scatology

动物学报 50

(

3

)

:452-458,2004

ActaZoologicaSinica

2003210205收稿,2003212225接受

3国家自然科学基金重点项目(

No.30230080

)

,国家杰出青年基金项目(

No.30125006

)

,中国科学院知识创新工程项目(

KSCX22

1203

)

[ThisrearchwasfundedbythegrantsfromNationalNaturalScienceFoundationofChina

(

No.30230080

)

,StateOutstanding

YouthFoundation

(

No.30125006

)

,andChineAcademyofSciencesInnovationProgramme

(

221203

)

]

33通讯作者(

Correspondingauthor

)

. E2mail:weifw@panda1ioz1ac1cn

ν2004动物学报ActaZoologicaSinica

大熊猫和小熊猫粪便DNA提取的简易方法

3

张保卫 魏辅文

33

李 明 吕晓平

中国科学院动物研究所,北京100080

摘 要 采集了大熊猫和小熊猫的新鲜粪便样品,使用100%乙醇保存。通过重复离心富集研究动物的肠道脱落

细胞,并使用乙醇和双蒸水洗涤以除去抑制物。用1%的SDS快速裂解细胞,离心除去残渣后,向裂解液中加

入蛋白酶进行消化。消化结束后使用等体积的酚/氯仿抽提,乙醇沉淀DNA。用双蒸水溶解粪便DNA后,使用

PCR产物纯化试剂盒对粪便DNA进行纯化。电泳检测结果显示,从乙醇保存的大、小熊猫粪便样品中抽提到高

质量的粪便DNA。对线粒体控制区、细胞色素b基因、12SrRNA基因的PCR扩增反应以及测序结果也证实了

样品保存方法和DNA抽提方法可靠而高效。此方法使用实验室内常用的分子生物学试剂,不仅克服了分子粪便

学研究中常见的抑制物粪便DNA微量降解严重等障碍,与商业化的粪便抽提试剂盒(

QIAampDNAStoolMini

Kit,Qiagen

)相比还是一种经济的试验方法(抽提反应成本为试剂盒的1/5

)。文中还对粪便DNA内细菌基因组

等背景DNA可能对分子粪便学试验结果的影响进行了探讨。在基于PCR技术的遗传学研究中,对于植食性动

物而言,粪便内的背景DNA对目标动物DNA片断的扩增和序列测定未见影响;但对于肉食性动物,则必须考

虑被捕食者基因组对试验可能产生的影响,应谨慎对待[动物学报50

(

3

)

:452-458,2004]。

关键词 大熊猫 小熊猫 粪便DNA 抽提 新方法

AsimpleprotocolforDNAextractionfromfaecesofthegiantpandaandlesr

panda

3

ZHANGBao2Wei,WEIFu2Wen

33

,LIMing,LU

・・

Xiao2Ping

InstituteofZoology,theChineAcademyofSciences,Beijing 100080,China

Abstract aecalsamplesofthegi2

antpandaAiluropodamelanoleucaandlesrpandaAilurusfulgenswerecollectedandstoredin100%

200-300mgfaecalsampleswerecollectedinamicrocentrifugetubethroughrepeatedcentrifugation,thenwashedby

samplewaslydrapidlywith1%SDSandcentrifugedquickly,thentransferredthesu2

extractedusingChloroform/PhenolafterincubationwithProteinaK,followingby

ondrialDNAcontrolregion,cytochromeband12SrRNAgenewereamplifiedand

quencedsuccessfullyfromfaecalDNA,suggestingthatthemethodsofsamplestorageandDNAextractionwerereliable

thodnotonlyovercamepreviousbarrierstomolecularscatology,suchasinhibitors,lowqualityand

degradationofDNA,butalsowasmoreeconomicalthancommercialkits

(

DNAStoolMiniKit,Qia2

gen

)

.WemonitoredsomebackgroundDNAinfaecalDNA,anddiscusdpotentialrisksfrombackgroundDNAcontami2

nation,suchasgenomesofbacteria,virus,tiveeffectwasobrvedduringamplificationand

quencingoftargetDNA,whichshowedthatthebackgroundDNAhadnoeffectongeneticstudyoftargetanimals[Ac2

taZoologicaSinica50

(

3

)

:452-458,2004].

