美国批准血浆疗法

有机溶剂／去污剂处理血浆的研究进展

微生物学免疫学进展2003年第31卷第2期

有机溶剂/去污剂处理血浆的研究进展

王剑霓综述;赵宜为,周耀东审校

(兰州生物制品研究所,兰州730046)

摘要:有机溶剂/去污剂处理技术已广泛用于血液制剂的病毒灭活.本文对此项技

术用于血浆中病毒灭活的可靠

性,处理血液制剂的安全性以及处理血浆的临床应用作了简要介绍.'

关键词:人血浆;有机溶剂/去污剂处理;病毒安全性'

中图分类号:R392.33文献标识码:A文章编号:1005—5673(2003}02—0083—04

迄今,大多数基于使用血液制剂而引起感染的

主要病毒是乙肝病毒(HBV),丙肝病毒(HCV),人

免疫缺陷病毒(HlV),嗜T淋巴细胞病毒(Hn.V)

以及巨细胞病毒(CMV)和EB病毒等,这些病毒通

常都具有脂包膜.而甲肝病毒(HAY)及细小病毒

B19则属非脂包膜病毒.血液制剂的病毒安全性除

了取决于仔细的筛选献血员即对血液进行病毒筛检

检测之外,还须采取必要的灭活病毒的措施,以清除

处于"窗口期"的病毒感染以及杀灭那些用现行试验

方法不能将其检测出来的病毒突变体(例如.型

HIV及新型HBV等).美国近期的统计资料表明,

在美国,HIV的感染率约为1:675000,HCV的感染

率为1:103000,HBV的感染率为1:66000.传染

病传播的危险性是累积性的,随着输用量加大而增

加,因此对于那些血浆交换治疗病人以及许多凝血

因子缺乏的病人而言其暴露于危险成员中的机率则

大大增加,对于一名接受了100单位的冰冻新鲜血

浆的病人来说,其患HCV风险的机率约为1:

1o00.因此,保证血浆的安全性就成为人们致力解

决的课题.

值得庆幸的是人们已经开发出灭活血浆病毒的

有效方法,即有机溶剂/去污剂(S/D)处理法,巴斯

德加热灭活法以及亚甲蓝/光化学处理法等,其中

S/D法已在世界各地广泛用于凝血因子或免疫球蛋

白制剂的病毒灭活,并于20世纪90年代开始用于

血浆中病毒的灭活.所有可利用的证据表明,S/D

处理能有效地消除血浆中主要病毒——HlV,HBV,

HCV以及目前尚不太重要的包括庚肝病毒(HGV)

收稿日期:2002-09-03

作者简介:王剑霓(1972一),男,助工,毕业于兰州大学物理系应

用电子技术专业,主要从事血液制剂的生产工作.

在内的输血传染.

