d101大孔树脂

大孔树脂吸附法纯化黄芪总皂苷的工艺研究

蒋思德;夏玉凤;戴岳

【摘要】采用大孔树脂吸附法富集纯化黄芪总皂苷,以HPLC-ELSD法测定黄芪甲

苷的含量作为考察指标,筛选了树脂型号、吸附流速、洗脱溶剂、洗脱流速以及洗

脱溶剂用量等工艺条件.结果表明:最佳工艺为选择D101型大孔树脂,吸附流速为2

BV·h-1,洗脱流速为4BV·h-1,收集5BV的70％乙醇部分,得到的黄芪总皂苷纯化

效果最好,黄芪甲苷的转移率可达93.21％.

【期刊名称】《中国野生植物资源》

【年(卷),期】2013(032)001

【总页数】4页(P18-20,28)

【关键词】黄芪总皂苷;大孔吸附树脂;纯化工艺

【作者】蒋思德;夏玉凤;戴岳

【作者单位】中国药科大学中药药理教研室,江苏南京210009

【正文语种】中文

【中图分类】R284.2

黄芪为豆科植物蒙古黄芪［Astragalus

membranaceus(Fisch.)licus(Bge.)Hsiao］或膜夹黄芪

［Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.］的干燥根。具有补气升阳、固表止汗、

利水消肿、生津养血等功效［1］。其化学成分主要有皂苷、多糖和黄酮类等，其

中以黄芪甲苷为主的黄芪总皂苷是黄芪的主要有效部位，现代药理研究表明黄芪皂

苷在抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节及抗肺纤维化作用等方面有显著活性［2

－6］。大孔吸附树脂是20世纪60年代末发展起来的分离纯化技术，具有物理化

学稳定性高、选择性好、比表面积大、吸附容量大等优点。在中药化学成分提取，

特别是皂苷类成分的富集纯化方面被广泛使用和推广［7－8］，其较传统的正丁

醇萃取法有有机溶剂使用少、工艺简便、所得皂苷纯度高等优点。本研究采用灵敏

度较高的HPLC－ELSD检测法，以黄芪甲苷作为工艺研究的考察指标，对大孔树

脂富集纯化黄芪总皂苷的工艺条件进行了系统优化，以期为工业化生产提供理论依

据。

1材料与方法

1.1实验仪器和材料

1.1.1实验仪器

Agilent1200高效液相色谱仪(美国Aglient);Alltech3300ELSD蒸发光散射检测

器(ELSD，美国Alltech);BSA124S分析天平(赛多利斯科学仪器北京有限公

司);R201D旋转蒸发器(巩义市英峪高科仪器厂)。

1.1.2实验材料

黄芪饮片，购于南京药业股份有限公司，经中国药科大学夏玉凤副教授鉴定为豆科

植物蒙古黄芪［Astragalus

membranaceus(Fisch.)licus(Bge.)Hsiao］的干燥根;黄芪甲苷

对照品，纯度≥98%，购自南京泽朗生物医药科技有限公司;D101，AB－8，

DA201大孔吸附树脂，购自沧州宝恩吸附材料科技有限公司;乙腈为色谱纯，购于

德国Merk公司;甲醇、正丁醇、氨水等均为分析纯。

1.2实验方法

1.2.1大孔树脂的预处理

取大孔吸附树脂，用95%乙醇浸泡24h，除去悬浮物及杂质，湿法装柱，用95%

乙醇洗至洗脱液与水(1∶2)混合不产生浑浊，或置旋转蒸发仪上蒸干时无残渣。再

用水洗至无醇味，备用。

1.2.2样品溶液的制备

取黄芪药材饮片适量，加8倍量70%乙醇加热回流提取3次，每次2h，滤过，

合并滤液，减压回收溶剂后得浸膏。用适量水充分溶解后，4000r·min－1下离心

10min，取上清液，得到每1mL含0.5g生药的样品溶液。

1.2.3黄芪甲苷的测定

1.2.3.1色谱条件

色谱柱为AgilentC18柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为乙腈－水

(38∶62)，流速为1.0mL·min－1，进样量20μL;漂移管温度为75℃，氮气流速

1.5L·min－1。

1.2.3.2对照品溶液的制备

精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为

0.31mg·mL－1的对照品溶液。

1.2.3.3标准曲线的绘制

精密量取黄芪甲苷对照品溶液0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3mL置1mL容量瓶

中，加甲醇至刻度。分别精密吸取各对照品溶液20μL注入液相色谱仪，按

“1.2.3.1”项下色谱条件进行测定。以进样量(μg)的常用对数值为横坐标(X)，以

对照品峰面积的常用对数值为纵坐标(Y)，进行线性回归，得回归方程为:

