pasha

MicroRNA(miRNA)是近几年在真核生物中发现的一类具有调控功能的非编码RNA，它们主

要参与基因转录后水平的调控。miRNA的调控功能是十分重要的，近来发现它们在果蝇的细胞

增殖、死亡及脂肪代谢，线虫极性的形成，哺乳动物的造血干细胞的分化等过程中起了重要的调

控作用。在植物中，miRNA还参与了叶子与花的发育过程。

动物(尤其是人)miRNA的生物合成过程已经初步得到了诠释。首先，miRNA基因的初级转录

产物(pri-miRNA)在细胞核中被RNaⅢDrosha切割成为前体miRNA(pre-miRNA)。

在最初的剪切后，pre-miRNA在转运蛋白exportin-5的作用下由核内转到胞质中，然后由

另一种RNaⅢDicer进一步切割产生成熟的miRNA。这些成熟的miRNA与其他蛋白质

一起组成RISC(RNA-inducedsilencingcomplex)复合体，从而引起靶mRNA的降解或

者翻译抑制。

1miRNA基因的转录与转录初产物的剪接

大多数miRNA基因与蛋白质基因距离比较远，它们可能有自己的启动子可以进行独立的转录。

但是也有相当多的miRNA基因，人有1/4的miRNA基因是位于蛋白质基因的内含子当中的，

通常miRNA基因与内含子的转录方向是一致的，这就说明这些基因大多是与寄主蛋白基因共

转录的，然后再从这些蛋白质基因的内含子中剪切出来。并且同一类miRNA基因在不同生物

体中的寄主基因往往是保守的同一类蛋白质基因。正是由于miRNA与其寄主蛋白基因是共表

达的，而使它们的联系在进化过程中也保守地保存下来。还有一些miRNA基因是成簇分布在

染色体上，它们通过一个共同的启动子转录成为多顺反子。虽然这种形式在线虫和人的miRNA

基因中比较少见，但是果蝇的miRNA基因中一半是成簇的。而且这些成簇的miRNA基因经

常是彼此相关的。例如人的mir-15a-mir-16基因簇是位于13号染色体上的一个抑癌基因中，

而这一位置在B细胞与T细胞白血病中均产生了结构的畸变。经研究发现，这两个miRNA

确实与白血病的发生有关。

目前，我们对miRNA基因如何转录成为pri-miRNA还知之甚少。研究发现RNA聚合酶Ⅱ

和Ⅲ均可以参与miRNA的转录。位于蛋白质基因内含子中的miRNA基因毫无疑问是由聚合

酶Ⅱ进行转录的。虽然大多数其他miRNA基因缺少加多聚腺苷酸尾的信号，还有一些间接的

证据证明它们也有可能是聚合酶Ⅱ的转录产物：a.有些pri-miRNAs相当长，有时超过1kb，

这比聚合酶Ⅲ的转录产物长很多。b.大多数pri-miRNAs最后一个碱基为尿嘧啶，而这通常被

认为是聚合酶Ⅲ提前中止的转录产物。c.许多miRNA基因的表达在发育过程中是变化的，这

种表达变化通常在聚合酶Ⅱ的转录产物中比较常见。d.将某些miRNA基因的5′区域与报告基

因的开放阅读框相融合，可以使报告基因得到表达，说明这种miRNA基因是可以通过聚合酶

Ⅱ转录的。e.对于线虫let-7miRNA的研究表明，let-7pri-miRNA有多聚腺苷酸尾，确实

是由聚合酶Ⅱ的转录产生。另外，聚合酶Ⅲ也可以参与miRNA基因的转录。例如，给miRNA

基因加上聚合酶Ⅲ的启动子由聚合酶Ⅲ进行表达，在体内不仅可以有效地表达出这些miRNA，

同时它们还可以行使其功能，这就说明，miRNA的加工及其功能的行使与由何种聚合酶参与其

基因的转录并没有必然的联系。

对于pri-miRNA转录后加工的研究十分有限，只有对线虫let-7miRNA的研究比较完整。

Bracht等发现了两种长的5′端加帽，3′端加多聚腺苷酸尾的let-7pri-miRNA，是由聚合酶

Ⅱ转录产生的。这些转录产物在5′端有剪接引导序列，它们可以作为反式剪接的底物。实验证

明，初级转录产物的反式剪接对于成熟的let-7RNA的产生十分重要，其序列和结构的变化对

于接下来的剪切反应影响很大，含有成熟的let-7RNA发夹结构前体，其附近序列的二级结构

在剪接前后发生了变化，这一变化延长了let-7RNA的发夹结构前体末端的茎区，这一结构也

是RNaⅢDrosha的底物类似物。同时，初级转录产物的反式剪接也去掉了对下一步剪切

造成空间阻抑的序列。因此，对miRNA初级转录产物的剪接可以显著改变发夹结构前体周围

的序列及结构，从而有利于对miRNA前体的进一步剪切。

Pri-miRNA的第一步剪切是由核糖核酸酶ⅢDrosha完成。其产物是～70nt的发夹结构前

体(pre-miRNA)。这一切割反应不仅切出了成熟的miRNA的3′末端，而且使3′末端有2nt

的突出，这正是由核糖核酸酶Ⅲ进行切割的特征。而且，切割反应并不是发生在发夹结构前体的

基部，而是基部上的几个碱基处。Drosha进行切割的特异性序列还没有找到，但是前体基部的

螺旋结构对于切割是十分重要的，因为在前体的茎区插入和删除序列将导致切割位点的改变。最

新的研究发现，参与这一切割过程的是一个多蛋白质复合体，Drosha是其中的重要成分，起到

切割的作用。在这一复合体中，还存在一种双链RNA结合蛋白Pasha(partnerofDrosha)。

在果蝇细胞和线虫中抑制Pasha的表达，干扰了pri-miRNA的剪切，使细胞内pri-miRNA

的积累增多，成熟miRNA的量减少。Pasha在复合体中的具体功能还不清楚，但是它可能参

