逆流的色彩

高速逆流色谱法(HSCCC)分离制备香水莲花中的柚皮素

姜洪芳;石宝俊;赵伯涛;张卫明

【摘要】采用高速逆流色谱法对香水莲花中的黄酮类化合物进行了分离,溶剂系统

为正已烷-醋酸乙酯-甲醇-水(体积比1∶1.2∶2∶1),上层为固定相,下层为流动相,流

速2.0mL/min,转速830r/min,检测波长280nm,进样量300mg,分离出80mg

化合物C,经HPLC测定纯度＞98.6％,根据UV光谱、MS分析及1H-NMR、13C-

NMR图谱分析结果,化合物C鉴定为柚皮素,该化合物为首次从该植物中分离得到,

为香水莲花的开发应用提供了理论依据.

【期刊名称】《中国野生植物资源》

【年(卷),期】2012(031)006

【总页数】4页(P40-43)

【关键词】高速逆流色谱法;高效液相色谱法;香水莲花;柚皮素

【作者】姜洪芳;石宝俊;赵伯涛;张卫明

【作者单位】南京师范大学,江苏南京210046;南京野生植物综合利用研究院,江苏

南京210042;南京野生植物综合利用研究院,江苏南京210042;南京野生植物综合

利用研究院,江苏南京210042;南京师范大学,江苏南京210046;南京野生植物综合

利用研究院,江苏南京210042

【正文语种】中文

【中图分类】R284.2

香水莲花(Nymphaeahybrid)是睡莲科(Nymphaea)睡莲属热带大型睡莲，是一

种多年生宿根水生花卉，有很高的观赏价值。香水莲花花朵硕大、色彩鲜艳，香气

清雅宜人，集当今世界各地荷、莲珍贵品种之优点于一身，因而成为备受青睐的园

林水生观赏花卉。近年来我国南方数省已开始引种，并且发展到了一定的规模。源

于香水莲花的各种产品也开始不断开发，鲜花可供生食，亦可泡茶、浸酒或随其他

食物炖煮，以子房连同雄蕊一起经高温烘焙制成的香水莲花茶，也有以其提取物制

成的九品莲花酒等等，均具有一定的保健作用［1－3］。动物实验已经证明香水

莲花具有降血脂、抗氧化、抑制酪氨酸酶及预防酒精肝［4－7］等生物活性，但

化学成分研究相对较少。

高速逆流色谱(High－speedCountercurrentChromatography，简称HSCCC)

技术是应用两相互不混溶的溶剂系统在支撑管内高速行星运动的方式下进行天然产

物的分离纯化，因而没有不可逆吸附，具有样品无损失、无污染、高效、快速和大

制备量分离的优点。所以，在国内外已被广泛应用于生物、医药、环保和农业等领

域中活性物质的分离纯化［8－10］。本文应用高速逆流色谱(HSCCC)对香水莲花

的黄酮类化合物进行了纯化，经鉴定为柚皮素，此化合物为首次从该植物中分离得

到，为香水莲花的进一步开发应用奠定了化学基础。

1实验部分

1.1仪器、试剂与材料

高速逆流色谱仪:TBE－300A半制备型(上海同田生化技术有限公司)，TBD－2000

紫外检测仪，TBP－50A恒流泵，TC－1050恒温循环器，聚四氟乙烯(PTFE)管分

离柱(内径1.6mm，分离柱体积280mL)，N2000色谱工作站和溶剂选择系统(浙

江大学智达信息工程有限公司)，进样环20mL。

高效液相色谱仪:Agilent1200HPLC(美国安捷伦公司)，G1354A四元泵，

G1313A自动脱气机，G1316柱温箱，G1315B二极管阵列检测器。

HP1100LC－MSD型质谱仪;BRUKERAVANCE500型核磁共振仪;

色谱柱:Ф7.8cm×75cm;

超声波清洗器:KQ－600DE型(昆山市超声仪器有限公司)

薄层层析用硅胶H，柱层析硅胶160～200目，青岛海洋化工厂生产;