1S/I)处理法灭活病毒的可靠性

有机溶剂的杀病毒作用早已为人所知,有机溶

剂与去污剂可协同作用,破坏脂包膜;去污剂结合到

脂包膜上,在溶剂协助下使脂包膜破裂和解体,从而

达到灭活脂包膜病毒的目的.S/I)灭活技术是于

1985年首次批准用于凝血因子浓缩物的处理,并由

此成为全世界最广泛的处理血浆蛋白制剂的杀病毒

方法.许多相关实验室,临床及市场应用的资料证

明S/D法作为一种消除血液制剂中脂包膜病毒的

有效性.在20世纪70年代初,人们就发现磷酸三

丁酯(TNBP)具有杀灭包膜病毒的作用…,之后学

者们相继用乙醚结合Tween80灭活血浆蛋白中的

HBV和Hcv,而在灭活病毒的同时,并不降低凝血

因子Ⅷ及Ⅸ的活性[23,鉴于乙醚对环境的危害,而

改用比乙醚安全得多的磷酸三丁酯这种非爆炸性有

机溶剂来破坏脂包膜病毒效果要好,实践证明在

4℃条件下,TNBP/Tween80灭活病毒的效果要比

乙醚/Tween80优越得多【3].S/D处理法能够增强

凝血因子浓缩物的安全性,很多有关病毒灭活的研

究是用抗血友病因子(AHF)制剂进行的,或者是自

然感染病毒的制剂,或者是事先有目的的加入指示

病毒,如Sindbis病毒,口角炎疱疹病毒(vsv)以及

HBV,HCV或HIV,以显示病毒灭活效果.结果表

明,对加入至AHF制剂中的Sindbis,VSV及Sendai

模型病毒均可全部灭活,对HBV和HCV的灭活效

果分别达106?及104黑猩猩感染剂量(CID~),而抗

血友病因子的回收率大于9o%,Piet等证明S/D法

可分别灭活6logCIDso的HBV,5logCIDso的HCV

及6logCID~(组织培养感染剂量)的HIV.

进入9O年代,S/D处理法开始用于全血浆病毒

灭活,试验证明可以达到与血浆蛋白制剂相同的病

毒灭活效果J.

S/D血浆制备程序分为2步:①在新采集的同

一

ABO血型新鲜血浆中加入1%(v/,厂)TNBP和

1%(V/V)Trit0nX.100,在连续搅拌条件下于3O℃

温育4小时;②加入5%(V/,厂)的豆油或蓖麻油,轻

轻搅拌混合,作用30分钟,于10000g离心20分

钟,令其分层,移弃脂质层以去除TNBP及Triton

X一100,将澄清的血浆层加至制备型C18反向层析

柱(血浆与柱体积比为6:1)上,收集流出的血浆,产

物用0.2tan的微孔滤膜过滤,然后分装冻干瓶进行

旋冻冻干.

处理结果证实【引,加入血浆中的标志病毒H角

炎疱疹病毒(VSV)及Sindbis病毒均于第1步温育

中在开始的15分钟内即被迅速灭活,VSV灭活量

≥10～TCIDs0,Sindbis病毒的灭活量≥10TCIDs0

比用0.3%TNBP和0.2%胆酸钠在3O℃或用0.3%

TNBP和1%Tween80于24℃灭活AHF中病毒的

速度要快,即使在过度脂质的血浆中亦能很好地灭

活病毒.HIV总灭活量≥107～TCIDs0,HBV灭活

量≥1O.半数黑猩猩感染剂量(CID50).HCV灭活

量≥10CIDso.S/D血浆中所有凝血因子含量与新

鲜冷冻血浆中的相似.当血浆处理量为15～2O升

时,因子V,Ⅷ,Ⅸ和Ⅺ的回收率分别为87%,88%,

99%及90.8%,凝血酶原时间和部分活化凝血活酶

时间(AP1_1r)值正常,表明未出现凝血因子接触性

激活,未见形成新的免疫原.在经过第2步处理后,

血浆中残存的TNBP和TritonX-100的残存量均低

于2/zg/mL(最高残留量不得超过3/~g/mL).因此

人们得出结论:S/D血浆在体内能正常地循环并发

挥其功能,其所含TNBP和TritonX-100及大豆油

等的残存量极低,而制备型C18柱均对人体无害,

这样的工艺流程制造S/D血浆可以代替新鲜冰冻

血浆以增加输血的安全性.

2S/D处理的血液制剂的安全性和临床有效性

1985年美国药品食品管理局(H)A)批准纽约

血液中心的S/D处理的AHF浓缩制剂,发现这一

加工程序大大降低了传播乙肝的危险,并进而解决

了凝血因子浓缩物的HIV传播问题.在1985～

1997年间,输入{F约600万剂量,使用人数超过

75000例,平均每年每例病人输入80000个国际单

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位.纽约血液中心近来估计,通过S/D方法制备的

凝血因子浓缩制剂其传染HIV,HBV和HCV的机

率分别小于1/10l6,1/10及1/10.目前约有2/3

的AHF的输注是在北美进行的,从未发现有严重不

良反应及传播病毒的报告【5J.,西欧及日本也相继

采用S/D处理法作为灭活脂包膜病毒的一种方

式【6J.在无数的体内动物试验,7项评价肝炎病毒

传播的临床现场研究【7J,11个独立的对肝炎病毒敏

感的427例血友病病人的临床研究和1项对HIV

敏感的455例血友病病人的临床研究中,从未报告

有HBV,HCV及HIV传播的情况.自1991年以

来,已在欧洲制造了2000余批凝血因子,足见S/D

处理法的稳定性.