与识别miRNA的初级转录产物，将它们集中到复合体中，有利于其被Drosha切割。另外，

Pasha可能对pri-miRNA在复合体中的定向有帮助，从而有利于Drosha在特定位点的切

割。

2miRNA前体的转运出核

由于动物的pre-miRNA需要胞质中的Dicer酶进行进一步加工，转运出核就成为miRNA

成熟过程中必需的一步。这一过程是通过依赖RanGTP/exportin5的转运机制来完成的。在

细胞核中，RanGTP的浓度较高，Exportin5(Exp5)就可以促进pre-miRNA从Drosha

复合体中释放，并且与之结合，将其带到核外。由于胞质中RanGTP的浓度较低，Exp5就释

放pre-miRNA，使之与Dicer结合进行下一步的切割。在运输过程中，miRNA前体的3′突

出将有利于其进入运出核的途径。

3Pre-miRNA的剪切与miRNA的成熟

在动物细胞核中，Drosha的切割产生了成熟miRNA的一端(3′端)。另一端的切割成熟是由

胞质中另一类核糖核酸酶ⅢDicer切割产生的。Dicer首先是在研究小干扰RNA(siRNA)引

起的基因沉默中被发现的，后来发现它在miRNA的成熟过程中也起着重要的作用。Dicer参

与miRNA的成熟过程与RNA干扰中产生双链RNA的过程很相似：首先Dicer识别

pre-miRNA的双链部分，其与茎环基部的5′端被磷酸化、3′端有突出的结构有很高的亲和力。

然后，茎环基部的两圈螺旋解开，Dicer对两条链都进行切割，将前体的其余部分切掉，生成

5′端磷酸化、3′端有2nt突出的类似于siRNA的不完全配对的双链。这条RNA双链是由成

熟miRNA与miRNA*组成的(见图1a中的第4步)。miRNA*是pre-miRNA上的一段

RNA，其位置恰好与成熟的miRNA相对。虽然Dicer在对pre-miRNA的加工过程中能够

产生RNA双链中间体，但是这种中间体通常寿命比较短暂而不易被探测。不过，如果大量的

前体均可产生并只产生一种miRNA，则其双链中的星号链也可以成为成熟的miRNA。

就现有的动物miRNA成熟的模型来看，最初由Drosha介导的切割特异性决定了miRNA

前体中Dicer的切割位点，从而决定了成熟miRNA的两端。由Drosha而不是Dicer决

定这一特异性是由于研究表明Drosha对非特异性双链RNA的切割效率很差，而Dicer可

以没有序列依赖性地切割任何RNA双链。并且Drosha的切割还依赖于pri-miRNA茎环基

部的二级结构，以及茎环基部外侧125nt范围内的序列。

4植物miRNA的成熟过程

植物miRNA的成熟过程与动物有所不同，因为植物中没有Drosha的同源类似物。在植物中

通常很难检测到pre-miRNA，即使在DCL1突变的植物中也很少检测到。DCL1是植物

miRNA成熟过程中类似于Dicer的蛋白质，它是位于核内的。这就说明在植物中可能有其他

酶(很有可能是DCL1)行使了Drosha的功能，对miRNA的转录初产物进行第一次切割，

并且决定了成熟的miRNA的序列。在miRNA离开细胞核之前，DCL1(或其他酶)又进行了

第二次切割，相当于动物细胞中Dicer对pre-miRNA的切割。然后，可能是由HASTY

(Exportin-5在植物中的同源类似物)负责将miRNA：miRNA*双链转运出细胞核(图1b中

的第4步)。由于经核内连续两次切割，在植物中才难以检测到pre-miRNA样的RNA。

拟南芥(Arabidopsisthaliana)作为植物中的一种模式生物，对其miRNA的研究是最多的。

最近，对拟南芥miR163的研究进一步揭示了植物miRNA的成熟过程。拟南芥的基因组编

码4种Dicer样的酶(DCL1-DCL4)。其中DCL1是与miRNA的积累相关的，DCL2和

DCL3分别参与了由病毒引起的小干扰RNA(siRNA)和内源性siRNA(例如反转座子

siRNA)的合成。拟南芥miR163是单独转录的，由RNA聚合酶Ⅱ催化合成，其转录初产物

pri-miR163需要经过核糖核酸酶Ⅲ样的酶切割三次才能成为成熟的miRNA。第一步是在

pri-miR163的茎环结构的根部进行切割，得到长miR163前体(pre-miR163)，第二步是

对长pre-miR163中成熟的miRNA的3′根部进行剪切，得到短的pre-miR163，最后是由

短的前体切割出成熟的5′端成为成熟的miRNA(图2)。有趣的是，在整个剪切的过程中，四

种小分子都可以被释放出来。进一步实验证明，拟南芥的DCL1至少可以对第一及第二步切割

反应进行催化，即对pri-和pre-miRNA都可以切割。另外，第三步的切割反应可能也是

DCL1催化的。所以拟南芥的DCL1蛋白参与了miRNA成熟的全过程。由于拟南芥的DCL1

蛋白有两个类核定位信号，因此植物的miRNA的成熟是在细胞核中完成的。同时，研究表明，

植物DCL1蛋白的双链RNA结合区在决定第一次和第二次的切割位点时是十分重要的。在

dcl1-9_dcl1-9的突变体当中仍然有21nt的RNA片段产生，是因为虽然dcl1-9蛋白在

随机位置上剪切pri-miRNA163，但是却能准确量出第一次切割的位置到下一次切割的位置为

21nt。