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中国龙虾Pans1抗原表位研究及相关虾蟹类

蛋白进化分析

作者：黄于艺等

来源：《现代仪器与医疗》2013年第01期

摘要在Uniprot数据库中获得中国龙虾过敏原Pans1蛋白序列，使用DNAStar和

NetMHCⅡ分别预测B细胞和T细胞表位，并对其进行抗原性评分；使用Swiss-Model软件生

成其三维结构，并利用Ramachandranplot分析进行模型有效性评估。在Uniprot数据库搜集不

同种类的虾蟹原肌球蛋白序列，利用MEGA5.1用JTT+G模型构建ML（Maximum

Likelihood）进化树。结果显示，中国龙虾过敏原Pans1三维结构为2条相互缠绕的α-螺旋。

Pans1的B/T细胞共有抗原表位区域为81～95，146～157。同体型大小的虾蟹类之间，可能

更为容易产生种群间的交叉过敏反应。

关键词中国龙虾Pans1抗原表位进化分析

在2004年，国内已有学者证实龙虾是一种常见过敏

原[1]。甲壳动物过敏原蛋白主要有原肌球蛋白、副肌球蛋白和小清蛋白[2]，大多数具有

4.5左右的等电点，其分子量在23～64KD之间。龙虾中主要过敏原分子量在34KD左右[3]，

并鉴定为原肌球蛋白发挥[4]，引起IgE介导I型过敏反应[5]。一般用传统方法制取粗浸液，会

存在很多次要蛋白质条带[6]，包括过敏原性组分和非过敏原性组分，如果用这些成分复杂、

易降解且易受外源物质污染的粗浸液，对龙虾过敏性患者进行诊断和特异性免疫治疗，必然严

重影响诊治安全性。随着有效重组过敏原组分的诞生，运用相关过敏原弱化的计算机技术和基

因重组技术，得到过敏原性减弱的过敏原组分，有望为过敏反应相关疾病诊治提供安全和有效

的新途径。不同种虾类或蟹类之间，经常会聚类发生交叉过敏反应，除个人过敏体质因素外，

也可能因为不同种虾类和蟹类，从共同祖先进化历程中，有不同的进化速率。物种中进化速率

相似的，会逐渐成为进化中的一簇，这一簇里面不同物种，就有可能出现相似的基因和表型，

从而为不同种群间的交叉反应提供基因上的可能[7]。

1材料与方法

1.1材料

从Uniprot数据库搜寻得到的中国龙虾原肌球蛋白序列登录号为O61379。同时获得一些相

关虾蟹类原肌球蛋白序列。序列如下：

MKLEKDNAMDRADTLEQQNKEANIRAEKAEEEVHNLQKRMQQLENDLDQVQESLLKA

NTQLEEKDKALSNAEGEVAALNRRIQLLEEDLERSEERLNTATTKLAEASQAADESERMRKV

LENRSLSDEERMDALENQLKEARFLAEEADRKYDEVARKLAMVEADLERAEERAETGESKF

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1.2方法

1.2.1预测Pans1蛋白理化性质、二级结构和功能区域（1）ProtParam（http：

///protparam/），预测其氨基酸组成、分子量、等电点、亲水性等基本物理化学

性质；（2）SignaIP4.1[8]（http：///rvices/SignalP/）软件预测Pans1信号肽

区域；（3）TMHMM（http：///rvices/TMHMM-2.0/）软件预测Pans1跨膜

区域；（4）PSIPRED（http：///psipred）预测Pans1蛋白二级结构。

1.2.2预测Pans1蛋白的B细胞表位利用DNAStar预测序列不同区段的亲水性、表位可

及性、可塑性和抗原指数，经过综合分析，筛选出亲水性、表位可及性和抗原指数同为正值的

合适区段。

1.2.3预测Pans1蛋白的T细胞表位利用NetMHCⅡ预测T细胞表位，以9个为滑动肽，

预测不同区段与MHCII的结合能力，得出抗原性评分。

1.2.4预测Pans1蛋白的三维结构利用swiss-model在线服务器，通过自动比对方式模拟

出Pans1三维结构模型。并对其进行Ramachandranplot[9]分析，评价模拟结果的合理性和有

效性。