Keywords Giantpanda,Ailuropodamelanoleuca,Lesrpanda,Ailurusfulgens,Molecularscatology,FaecalDNA

extraction

©://

近年来,在对濒危动物的保护遗传学研究中,

非损伤性取样法(

Noninvasivesampling

)已被广泛

提倡和接受(

Taberletetal.,1999;李明等,

2001

)

,即在不伤害或触及动物的前提下收集脱落

的毛发、粪便、口腔脱落细胞、陈旧皮张等作为分

析样品进行遗传分析(魏辅文等,2001;李明等,

2002;张于光等,2003;刘海等,2003;史燕等,

2004

)。由于动物排便有一定的节律性,与上述的

其它材料相比,粪便样品更易收集。已有学者利用

粪便作为研究材料在分子遗传学、种群生态学和行

为生态等领域开展研究(

MorinandWoodruff,

1996;KohnandWayne,1997

)。90年代中期,传

统的粪便分析方法与分子生物学的技术相结合,兴

起了一门以动物粪便为试验材料进行多领域研究的

学科———分子粪便学(

MolecularScatology

)(

Reed

etal.,1997;KohnandWayne,1997

)。目前分子

粪便学在国内得到了一定的发展和应用(方盛国

等,1996a,b;魏辅文等,2001;王戎疆,2001

)。

由于粪便成分复杂,不仅含有动物肠道脱落细胞,

而且含有肠道微生物、未消化的食物、消化酶、黏

液、胆盐、胆红素等(

Sidranskyetal.,1992

)

,且

食草动物粪便内还存在大量植物多糖(

Deuteret

al.,1995

)等。常规的抽提方法得到的粪便DNA

中常伴有共纯化的DNA聚合酶抑制物,对PCR反

应有强烈的抑制作用(

Deuteretal.,1995;Kohn

andWayne,1997

)。目前国际上一般使用试剂盒

(如QIAampDNAStoolMiniKit,Qiagen

)抽提粪

便DNA,但价格不菲。因而,分子粪便学的发展

需要一种经济而实用的试验方法。作者对大、小熊

猫的保护遗传学研究中,总结出从粪便样品中提取

到纯化且质量较高的DNA的试验方法,并对目标

DNA成功地进行了PCR扩增和序列测定,报道如

下。

1 材料与方法

111 材料

大熊猫霄霄(谱系号290

)粪便采自济南动物

园;大熊猫戴丽(谱系号542

)粪便采自四川宝兴

蜂桶寨自然保护区;3个小熊猫粪便样品分别采自

合肥野生动物园(

1

)和卧龙自然保护区(

2

)。

112 方法

11211 粪便样品的保存 采集新鲜的大、小熊猫

粪便表面富含黏膜部分,使用2倍体积的100%乙

醇保存。

11212 DNA提取

(

1

)通过重复离心,从保存的粪便样品中转移

200-300mg入2ml灭菌的离心管中。

(

2

)加入1ml乙醇,振荡15s混匀,10000

r/min离心3min,倾去上清;重复此步骤至上清

无异色。

(

3

)加入1ml双蒸水,振荡混匀,10000r/

min离心3min,倾去上清;重复此步骤1次。

(

4

)加入500

μ

l110%SDS,振荡混匀,置于

55℃水浴10min,其间每3-4min取出混匀一次。

(

5

)取出离心管,10000r/min离心5min

后,吸取上清液450

μ

l至一新的2ml离心管中。

(

6

)加入30

μ

l015molEDTA,20

μ

l蛋白酶

K

(

20mg/ml

)