Y=1.3514X+2.3088，r=0.9993。结果表明黄芪甲苷在1.86～4.96μg的范围

内与峰面积呈良好的线性关系。

1.2.3.4供试品溶液的制备

取样品溶液10mL置分液漏斗中，以水饱和的正丁醇萃取4次，每次20mL，合

并正丁醇萃取液。用25%氨试液洗涤2次，每次20mL，弃去氨水层。再用正丁

醇饱和的水洗涤2次，弃去水层，将正丁醇层减压回收至干，用甲醇溶解并定容

至10mL，得供试品溶液。并测得此方法的重复性为RSD=3.03%(n=6)，表明此

方法的重复性良好。

1.2.3.5精密度试验

精密吸取同一对照品溶液，重复进样6次，按上述色谱条件测定，其峰面积的

RSD为1.78%，表明仪器的精密度良好。

1.2.3.6稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，分别于0h，2h，4h，8h，12h，24h进样，按上

述色谱条件测定，其峰面积的RSD为1.84%。表明供试品溶液在24h内稳定。

1.2.3.7加样回收率实验

取已知含量的同一样品溶液6份，分别精密加入对照品溶液适量，按照上述方法

进行处理后测定，测得黄芪甲苷的平均加样回收率为103.67%，RSD=3.7%。

2结果与讨论

2.1大孔吸附树脂型号的筛选

取预处理好的D101，AB－8，DA201大孔吸附树脂各5g(湿重，沥干水分)，分

别装于同一规格的层析柱(18mm×200mm)中。取样品溶液(0.5g生药/mL)75

mL，以3BV·h－1流速进行动态吸附，完全吸附后静置2h。用100mL水洗后，

再用100mL70%的乙醇进行洗脱，收集乙醇洗脱液，按“1.2.3”项下方法测定

黄芪甲苷的含量，结果见表1。

表1大孔吸附树脂型号筛选结果注:转移率=醇洗脱液中黄芪甲苷的量/样液中黄芪

甲苷的量树脂型号样液中黄芪甲苷的量/mg醇洗脱液中黄芪甲苷的量/mg转移

率/%D10118.4815.9686.36AB－818.4815.3483.00DA20118.48

13.9975.74

结果表明D101树脂对黄芪甲苷的转移率大于其余两种树脂，因此优选D101树

脂来纯化黄芪总皂苷。

2.2动态吸附条件考察

2.2.1上样量的确定

取预处理好的D101树脂装柱，将总体积为480mL的样品溶液，以3BV·h－1

的流速进行动态吸附，收集流出液，每40mL收集一份，按“1.2.3”项下方法测

定每份中黄芪甲苷的含量。以收集的流份数为横坐标，黄芪甲苷的泄露百分率为纵

坐标，绘制泄露曲线，结果如图1。

图1黄芪甲苷的泄露曲线

由泄露曲线可知，上样至第6份时，黄芪甲苷已开始明显泄露，因此确定最大上

样量为240mL，即1g树脂可吸附10.79mg黄芪甲苷。

2.2.2吸附流速的考察

取预处理好的D101型大孔吸附树脂5份，每份13.5g(湿重，约20mL)装柱，

0.5g生药/mL的样品溶液240mL，分别按1BV·h－1、2BV·h－1、3BV·h－1、

4BV·h－1、5BV·h－1进行动态吸附，完全吸附后静置2h。先用200mL水洗，

再用100mL70%的乙醇进行洗脱，洗脱流速为3BV/h，收集醇洗脱液，测定其

黄芪甲苷的量，结果见表2。

表2吸附流速考察结果吸附流速/BV·h－1样液中黄芪甲苷的量/mg醇洗脱液中黄

芪甲苷的量/mg转移率/%162.3956.2390.13262.3960.0896.30362.39

59.6895.65462.3957.5192.18562.3953.9386.44

结果发现吸附流速为2BV·h－1时，D101大孔树脂对黄芪皂苷的转移率最大，故

优选2BV·h－1作为上样流速。

2.3动态洗脱条件考察

2.3.1洗脱溶剂的考察

取已处理好的D101树脂装柱，按优化的动态吸附条件完全吸附后后静置2h。先

用水洗至Molish反应呈阴性，再依次用20%、30%、50%、70%和95%乙醇各

100mL洗脱，洗脱流速为3BV·h－1，收集各洗脱液，按“1.2.3”项下方法测定

黄芪甲苷的含量，结果分别为0、0、3.37、19.28、23.79、3.54mg。由此可见，

黄芪总皂苷集中在50%～70%的乙醇浓度下被洗脱，并且70%乙醇的洗脱能力更

强，因此选择70%乙醇作为洗脱溶剂。而水和20%乙醇洗脱液中未检测到黄芪甲

苷，可作为除杂洗脱剂。

2.3.2洗脱体积的考察