萃取及硅胶柱分离、HSCCC分离用的试剂石油醚、氯仿、甲醇、乙酸乙酯和正己

烷均为分析纯，高效液相色谱(HPLC)分析用甲醇为色谱纯，实验用水为超纯水。

香水莲花带雄蕊的干燥花托，浙江省温州市三心美德投资有限公司提供。七月采摘，

剥去萼片和花瓣，贴近花托基部切去花梗，晒干或烘干。经鉴定其基原为

Nymphaeahybrid。

1.2实验方法

1.2.1粗提物的制备

称取70℃干燥2h的香水莲花2.74kg，用75%乙醇浸泡过夜，加热回流提取2

次，1h/次，提取液合并浓缩至无醇味，加入少量的水，离心后得到3个不同部

分:上层为橙黄色油状物;中间层为橙红色水溶液;底层为黄色沉淀物，薄层层析检测

表明底层黄色沉淀物以黄酮类物质为主，用乙酸乙酯回流提取3次，回收乙酸乙

酯，干物质重40g，作为硅胶柱分离用样品。

1.2.2硅胶柱层析分离

称取160～200目柱层析用硅胶2000g，干法装柱(Ф7.8cm×75cm)。将1.2.1

中得到的样品以适量醋酸乙酯溶解，硅胶拌样上柱。以石油醚－乙酸乙酯梯度洗脱，

每500mL为一流分，经薄层层析检测后合并相同流分，108－112流分经鉴别主

要为黄酮类化合物，作为高速逆流分离用样品。

1.2.3两相溶剂系统的选择

对不同配比的正己烷－乙酸乙酯－甲醇－水组成的溶剂系统进行试管实验，通过分

层时间和上下相体积比粗筛溶剂系统，选取其中的5种配比，用HPLC法分析，

计算目标化合物C的分配系数K［11－12］。

分别按照1∶1∶1∶1、1∶1∶2∶1、1∶2∶1.5∶1、1∶1.2∶1.5∶1、

1∶1.2∶2∶1这5种体积比配制各溶剂系统。分别取相同体积的上相与下相置于

试管中，加入一定量的样品，剧烈振摇使样品充分溶解，静置分层。达到分配平衡

后，分别取上相和下相各1.0mL，挥干溶剂后用等量的甲醇溶解，经HPLC分析

得到目标化合物C在上相中的峰面积(AU)与下相中的峰面积(AL)，按照公式

K=AU/AL计算得到目标化合物C的分配系数。

1.2.4HSCCC分离用溶剂体系和样品溶液的配制

用分液漏斗中配制正己烷－乙酸乙酯－甲醇－水(体积比为1∶1.2∶2∶1)两相溶剂

体系，充分振摇后静置分层。将上相和下相溶液分离后，超声脱气20min，备用，

上相为固定相，下相为流动相。

准确称取在1.2.2中分离得到的300mg样品，溶解于20mL流动相(下相溶液)，

过滤后备用。

1.2.5HSCCC分离纯化方法

将已脱气的固定相(上相)以10mL/min的速度泵入HSCCC分离管，待固定相充

满整个分离管后，开启循环水浴并将温度设定为25℃。开启主机电源，调节主机

转速为830r/min，正向旋转，以2mL/min的流速泵入流动相(下相)，待流动相

从柱出口流出、且固定相不再流出，表明上下相在分离管中达到平衡后，基线稳定

后，由进样阀注入20mL样品溶液进行分离，检测波长为280nm，记录色谱图，

根据色谱图手动收集各峰组分，HPLC检测其纯度。分离结束后，停止转动主机，

用无水乙醇将分离管吹洗干净。

1.2.6HPLC分析条件及结构鉴定

HPLC色谱条件:EclipXDB－C18分离柱(4.6mm×150mm，5μm);流动相为

甲醇∶1.0%磷酸=50∶50，流速为1.0mL/min;柱温为25℃，DAD检测器，检

测范围190～400nm;进样量10μL。

HSCCC分离得到的组分的结构根据质谱、核磁共振氢谱(1H－NMR)和核磁共振

碳谱(13C－NMR)的数据进行鉴定。

2结果与讨论

2.1HSCCC溶剂系统的优化选择

溶剂系统是决定HSCCC分离样品效果的最关键因素。不同的溶剂系统由于黏度、

极性和密度等性质的差异，对相同的成分会产生不同的溶解、分配能力，因而形成

分配系数的差异。根据色谱理论，利用HSCCC分离样品的必要条件是目标物能稳

定的溶于两相溶剂;目标物在两相中具有合适的分配系数，必须在0.5和2之间。

若K远小于1，样品会很快随流动相流出，达不到分离效果;若K远大于1，样品

的出峰时间会延长，形成宽峰。本研究根据香水莲花提取物的目标化合物C在不

同组成比例的正己烷－乙酸乙酯－甲醇－水溶剂系统中的分配系数，从中优选出具

有合适分配系数的溶剂体系，结果见表1。

表1化合物C在不同比例的溶剂体系中的分配系数(K)注:K=AU/AL溶剂系统正己