,振荡混匀,55℃水浴消化015-1

h。

(

7

)取出离心管,加入等体积的酚/氯仿2异戊

醇(

25∶24∶1

)抽提10min。

(

8

)

10000r/min离心10min,取出离心管。

(

9

)吸取450

μ

l上清液至一新的2ml离心管

中,加入45

μ

l3mol的醋酸钠,1ml乙醇,混匀后

-20℃放置20min。

(

10

)

12000r/min离心10min沉淀DNA,倾

去上清,室温中晾干。

(

11

)加入100

μ

l双蒸水,冰上静置,溶解管

底部的DNA。

(

12

)使用PCR产物纯化试剂盒

E1Z1N1A1Cycle2pureKit

(

USA,Omega公司)纯

化溶解的模板,纯化产物用50

μ

l超纯水洗脱。电

泳检测后,-20℃保存。

试验进行的同时使用抽提空管作为阴性对照;

同时还使用QIAampDNAStoolMiniKit

(

Ger2

many,Qiagen公司)对大熊猫霄霄和戴丽的粪便

样品进行DNA抽提。

11213 PCR的扩增 使用抽提到的DNA模板,

对大、小熊猫线粒体基因组不同片断进行扩增。大

熊猫线粒体控制区引物Ptp

(

5′2CTCCCTAAG

ACTCAAGGAAG23′)和P12s

(

5′2TAGGAA

GGCTAGGACCAAACC23′)由作者根据已知大

熊猫以及近缘物种的线粒体控制区同源区保守序列

设计;大熊猫线粒体控制区引物DEDL225

(

5′2

ATGTACATACTGTGCTTGGC23′)来自

Zhangetal.

(

2002

)

;试验中还使用脊椎动物细胞

色素b和12SrRNA基因的通用引物L14724

(

5′2

CGAAGCTTGATATGAAAAACCATCGTTG

354

3期张保卫等:大熊猫和小熊猫粪便DNA提取的简易方法

©://

23′)、H15149

(

5′2AAACTGCAGCCCCTCAGA

ATGATATTTGTCCTCA23′)、H15915

(

5′2

CGGAATTCCATTTTTGGTTTACAAGAC2

3′)(

Irwinetal.,1991

)、L1091

(

5′2AAAAAG

CTTCAAACTGGGATTTAGATACCCCAC

TAT23′)及H1478

(

5′2TGACTGCAGAGG

GTGACGGGCGGTGTGT23′)(

Kocheretal.,

1989

)。

扩增体系:10×Buffer5

μ

l,4

μ

ldNTP

(

10

mmol

)

,4

μ

lMgCl

2

(

20mmol

)

,Taq酶(

TaKaRa

公司,5U/

μ

l

)

1125

μ

l,引物(

10mmol

)各1

μ

l,

BSA

(

1mg/ml

)

5

μ

l,1-5

μ

l模板DNA,使用超

纯水将反应体系补至50

μ

l。循环条件为:95℃预

变性4min,95℃变性30s,54-60℃退火30s,

73℃延伸60s,35个循环后72℃延伸5min。

11214 PCR产物的纯化及序列测定 PCR产物经

210%的琼脂糖EB凝胶电泳检测,E.Z.N.A.

Cycle2pureKit纯化,使用PE公司ABI377遗传分

析仪及BigDyeTM试剂盒直接进行测序。

11215 粪便DNA模板中背景DNA

(

Background

DNA

)的检测 使用真细菌的16SrRNA专一性

引物F8

(

5′2AGAGTTTGATCCTGGCTCAG2

3′)和R1492

(

5′2TACCTTGTTACGACTT23′)

(

Weissburg

etal.,1991

)