1.2.5Pans1及其虾蟹类原肌球蛋白进化分析利用MEGA5.1[10]软件，将获得虾蟹肌球蛋

白序列，进行蛋白水平musle比对，选好最佳模型。最后选定JTT+G模型构建ML（Maximum

Likelihood）系统发育树。

2结果与分析

2.1Pans1蛋白的基本理化性质

利用ProtParam预测得到分子式为C1341H2212N396O479S6，原子数为4434，分子量为

31.7KD，理论等电点为4.64，在氨基酸的分布上：Glu（E）55个，占20.1%，含量最高；其

次，Leu（L）33个，占12.0%；负电荷残基（Asp+Glu）总数为72，正电荷残基

（Arg+Lys）总数为46。不稳定系数为39.98，低于阈值40，该蛋白应为稳定蛋白。脂肪系数

为77.74，亲水性评估值为-1.123，分值越低，亲水性会越强，分值越高，则疏水性会越强，因

此判断该蛋白为亲水性蛋白。

2.2Pans1蛋白二级结构、蛋白信号肽、跨膜区分析预测

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用PSIPRED在线软件预测Pans1蛋白，结果显示：整个蛋白基因都以α-螺旋结构存在，

约占98%；而SignaIP和TMHMM预测的结果则显示，蛋白没有信号肽，也没有分割点，同

时属于非跨膜蛋白类。

2.3Pans1蛋白的B细胞抗原表位预测

B细胞表位形成，受到亲水性、表面可及性、可塑性和抗原指数4方面的影响。当亲水

性、表位可及性和抗原指数为正值时，则该位置比较适合形成表位[11]。通过用DNAStar软件

预测4个因素在Pans1蛋白不在同区域上的情况（见表1），综合分析后得出适合B细胞形

成抗原表位的区域有：4～22，59～71，86～99，109～130，146～157，167～179，200～

219。

2.4Pans1蛋白T细胞抗原表位预测

利用NetMHCⅡ对Pans1蛋白的T细胞抗原表位亲和力进行预测，结果显示亲和力高的

评分区域为68～95，138～159，179～187，215～231（见图1）。

2.5B细胞和T细胞抗原表位综合分析

结合上述Pans1蛋白的B细胞与T细胞抗原表位预测结果，对二者的重叠区域进行拟合

分析，Pans1蛋白B细胞与T细胞共同表位为81～95，146～157。

2.6Pans1蛋白三级结构预测

利用Swiss-Model模拟生成Pans1蛋白的三级结构，结果显示该蛋白为2条α-螺旋相互

缠绕（见图2）。使用Swiss-PdbViewer4.1软件内置的Ramachandranplot评价模拟结果的合理

性（见图3），几乎所有点均落在α-螺旋正常区域内，即第3象限黄圈内，而分布不合理点较

少，显示该蛋白只有微弱的空间结构位阻效应，不影响结构稳定[12]。可以认为Pans1主要是

由α-螺旋形成稳定的蛋白，与在线软件PSIPRED预测结果基本一致。

3Pans1相关蛋白的ML进化树分析

以中国龙虾Pans1蛋白氨基酸序列为基础，在Uniprot数据库搜索不同种类虾和蟹的原肌

球蛋白序列，利用MEGA5.1进行序列比对后，用JTT+G模型构建ML进化树。原肌球蛋白是

较为保守蛋白，如用于构建进化树，能较准确知道不同物种之间的亲缘关系。从进化树上看，

位于根部的是美洲海螯虾（O44119）、中华绒螯蟹（A4URH3），锯缘青蟹（A7L5V2），并

且美洲海螯虾进化更为原始，实际上其体型巨大而结构进化较慢。从进化树看到（见图4），

体型较小的对虾类聚在一大簇（图上为CLADE-Ⅰ），体型较大的蟹类、螯虾、龙虾类则聚在

另一大簇（图上为CLADE-Ⅱ）。体型较大蟹类、螯虾、龙虾类位于体型小的对虾类的外群，

进化更为原始，所以大型虾蟹类和小型虾类的共同祖先有可能为大型甲壳类动物。现存的虾类

蟹类，经过不断地自身基因进化，环境的作用，逐渐演化出现代大型虾蟹类和现代小型虾类2

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个分支，并存于地球上。中国龙虾位于大型虾蟹类簇CLADE-Ⅱ上，现实中其体型较大，与同