用S/D处理的血浆在1991年由德国审批通

过,并在德国,法国,澳大利亚和荷兰进行常规应用,

在挪威和比利时,S/D血浆已完全取代了冰冻人血

浆.在超过200万单位的S/D血浆及超过1100万

单位的S/D处理的血液制剂输入过程中尚无病毒

传播的报告,证明广泛使用S/D处理血浆是安全

的.

通过输血而得的主要病毒性疾病的致病因子是

HIV,HBV和HCV,它们是脂包膜病毒,可经S/D

处理而被有效杀灭.然而,对非包膜病毒而言,则不

受影响,尤其是甲肝病毒(W)和细小病毒B19,此

外,与克一雅病相关的致病因子朊病毒也不能被

S/I]处理所灭活,故在理论上传播这种疾病的危险

目前尚不能排除.针对这一问题.我们认为鉴于处

理血浆是混合血浆,其中含有相当水平的抗HAV

及抗细小病毒B19的保护性抗体能够中和血浆中

漏检的或未检的HAV和B19.实践证明,这些抗体

在防止HAV和细小病毒B19的传播方面是有效

的.

甲肝的病毒血症极短,仅有几天时间,据我国病

毒性肝炎流行病学调查研究结果表明[sJ,我国人群

中HAV的感染率平均为71.4%,抗HAV抗体阳性

率在1O岁以前迅速上升,15岁达82%,以后维持在

高水平.另外,根据英国公共卫生实验署披露的资

料【9J,在1985～1992年间,英国每年甲肝的发病人

数在400O～10000名之间,儿童占56%,25岁以上

的病例占2O%,这些人可提供80%的供体血浆,鉴

于病毒血症期极短,故预计每年最多有25个供血者

来自HAV病毒血症的个体,因此HAV感染的血浆

单位的机率是非常低的.对血液输注而言,HAV病

例是如此稀少,主要归因于病毒血症期短暂.通常

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系亚临床感染,病人限制了病毒的传播等因素.在

对旅游者进行甲肝预防时,通常接受混合的人免疫

球蛋白250mg,而仅接受经处理的200ml的灭活

血浆就相当于接受了1600mg的IgG,经这样的输

注,抗HAV的水平就可建立起来.更何况在一般

情况下,输注血浆的剂量还远远不止200ml,因此,

这种输注将使HAV传播的危险性维持在最低限

度.

细小病毒B19是另外一种具有潜在重要性的

非脂包膜病毒.在一般情况下,细小病毒B19感染

产生一种轻微的,自限性的感染征象,在某些病人可

发生严重的临床征象.怀孕期妇女,尤其是妊娠头

20个星期导致流产和胎儿水肿危险的可能性分别

为10%和1.5%.溶血性贫血患者可能有短暂的发

育不全危象.长期以来人们就认识到在血友病病人

中存在抗细小病毒B19抗体.细小病毒B19感染

在人群中的机率较高,在非流行期,供血者可检出

B19基因序列的机率是1/3300【lo),第六细小病毒

工作组的报告指出,在临床样品中,细小病毒B19

在流行期存在的机率是1/167.在美国曾对一组青

年血友病患者进行检测,发现抗B19抗体阳性率达

88%.

美国Vitex公司生产的34批病毒灭活血浆检

测证实【l1】,每mL血浆至少含有0.8IU(国际单

位)的抗HAV抗体以及8IU的抗细小病毒B19抗

体.按病毒灭活血浆受体的体重为60kg,10ml/kg

体重计,将至少接受5000mg的IgG抗体,480IU

的抗HAV抗体(这个剂量是投递HAV疫苗制剂所

诱导的抗体的许多倍).而所接受的5000mgIgG

含量则相当于旅游者预防甲肝所用250mgIgG剂

量的20倍;以此类推,至少接受5000mgIgG的受

体,也同时接受了4800IU的抗细小病毒B19抗

体,1个单位的病毒灭活血浆所含的抗B19抗体的

量与治疗细小病毒B19感染所用的治疗剂量几乎

相等.上述病毒灭活血浆中所含的抗HAV及抗细

小病毒B19抗体的量足以能够中和血浆中残存的

HAV及细小病毒B19.