,通过PCR对试验中获得

的上述模板进行检测。扩增体系同11213,循环条

件为:95℃预变性4min,95℃变性30s,50℃退

火30s,72℃延伸60s,反应35个循环后72℃延

伸5min。试验中分别设置阳性对照(使用大肠杆

菌DNA作为模版)和阴性对照以确保试验结果准

确。

2 结 果

大、小熊猫的5个个体的粪便DNA抽提结果

见图1。使用上述模板,扩增大熊猫线粒体控制区

和细胞色素b基因全序列和12SrRNA基因片断,

分别得到1600bp左右、1246bp和450bp的PCR

产物。扩增小熊猫线粒体细胞色素b基因全序列

及12SrRNA基因片断的片断,分别得到1246bp

和450bp的PCR产物。部分扩增产物的电泳结果

见图2。

利用PCR产物直接进行测序,测序峰图中无

基线过高、套峰、杂峰等异常情况出现。结果在

GenBank中经Blast序列对比,分别属于大、小熊

猫相应的基因,证实序列真实可靠。两个大熊猫样

品的序列结果,与使用QIAampDNAStoolMini

Kit对照试验得到的序列结果完全一致。序列已提

交GenBank,序列登录号为(

AY3903592

AY390369

)。

利用真细菌专一性引物,对本实验中得到的所

有DNA模板(包括使用QIAampDNAStoolMini

Kit的抽提结果)进行扩增,电泳检测结果中均有

条带出现(图3

)

,说明抽提的粪便DNA中均有细

菌的基因组DNA存在。

图1 从大、小熊猫粪便抽提到的DNA模板电泳检测

图

M为

λ

DNA的HindⅢ消化产物,N为阴性对照结果,1-3

为小熊猫模版,4、5为大熊猫霄霄的模板,6、7为大熊猫戴

丽的模版,其中5和7粪便DNA使用QIAampDNAStoolMini

Kit试剂盒抽提。

Fig11 Computer2scannedfigureoffecalDNAquality

controlgelfromthreeredpandasamples(1-3)andtwo

giantpandasamples(4-7)

M:

λ

2HindⅢdigestedDNAmarker.N:Negativecontrol.1-3:

FaecalDNAofthreeredpandas.4,5:FaecalDNAofgiantpanda

Xiaoxiao.6,7:FaecalDNAofgiantpandaDaili.5and7extracted

byQIAampDNAStoolMiniKit.

3 讨 论

尽管前人的研究已证实粪便内的肠壁脱落细胞

是获得研究物种DNA的可靠途径(

H¨ostal.,

1992

)

,然而使用粪便样品进行分子遗传学研究仍

然面临着诸多问题,如粪便中脱落的消化道细胞数

量较少,且其中的遗传物质容易降解(

Gerloffet

al.,1995;Kohnetal.,1995

)、粪便成分中与

454

动 物 学 报50卷

©://

图2 小熊猫样品线粒体细胞色素b基因(1-3)以及

大熊猫的线粒体控制区(4-7)扩增产物的电泳结果

图中数字编号与图1中的模板相对应。M为200bp的DNAlad2

der,N为PCR反应中的阴性对照。

Fig12 AmplificationofmitochondrialDNAcytochrome

bgeneofredpandasfecalDNA(1-3)andmitochondrial

DNAcontrolregionofgiantpandasfecalDNA(4-7)

TherialnumberiscorrespondingtothetemplatesinFig11.M:

200bpDNAladder,200bp-2000bp.N:Negativecontrol.

图3 使用细菌16SrDNA的特异引物对大、小熊猫粪

便DNA的扩增结果

图中的数字编号与图1中的模板相对应。M为200bp的DNA

ladder,P为阳性对照,N为阴性对照。

Fig13 Amplificationof16SrRNAgeneofbacteriain

redpandasfecalDNA(1-3)andgiantpandafecalDNA

(4-7)

TherialnumberiscorrespondingtothetemplatesinFig11.M:

200bpDNAladder,200bp-2000bp.P:Positivecontrol.N:

Negativecontrol.

