡＮＧ Ｙａ—ｎａ。，ＬＩ Ｚｏｎｇ—ｊｉ。，ＺＨＡＯ Ｗｅｉ

（Ｎｉｎｇ￣’ｉａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙｉｍｈ““”７５０００４，Ｃｈｉｎａ）

ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｅｃｈｉｎｏｃｏ￣（“ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ

Ｅｇ（ｒＥｇ）ｍｙｏｐｈｉｌｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｖａｌｕｅ ａｓ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ，ＩＣＲ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｓｕｂｃｕｔａｎｅ０ｕｓ１ｙ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｔｈｒｅｅ ｔｉｍｅｓ ｗｉｔｈ

ｒＥｇ ｍｙｏｐｈｉｌｉｎ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ ｗｉｔｈ Ｅ．ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ．Ｗｉｔｈ ａｄｊｕｖａｎｔ ｇｒｏｕｐ ａｓ ｃｏｎｔｒｏｌ，ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｒｅｄｕｃｅｄ ｈｙｄａｔｉｄ ｃｙｓｔ ａｎｄ

ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＩｇＥ，ＩｇＧ ａｎｄ ＩｇＧ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ ｉｎ ｓｅｒａ ｗｅｒｅ ｅｘａｍｉｎｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｒｅｄｕｃｅｄ ｈｙｄａｔｉｄ ｃｙｓｔ ｉｎ

ｒＥｇ ｍｙｏｐｈｉｌｉｎ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ９４．４６ ，ａｎｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＩｇＧ，ＩｇＧ１，ＩｇＧ３ ａｎｄ ＩｇＥ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ．ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ １ｅｖｅ１ ｏｆ ＩｇＧ２ｂ ｄｅ—

ｃｒｅａｓｅｄ ｒｅｍａｒｋａｂｌｙ．Ｉｔ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｒＥｇ ｍｙｏｐｈｉｌｉｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｃａｎ ｉｎｄｕｃｅ ｐａｒｔｉａｌ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｅ．ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ，

ａｎｄ ｉｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａ１ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ．

ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ：Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃ￣Ｕ５ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ；ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅｇ ｍｙｏｐｈｉｌｉｎ；ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ

囊性包虫病（ｃｙｓｔｉｃ ｅｃｈｉｎｏｃ’ｏｅｃｏｓｉｓ，ＣＥ）是由细

粒棘球蚴绦虫（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ，Ｅｇ）幼虫

引起的一种人畜共患寄生虫病，虽呈全球性分布，但

主要流行于高原和气候寒冷的畜牧业地区，如亚洲，

非洲，欧洲，北美洲、澳大利亚等。 。据ＷＨＯ报

告 ：发病最为严重的北非突尼斯人群的发病率为

１．５－－－２．０５／１０万。我国是包虫病发病最高的国家

之一，以疆、青、甘、宁、藏、内蒙和川Ｉ西较为严重。疫

苗防治是控制包虫病流行的最有效的方法 。本

课题小组根据ＧｅｎＢａｎｋ公共数据库检索出细粒棘

球蚴亲肌肉抗原基因的已知序列并设计引物，通过

ＲＴ－ＰＣＲ技术克隆出目的基因，并在大肠埃希菌

（Ｅ．ｃｏｌｉ）中表达重组蛋白（ｒＥｇｍｙｏｐｈｉｌｉｎ），研究证

明原核表达的重组蛋白具有较好的抗原性和免疫原

性 。本次研究以Ｅｇｍｙｏｐｈｉｌｉｎ为候选疫苗抗原

分子免疫小鼠，细粒棘球蚴原头蚴攻击后观察其诱

导的免疫保护力和抗体水平，为疫苗研制研究奠定

基础。

１材料与方法

１．１材料

１．１．１ 实验动物 ６—８ｗ龄雄性ＩＣＲ小鼠，体重

（１８±２）ｇ，共２４只，购自宁夏医科大学实验动物

中心。

１．１．２细粒棘球蚴原头蚴 从宁夏医科大学附属

＊国家自然科学基金（Ｎｏ：３０２６０１０５；Ｎｏ：３０６６０１７６）和宁夏自然科

学基金（Ｎｏ：ＮＺ０５４０）联合资助

通讯作者：赵巍，Ｅｍａｉｌ：ｚｗ－６９１５＠ｌ６３．ｃｏｒｎ

作者单位：宁夏医科大学，银，Ｉ Ｊ ７５０００４

中国人兽共患病学报

Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ ３３１

医院肝胆外科包虫病患者手术摘除的完整包囊中无

菌条件下抽取囊液，分离原头蚴，经ＰＢＳ（ｐＨ７．２）洗

涤３次后，弃去上清液，用０．５ 伊红染色计数原头

蚴的着色率及形态，原头蚴的存活率＞９０ ，用ＰＢＳ

配成１．５×１０ 个原头蚴／ｍＬ悬液，用于攻击感染

ＩＣＲ小鼠。

１．１．３ 细粒棘球蚴重组蛋白Ｅｇｍｙｏｐｈｉｌｉｎ：由本室

构建 。

１．１ ４主要试剂辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的

羊抗鼠ＩｇＯ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ ＩｇＧ３和ＩｇＥ购自

华美生物工程公司北京分公司。

１．２方法

１．２．１ 动物分组及免疫将ＩＣＲ小鼠随机分为蛋

白免疫组和佐剂对照组，每组１２只。两组小鼠在

０、２、４ｗ各免疫１次，共３次，第１次基础免疫注射

１０ ｇ ｒＥｇｍｙｏｐｈｉｌｉｎ和等量弗氏完全佐剂，以后２

次为加强免疫均用ｌ０／ｘｇ ｒＥｇｍｙｏｐｈｉｌｉｎ和等量弗氏

不完全佐剂。佐剂对照组免疫方案相同，只注射弗

氏佐剂和ＰＢＳ。两组均采用背部皮下多点注射免

疫，每次注射量为１００ ＩｘＬ／只。于０、２、４、８ｗ从鼠尾

各采血１次，将血液４ ０００ ｒ／ｒａｉｎ离心１０ ｍｉｎ，吸取

血清，一８５℃保存。

１．２．２攻击感染 第３次免疫后２ｗ，蛋白免疫组

和佐剂对照组每只小鼠用ｌ ５００个活棘球蚴原头蚴

腹腔内注射进行攻击感染。攻击感染２０ｗ后剖杀

小鼠，眼球采血，分离血清。至实验结束时，蛋白免

疫组有２只小鼠死亡，佐剂对照组有３只小鼠死亡。

１．２．３观察免疫保护力指标

１．２．３．１ 免疫保护力 活棘球蚴攻击感染２０ｗ后

剖杀两组小鼠，切开小鼠腹部，称取小鼠脾脏，计算

脾指数，公式：脾指数一脾的重量（ｍｇ）／ｉＪ，鼠体重

（ｇ）；计数肝脏及肠系膜处的棘球蚴包囊。根据

Ｄｅｍｐｓｔｅｒ 计算免疫保护力，公式：免疫保护力

（ ）一（１一免疫组平均包囊数／对照组平均包囊数）

×１００％。

１．２．３．２常规ＥＬＩＳＡ检测ＩｇＧ及其亚型和ＩｇＥ抗

体用终浓度为１０＞ｇ／ｍＬ ｒＥｇｍｙｏｐｈｉｌｉｎ－－碳酸缓

冲液（ｐＨ ９．６）包被９６孑Ｌ酶标板，１００ Ｌ／孔，４℃过

夜；次日用ＰＢＳ洗板３次，５ 脱脂奶粉３７℃封闭２

ｈ；加１：１００稀释的蛋白免疫组鼠血清，１００ Ｌ／孔，

３７℃反应２ ｈ，ＰＢＳ洗板３次；加入ｌ：１０００稀释的

羊抗鼠Ｉｇ—ＨＲＰ １００ Ｌ／孔，３７℃反应２ ｈ，ＰＢＳ洗

板３次；加四甲基联苯胺（ＴＭＢ）底物溶液，１５ ｍｉｎ

后用２ ｍｏｌ／Ｌ Ｈ ＳＯ （５０ｖＬ／￣Ｌ）终止反应，用酶标

分析仪测定每孔Ａ 值。

１．２．４统计学处理采用ＳＰＳＳ １１．０软件进行分

析，组间比较用单因素方差分析（ＡＮＯＶＡ）。

２ 结 果

２．１ ｒＥｇｍｙｏｐｈｉｌｉｎ诱导小鼠抗包虫感染的保护作

用 蛋白免疫组和佐剂对照组的棘球蚴包囊平均直

径分别为０．８ｍｍ和７．８ｍｍ，包囊数目分别为０．７４