在S/D血浆的临床有效性研究方面,自1991

年以来,在美国已经进行了8个有关S/D血浆的临

床研究u引.在具有凝血因子缺陷的病人中,需要进

行预防性的血浆输入,在32名输血者中,有30名病

例达到止血水平;另外一项试验表明在46名输血者

中,其中40名患者达到理想的临床效果;4名Ⅻ因

子缺陷的病人在长达42个月的预防性治疗中均未

发生临床征象;在20名具有凝血因子缺陷的出血病

人中,19名病人输注S/D处理血浆后,均缩短了凝

血酶原时间或部分激活凝血活酶时间,其中9名病

人获得了理想的临床效果,而对照组51人中有49

名仍然出血未愈.具有慢性血栓性血小板缺乏性紫

癜(1vrP)的病人在经S/q3血浆治疗后,其活存率,

缓解率和复发率等方面均与接受新鲜冰冻血浆的病

人类似..

与使用S/D处理血浆相关的副反应非常少,在

66名给予超过80o单位S/D处理血浆的病人中,没

有出现明显的可持续的有害现象,输人S/D血浆每

单位的总反应率为0.66%(FDA,S/I)血浆制品单

行本,1997年2月).这些反应包括颤抖,腹痛,气

短,哮喘等,与输人FFP(新鲜冰冻血浆)比较,其频

率相差不大,而S/D处理血浆的变态反应却较FFP

的低.

临床研究已在两个领域证实了它的有效性:①

在已被证实缺乏凝血因子的病人中,在没有凝血因

子可利用的情况下,用S/D血浆代替凝血因子进行

治疗;②用于治疗血栓性血小板减少性紫癜(1vrP)

病人.FDA提供的资料表明,在所有9名病人中,

S/D血浆能够达到理想的治疗效果.

3S/D处理血浆的临床应用

Hellstem等对S/I)处理血浆进行了详尽的质

量检测【1,结果表明血浆各类蛋白质除了蛋白S,

a2抗纤溶酶损失较大而外,其余均无明显损失,均

处于正常血浆的范围之内,S/I)血浆含有的V,Ⅶ,

Ⅷ,Ⅸ,X,Ⅺ,Ⅻ各种凝血因子的含量均大于0.7u/

rnl,纤维蛋白原为1.8m_g/ml.S/D法处理也不会

导致凝血因子激活.体外试验表明S/D血浆不会

导致红细胞溶血,也不导致血小板的功能及形态变

化,从而证实了S/D血浆的可靠性.

德国于1991年就已批准S/D血浆正式用于临

床.目前奥地利,德国,法国,荷兰,挪威和比利时已

有正式的S/D血浆制品.最近FDA签发了"溶剂/

去污剂(s/I))处理的混合血浆"的许可证,这就使美

国临床输血用血浆制品达到3种.

有关输血用血浆制品的适应症问题,美国病理

学学会于1994年发表了使用新鲜冰冻血浆的实践

指南,指明了选择血浆制品的实用方法.S/D处理

血浆的临床适应症包括如下几个方面:①血栓性血

小板减少性紫癜;②先天性凝血因子Ⅱ,V,Ⅶ,X,

Ⅺ,XⅢ缺乏;③严重肝病伴活动性出血;④手术或

创伤性诊断之前;⑤大量输血及输多种血制品后伴

血凝障碍,⑥对抗华法令效应(ReversalofWarfarin

Effect),不可能得到其他血制品者;⑦抗凝血酶Ⅲ缺

乏;⑧免疫缺陷的治疗;⑨手术,烧伤,失血,创伤性

休克及低蛋白血症;⑩血液置换疗法;(11)早产儿

(体重低于1500克者);(12)肿瘤.

总之,S/D血浆和普通新鲜冰冻血浆的生物学

特性和临床治疗效果都很类似,但S/D血浆可较好

地保证血浆的病毒安全性,这对需要反复接受FFP

治疗的病人尤其重要.

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