DNA共纯化的抑制物对下游PCR扩增的阻遏

(

Deuteretal.,1995;KohnandWayne,1997

)、粪

便自身的复杂成分所可能导致的背景DNA的干扰

等。要从粪便中提取高质量的DNA,需要有效的

保存方法,以阻止其中目标DNA降解。目前有效

的粪便样品保存方法有:低温保存(

Constableet

al.,1995;Ernestetal.,2000

)、福尔马林保存

(方盛国等,1996a

)、硅珠(

Silicabead

)保存

(

Wasretal.,1997

)、DETs

(

DMSO/EDTA/Tris

盐溶液)保存(

Frantzenetal.,1998

)、干燥保存

(魏辅文等,2001;Murphy

etal.,2000;Garnier

etal.,2001

)、乙醇保存(

Gerloffetal.,1999;

Constableetal.,2001;Frantzetal.,2003

)等。

不同的物种和生境,样品最适合的保存方法会有所

不同(

Frantzenetal.,1998

)。其中使用乙醇不仅

有价格便宜、方便获得的优势,而且无毒性、便于

在野外粪便采集中使用。有鉴于此,我们使用

100%的乙醇保存样品,抽提得到的DNA在电泳

检测时显示出较高的分子量,并且均成功地扩增出

1000bp以上的基因片断。Whittieretal.

(

1999

)

比较了几种不同保存方法的DNA抽提和PCR扩增

粪便样品的结果后,认为使用乙醇保存样品是具有

诸多优点而又能获得相对较高质量DNA的保存方

案。还有研究显示,用乙醇方法保存样品还具有保

存时间长(可达5年以上)(

Gerloffetal.,1999

)

以及较高的扩增成功率(

Murphyetal.,2002;

Frantzetal.,2003

)的优点。尽管使用乙醇保存是

一个良好的选择,但样品在接受保存处理时的新鲜

程度对粪便DNA的质量起决定性影响。一般认

为,通过非损伤性取样得到的样品仅含有微量的

DNA,但我们通过多次离心富集细胞,抽提到浓

度较高的DNA

(图1

)

,不仅可以提高扩增反应的

成功率,也为使用多管途径(

Multipletubesap2

proach

)(

Taberletetal.,1996

)的基因型分析提

供足量的模板,这说明新鲜粪便所能提供DNA的

量可能并不拘泥于微量的概念。

在DNA的抽提过程中,有效地去除粪便样品

内的抑制物质(如来自代谢的胆盐以及食物组分内

的植物多糖等)是非常重要的,否则下游的PCR

反应中Taq酶的活性将会受其阻遏。仅仅通过多

次的酚-氯仿抽提不足以有效地去除抑制物,尤其

是多糖类物质。为了克服抑制物的影响,有研究者

尝试抽提步骤的改进,如Ernestetal.

(

2000

)在

抽提山狮Pumaconcolor的粪便DNA时使用聚丙

烯酰胺葡聚糖柱来纯化抽提产物;钟华等(

2003

)

在大熊猫粪便DNA提取步骤中使用丙酮洗涤样品

以去除抑制物。此研究中我们采用多种途径来去除

554

3期张保卫等:大熊猫和小熊猫粪便DNA提取的简易方法

©://

抑制物:在细胞裂解前使用乙醇和双蒸水对样品进

行多次清洗,以除去样品内的脂溶性和水溶性抑制

物成分。另外,使用110%SDS快速裂解肠道脱落

的细胞,再通过高速离心去除粪便残渣,仅对裂解

后的上清液部分进行消化,以免粪便样品长时间处

于裂解液中产生过多的抑制成分。使用酚/氯仿抽

提和乙醇沉淀DNA后(

Sambrooketal.,1989

)