样体型较大的堪察加拟石蟹（o61379）和小龙虾（c0lu07）位于同一个小簇，亲缘关系较为相

近，而堪察加拟石蟹稍显得更原始。这个现象说明，作为虾蟹类常见过敏原原肌球蛋白，在同

体型的虾蟹类中，因为亲缘关系较近、近化程度相似，可能更为容易发生种群间的交叉过敏反

应。

4讨论

国内已有学者证实龙虾是一种常见过敏原[1]，海产品加工人员中，有34%接触性过敏反

应是因为接触龙虾而引起[13]。甲壳动物过敏原蛋白主要有原肌球蛋白、副肌球蛋白和小清蛋

白[2]。在中国龙虾过敏患者中，原肌球蛋白Pans1占据重要位置[14]。

Pans1作为亲水性蛋白，其一级结构显示性质较为稳定，不存在信号肽和跨膜区。用

PSIPRED预测其二级结构显示，整个蛋白基因都以α-螺旋结构存在，含量达98%。其后用

SWISS-MODEL在线服务器生成的三级结构验证，整个蛋白由2条α-螺旋相互缠绕而成，结构

较为紧密。使Swiss-PdbViewer4.1软件评估Pans1蛋白三维结构模拟，发现其预测结果在

Ramachandranplot分析中比较合理，提高三维结构和分子结构预测可信度。

运用DNASTAR软件，结合抗原指数、可塑性、亲水性，用抗原可能性等参数对Pans1

组分进行B细胞表位进行综合分析，发现2～50，59～71，81～99，107～140，146～157，

167～179，200～219，233～267有可能形成B细胞表位。而使用NetMHCII和Syfpeithi基于

神经网络原理预测T细胞表位发现，显示亲和力高的评分区域68～95，138～159，179～

187，215～231。根据上述分析结果，可推测最可能成为B细胞和T细胞共同表位区域为81～

95，146～157。这对下一步靶向突变氨基酸，弱化抗原，提供理论上准备。

另外一部分，本研究以中国龙虾Pans1蛋白氨基酸序列为基础，在Uniprot数据库搜索不

同种类的虾和蟹的原肌球蛋白序列，利用MEGA5.1进行序列比对后，用JTT+G模型构建ML

进化树。因为原肌球序列为保守序列，所以比较适合进化研究和亲缘性分析，有助于我们从进

化这个角度来探究交叉过敏反应的成因。从结果可以看到，小型虾类都聚在一簇，大型虾蟹类

聚在另一簇，而且大型的虾蟹类位于小型虾类的外群，说明大型虾蟹类在进化过程中比小型虾

类原始，且可能更接近于祖先形态，所以大型虾蟹类和小型虾类的共同祖先有可能为大型甲壳

类动物。虾类蟹类的祖先在进化中，经过不断的自身基因适应性变化及环境的作用，出现不一

样进化速率，而那些进化速率相似的物种，产生相似的基因型和表型，在进化上聚会一类，随

着时间累积，量变到质变的转换，逐渐演化出现代大型虾蟹类和现代小型虾类2个分支。中国

龙虾位于大型虾蟹类簇CLADE-Ⅱ上，而相似的基因型，就为交叉过敏反应提供基因上的可能

[7]。本例可体现为同体型的虾蟹类之间，因为亲缘关系较近，近化程度相似，可能更为容易

产生种群间的交叉过敏反应。具体来说，如果人对一种虾过敏，他可能对同一类的小型虾都有

过敏现象。同理，反之亦然。此推论将通过后续证据证实。

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总之，本研究利用生物信息学方法，对Pans1的理化特性和蛋白质二、三级结构进行模

拟，发现其作为一个稳定存在的过敏原组分的理论依据。同时对其可能的B细胞表位和T细

胞表位进行预测，并对其进行抗原性评分，得到高值位点。为以后的过敏原弱化工作及抗原表

位疫苗研究提供理论依据，为过敏患者进行相关预防、治疗具有一定现实意义。以中国龙虾

Pans1为基础，对虾蟹类原肌球蛋白进化分析，阐述交叉反应成因进化上的因素，为海鲜过敏

患者的交叉反应研究，提供新的路径。

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