取已处理好的D101大孔吸附树脂装柱，按优化的动态吸附条件完全吸附后静置2

h。用蒸馏水洗至Molish反应呈阴性，5BV20%乙醇除杂，再用70%乙醇洗脱，

每20mL(相当于1BV)收集1份，测定其中黄芪甲苷的量，结果如图2。

图2黄芪甲苷的洗脱曲线

由图2可知，在第5BV时，大部分黄芪甲苷被解吸下来，黄芪甲苷的累计洗脱率

达到90%以上，故确定洗脱剂用量为5倍树脂柱体积。

2.3.3洗脱流速的考察

取处理好的D101型大孔吸附树脂5份，按优化的动态吸附条件完全吸附后后静

置2h。先用10BV水洗脱，5BV20%乙醇除杂，再用5BV70%乙醇进行洗脱，

洗脱流速分别为1BV·h－1、2BV·h－1、3BV·h－1、4BV·h－1、5BV·h－1，

收集醇洗脱液，测定黄芪甲苷的量，结果如表3。

表3洗脱流速考察结果洗脱流速/BV·h－1样液中黄芪甲苷的量/mg醇洗脱液中黄

芪甲苷的量/mg转移率/%160.7754.7690.11260.7755.3691.08360.77

54.7690.11460.7757.3094.29560.7753.0587.30

由表3可知，当洗脱流速为4BV·h－1时，D101吸附树脂对黄芪甲苷的转移率最

高，因此选用4BV·h－1的流速作为洗脱流速。

2.4验证试验

取已处理好的D101型大孔吸附树脂3份，每份13.5g(湿重，约20mL)装柱，

0.5g生药/mL的样品溶液240mL，按2BV·h－1进行动态吸附，完全吸附后静

置2h。用10BV水洗至Molish反应呈阴性，5BV20%乙醇除杂后，再用5BV

70%的乙醇进行洗脱，洗脱流速为4BV·h－1，收集醇洗脱液，按“1.2.3”项下方

法测定黄芪甲苷的含量，结果如表4。

表4验证试验结果/%上样前溶液总黄芪甲苷量/mg黄芪甲苷纯度/%黄芪甲苷转

移率60.780.15100156.614.8893.14256.704.7393.29356.644.42

93.19平均值56.654.6893.21

由验证试验的结果可见，采用D101型大孔树脂纯化黄芪总皂苷的工艺稳定可靠。

样品溶液中黄芪甲苷的纯度为0.15%，经纯化后其纯度达到4.68%，纯度提高了

31倍，黄芪甲苷的转移率高达93.21%。表明用D101型大孔吸附树脂富集纯化

黄芪总皂苷是可行的。

3结论

通过动态吸附和解析法，发现非极性的D101树脂最适于黄芪总皂苷的纯化，其

工艺条件为:黄芪甲苷的上样量为10.79mg/g树脂，以2BV·h－1的吸附速率上

样，完全吸附后静置2h。用10BV水洗至Molish反应呈阴性，用5BV20%的

乙醇除杂，再用5BV70%的乙醇以4BV·h－1流速进行洗脱，所得黄芪总皂苷纯

化效果最好。

参考文献:

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部［S］.北京:中国医药科技出版社，

2010:283－284.

［2］张娟，陈建宗，张金平.黄芪甲苷体外抗乙型肝炎病毒的作用［J］.第四军

医大学学报，2007，28(24):2291－2293.

［3］LiXiang，HeDalin，ZhangLinlin，antioxidantagent，

astragalosides，preventsshockwave－inducedrenaloxidativeinjuryin

rabbits［J］.UrolRes，2006，34:277－282.

［4］刘明华，任美萍，陈健平.黄芪皂苷抗肿瘤活性研究［J］.中药药理与临床，

2009，25(2):68－70.

［5］杨小敏，徐晓武，卢荷莲，等.黄芪皂苷对小鼠腹腔巨噬细胞的免疫增强作

用［J］.中国免疫学杂志，2008，(3):804－807.

［6］贺兼斌，廖慧中，向志，等.黄芪甲甙对实验性肺纤维化大鼠瘦素表达的影

响［J］.中国现代医学杂志，2012，22(9):1－5.

［7］JiaGuangtao，mentandpurificationof

madecassosideandasiaticosidefromCentellaasiaticaextractswith

macroporousresins［J］.JChromatogrA，2008，1193:136－141.

［8］平静，李清，陈晓辉，等.大孔吸附树脂纯化山药总皂苷的工艺研究［J］.

中成药，2011，33(10):1810－1813.