,

DNA模板内残留的抑制物,再使用分子生物学试

验中常用的PCR产物纯化试剂盒(以Silica法为基

础的DNA纯化系统)予以去除。受代谢水平和食

物组成影响,粪便DNA的扩增成功率在物种和个

体之间存在差异(

Goosntal.,2000;Murphy

etal.,2003

)。而我们的研究中没有发现这种差

异,都获得成功扩增。这可能是由于在抽提获得了

较高浓度的目标动物DNA的基础上,模板中抑制

物被有效去除,而未对PCR产生影响;或者是由

于大、小熊猫有相同的特殊食性(竹子)和消化不

完全所致。在应用此方法抽提猕猴粪便的DNA

时,获得的模板DNA同样可以目标片断的扩增和

序列测定(赵健元,个人交流)

,说明了此方法可

以有效去除PCR反应中的酶抑制物成分,因而对

于其它物种也具有适用性。

在抽提的粪便DNA中,不仅有来自目标动物

肠壁细胞的DNA,还有背景DNA,即研究动物粪

便内其它生物的DNA,主要为消化道内寄生生物

(细菌、病毒、寄生虫)的DNA以及未消化食物

的DNA。曾有学者使用溶菌酶去除粪便中的细菌

基因组(方盛国等,1996b

)。对于在宿主细胞内的

病毒,几乎没有合适的方法来清除。因此,要完全

清除粪便样品内其它生物的基因组将会异常艰难。

在本研究中我们未设置除菌步骤,在使用细菌16S

rRNA基因的专一引物(

Weissburgetal.,1991

)

对粪便DNA模板进行PCR检测时均呈阳性(包括

使用QIAampDNAStoolMiniKit抽提的产物)

,

提示粪便DNA中都有细菌基因组存在。但试验结

果却表明,细菌基因组的存在并未对大、小熊猫线

粒体基因的扩增和测序产生影响。在以PCR技术

为基础的分子遗传学方法中(如序列分析、微卫星

分析)

,引物不仅仅作为扩增的起点,它在PCR反

应中通过自身序列与模板特异性结合,还起到甄别

作用,扩增目的片断,因而粪便DNA中的背景

DNA一般不会对试验结果产生影响。H¨ostal.

(

1992

)在抽提熊的粪便DNA时就坦言,在所抽

提的模板中存在大量的细菌DNA,而且还从中扩

增出植物的DNA片断。事实上,有许多学者也利

用了粪便DNA中其它生物的基因组,进行了诸如

食性分析、寄生虫学及流行病学的研究(

H¨ost

al.,1992;Bretagneetal.,1993;Haleetal.,

1996;Okamotoetal.,1999;Rasooletal.,

2002

)。所以,从粪便DNA中去除细菌和病毒等

其它生物的基因组可能并非是必须步骤。对大部分

植食性动物来说,未消化的食物残渣一般不会对以

PCR技术为基础的试验结果产生大的影响。但是

对肉食性动物而言,因为捕食者与被捕食者之间可

能有较近的亲缘关系,基因组较为接近,研究中则

必须考虑到食物的基因组对试验可能产生的影响,

应谨慎对待(

Murphyetal.,2003

)。因此使用粪

便DNA的遗传学研究更要注意的是样品之间的交

叉污染。

本研究使用分子生物学中的常用试剂,简便、

快速地完成粪便DNA的抽提,模板电泳结果、

PCR反应和测序结果都证实了此方法可靠而高效。

其试验步骤、试验周期(约215h

)均接近QI2

AampDNAStoolMiniKit试剂盒(约115h

)

,但

与之相比,还具有试验成本较低的优势(低于试剂

盒成本的5倍)。

致 谢 北京动物园张成林先生、蜂桶寨自然保护

区、卧龙自然保护区和合肥野生动物园在样品采集

的过程中给予大力帮助,在此一并致谢。

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GerloffU,HartungB,FruthB,HohmannG,TautzD,2

communityrelationships,dispersalpatternandpaternitysuccessin

awildlivingcommunityofBonobosPanpaniscusdeterminedfrom

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