±２．１Ｏ和７．８３±１７．２１个，同时ｒＥｇｍｙｏｐｈｉｌｉｎ免疫

ＩＣＲ小鼠可获得９４．４６ 的免疫保护力。

２．２蛋白免疫组小鼠ＩｇＧ及其亚型和ＩｇＥ抗体检

测结果蛋白免疫组小鼠血清ＩｇＯ、ＩｇＧ１和ＩｇＥ水

平，免疫后与免疫前相比均明显增加（Ｆ一１４５６．４８、

６．９９、４９．８４，Ｐ＜０．０５），感染后小鼠血清ＩｇＧ、

ＩｇＧ１、ＩｇＧ３和ＩｇＥ水平与免疫前相比均明显增加

（Ｐ％０．０５），而感染后小鼠血清ＩｇＧ３和ＩｇＥ水平与

免疫后相比明显升高（Ｆ一２４．５９、４９．８４，Ｐ＜０．０５）；

与免疫前相比，小鼠血清ＩｇＧ２ｂ在感染后明显降低

（Ｆ＝＝＝７．０９，Ｐ＜０．０５），感染后小鼠血清ＩｇＧ２ｂ水平

与免疫后相比明显降低（Ｐ％０．０５）；与免疫前相比，

小鼠血清ＩｇＧ２ａ在免疫后和感染后无明显变化（Ｆ

一０．７４，Ｐ＞Ｏ．０５，表１）。

表１ ｒＥｇｍｙｏｐｈｉｌｉｎ免疫前、后和攻击感染后小鼠血清抗体检测（ｉ，ｎ＝８）

Ｔａｂｌｅ ｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｉｍｍｕｎｏｇｉｏｂｕｌｉｎ ｉｎ ｓｅｒａ ｏｆ ｍｉｃｅ ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒＥｇｍｙｏｐｈｉｌｉｎ ａｆｔｅｒ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（，ｎ＝８）

注：与免疫前比较，＊Ｐ％０．０５；与免疫后比较， Ｐ＜Ｏ．０５

３讨 论

寄生虫的体液免疫方面，众多学者研究的比较

多的是ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３及ＩｇＥ等。

ＡＩ—Ｑａｏｕｄ等∞ 用抗原Ｂ（ＥｇＡｇＢ）免疫Ｂａｌｂ／ｃ小

３３２ 中国人兽共患病学报

Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａ１ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ ２０１０，２６（４）

鼠，其减蚴率为９８．３ ，且从免疫后的１月直到实

验结束（７月）所有ＩｇＧ亚型都是逐渐升高的。Ｂ抗

原是较好的诊断抗原，是与包虫病免疫逃逸机制有

关的抗原，在感染Ｅｇ的羊和小鼠体内，宿主的ＩｇＧ

和包囊壁相结合，构成宿主免疫屏障来完成免疫逃

逸，因此，体液免疫指标可提高对ＣＥ的诊断效率及

反映免疫逃逸的机制。Ｗｏｏｌｌａｒｄ等 将４种Ｅｇ９５

合成肽加用或不用弗氏佐剂肌肉注射免疫６～１２月

龄绵羊２次后发现第１次免疫后３周羊血清抗

Ｅｇ９５的ＩｇＧ２水平升高，持续１年以上，该抗体在体

外可杀伤Ｅｇ虫卵的六钩蚴，提示ＩｇＧ抗体参与了

Ｅｇ９５诱导的保护性免疫，并且认为保护力主要是由

抗体介导的。林勇等 ∞将１００／ｘｇ的ｐＣＤ—Ｅｇ９５皮

下注射Ｂａｌｂ／ｃ小鼠５次，在免疫后４～１０ｗ发现鼠

血清ＩｇＧ升高，在免疫后２～１０ｗ发现鼠血清

ＩｇＧ２ａ增加；丁剑冰等 ”将５０ｇｇ Ｅｇ９５重组蛋白加

弗氏佐剂皮下注射免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠４次后发现第１

次免疫后２ｗ抗Ｅｇ９５的ＩｇＧ升高，且免疫后６－－８ｗ

达最高水平，滴度可达１：２５ ６００。目前的研究结果

显示用活的虫卵或者六钩蚴免疫小鼠主要产生

ＩｇＧ１和ＩｇＧ３亚型 。本实验将ｒＥｇｍｙｏｐｈｉｌｉｎ免

疫小鼠，原头蚴攻击后发现小鼠血清ＩｇＧ、ＩｇＧ１、

ＩｇＧ３和ＩｇＥ在免疫后以及感染后显著增加；ＩｇＧ２ａ

水平增加不明显，ＩｇＧ２ｂ水平先增加后降低，表明

ｒＥｇｍｙｏｐｈｉｌｉｎ能够诱导小鼠产生很强的体液免疫

反应，提示ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ和ＩｇＥ抗体在抗包虫

感染过程中可能起重要作用，其保护性免疫机制有

待于进一步深入研究。

程宁等“∞用ｌｍｇ的Ｅｇ囊液抗原和原头节抗

原加弗氏佐剂分别皮下注射免疫昆明种小鼠３次，

首次免疫后４周用４０００个Ｅｇ原头节进行攻击感

染，感染后２８ｗ剖杀各组小鼠发现Ｅｇ囊液抗原组

和原头节抗原免疫组的减蚴率分别为５１．７０ 和

７７．１Ｏ ，证明免疫的方法可以用于防止包虫蚴虫的

感染。据此本实验在成功制备大量纯化ｒＥｇ—

ｍｙｏｐｈｉｌｉｎ蛋白的基础上，用该重组蛋白免疫ＩＣＲ

小鼠，相对于佐剂对照组可获得９４．４６％的免疫保

护力，免疫小鼠后可诱导产生较高的抗体水平，初步

认为ｒＥｇｍｙｏｐｈｉｌｉｎ作为疫苗候选抗原具有一定的

潜在价值。

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收稿日期：２００９—０７—１８：修回日期：２００９一ｌ２—２６