烷－乙酸乙酯－甲醇－水(V/V/V/V)K11∶1∶1∶12.3121∶1∶2∶1

0.8631∶2∶1.5∶11.5341∶1.2∶1.5∶11.361∶1.2∶2∶11.025

由表1可见，在溶剂体系1、3、4条件下，化合物C的分配系数偏大，在固定相

中的保留时间过长，不适合分离，而在2的条件下，化合物C易和不被保留的杂

质几乎同时流出而没有达到很好的分离，在溶剂体系5中，化合物C的分配系数

接近1，而且所需分离时间较短，5是较为适宜的HSCCC分离溶剂体系。

2.2HSCCC检测波长的选择

化合物C的HPLC－DAD检测图谱(见图1)可知，由220～230nm、280～300

nm2个较强的的吸收带组成，320～340nm处的吸收带为肩峰。虽然色谱峰在

225nm吸收强度大，但由于样品中的其他化合物及流动相(乙酸乙酯、甲醇等)在

210～230nm下均有较强的吸收，在HSCCC分离中这种溶剂吸收带来的基线背

景吸收值过高，且影响基线的平稳。因此，综合考虑选择HSCCC分离的检测波长

为280nm。

图1化合物C的HPLC－DAD检测图谱

2.3HSCCC分离纯化结果

采用1.2.5节的条件对1.2.2中得到的108－112流分进行分离纯化，分离时间为

1.5h，固定相保留率为80%。根据HSCCC图谱手动收集得到3个组分(见图2)，

经检测发现其中A、B二峰均为杂质峰，C峰较纯。将其收集，浓缩干燥，质量为

80mg。

图2香水莲花底层黄色物质硅胶柱分离108－112流分的HSCCC分离图

2.4化合物C高效液相色谱检测纯度

采用1.2.6节的条件，对2.3中的分离产物C峰进行HPLC分析，结果见图3。使

用面积归一法测定所得组分的纯度为98.6%。

图3HSCCC分离所得化合物C的HPLC的色谱图(290nm)

2.5化合物C的结构鉴定

化合物C:白色粉末，分子式C15H12O5，FABMSm/z:272［M］+，1H－

NMR(500MHz，Acetone－d6)δ:12.18(1H，s，5－OH)，9.51(1H，s，4'－

OH)，8.47(1H，s，7－OH)，7.41(2H，d，J=8.5Hz，H－2'，6')，6.91(2H，

d，J=8.5Hz，H－3'，5')，5.97(1H，d，J=2.1Hz，H－6)，5.96(1H，d，

J=2.1Hz，H－8)，5.47(1H，dd，J=12.8Hz，2.9Hz，H－2)，3.19(1H，dd，

J=12.8Hz，17.1Hz，H－3a)，2.75(1H，dd，J=17.1Hz，2.9Hz，H－3b)。

13C－NMR(500MHz，Acetone－d6)δ:80.0(C－2)，43.6(C－3)，197.3(C－

4)，165.4(C－5)，96.9(C－6)，167.4(C－7)，95.9(C－8)，164.5(C－9)，

130.9(C－1')，129.1(C－2')，116.2(C－3')，158.8(C－4')，116.2(C－5')，

129.1(C－6')。从NMR可以看出化合物C为黄酮类化合物，1H－NMR显示B

环为4'一羟基取代(δ6.91，3'，5'－H;7.41，2'，6'－H)，另外A环还含有2个

酚羟基取代。根据H－2和H－3的化学位移及偶合常数，确定C－2为S构型，

提示此化合物为二氢黄酮。其NMR数据与文献［13－15］报道的(2s)一柚皮素

数据基本一致，故化合物鉴定为(2s)一柚皮素(naringenin)。

图4柚皮素的结构式

3结论

本研究将HSCCC应用到香水莲花黄烷酮类化合物的分离制备，采用正己烷－乙酸

乙酯－甲醇－水(1∶1.2∶2∶1，V/V/V/V)四元溶剂系统，香水莲花粗提物硅胶柱

分离流分经进一步HSCCC分离纯化，结合薄层层析(TLC)和HPLC－DAD光谱，

结果表明:分离得到的化合物C为黄烷酮类化合物，并根据MS分析及1H－NMR、

13C－NMR谱图分析结果鉴定为(2s)一柚皮素。所建立的HSCCC分离方法可用

于快速、高效、低成本地分离制备香水莲花中柚皮素对照品，可为该成分的药理活

性与作用机制研究以及香水莲花相关产品的质量控制方法的完善提供必要的物质基

础。

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