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22L毒株朊蛋白错误折叠循环扩增方法的建立

李建疆;李泽鸿;万家余;高宏伟

【摘要】参考Saborio和Soto创建的名为蛋白质错误折叠循环扩增(protein

misfoldingcyclicamplification,PMCA)的方法建立一种22L毒株系朊蛋白错误

折叠循环扩增方法,以便研究22L毒株系异常朊蛋白(scrapiePrP,PrPSc)的合成机

制.在阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)存在的条件下,这种方法可以通过超声降

解从而重复扩增产物,并在仓鼠脑匀浆中快速有效的模仿体内朊病毒PrPSc的复制,

因此可以在几个小时内高浓度扩增PrPSc.已有试验结果发现,PrPSc体外转化率在

使用粗提的脑组织匀浆时比使用纯化重组PrP更高,这个发现暗示着高效率的

PrPSc转化可能还需要探索其他未知的宿主因素.研究结果表明,建立的这种改良的

PMCA技术可用于研究PrPSc合成的生物化学机制,以此来进行诊断与治疗方法的

研究.

【期刊名称】《中国畜牧兽医》

【年(卷),期】2010(037)002

【总页数】5页(P71-75)

【关键词】朊病毒;22L毒株;蛋白质错误折叠循环扩增技术

【作者】李建疆;李泽鸿;万家余;高宏伟

【作者单位】吉林农业大学,长春130118军事医学科学院军事兽医研究所,长

春,130062;吉林农业大学,长春130118;军事医学科学院军事兽医研究所,长

春,130062;军事医学科学院军事兽医研究所,长春,130062

【正文语种】中文

【中图分类】S852.65+9.7

朊病毒病是细胞表面的正常朊蛋白(cellularPrP,PrPC)发生错误折叠而形成具有感

染性的异常朊蛋白(scrapiePrP,PrPSc)所导致的一组神经退行性疾病,PrPC转化为

异常构象的PrPSc是至关重要的(Prusiner,1991,1998)。目前,PrPSc转化、增殖

及致病机理仍不清楚,对PrPSc导致朊蛋白病的详细机制尚不清楚,但目前普遍认为

发病的基本过程是:少量PrPSc与细胞PrPC结合后,以PrPSc为模板,使PrPC发生

明显构象改变而转变为PrPSc,从而达到PrPSc传染扩增的目的,最后使PrPC全部

转变成不溶性的PrPSc,脑组织形成淀粉样斑块直至死亡(梁洁,2006;韩生成

等,1998)。

近年来,已经有多种PrPSc的检测方法不断出现,意在提高检测的敏感性。蛋白质错

误折叠循环扩增(proteinmisfoldingcyclicamplification,PMCA)技术的出现和

应用(Saborio等,2001;Castilla等,2005)则为研究朊病毒病的发病机制和建立敏感

性高、特异性强的检测方法提供了很好的技术平台,并且利用PMCA技术培育出跨

界朊病毒而为有效治疗人类克雅氏病提供帮助。

1材料与方法

1.1主要材料羊瘙痒症因子22L毒株(军事医学科学院军事兽医研究所第五实验室

保存),其原液为经羊瘙痒症因子22L毒株感染的10%鼠脑组织匀浆液。PrP的小鼠

单克隆抗体1H2(军事医学科学院军事兽医研究所第五实验室保存);辣根过氧化物

酶标记的羊抗鼠IgG(中杉金桥);ECL显色试剂盒为普利莱SuperECLPlus超敏发

光液,KodakXOMATBTFilm。

1.2病变仓鼠脑组织匀浆的制备称取1份经羊瘙痒症因子22L毒株感染的小鼠脑

组织样品,加入PMCA转换夜(1×PBS(pH7.2),1%TritonX-100,5mmol/L

EDTA,150mmol/LNaCl,1×蛋白酶抑制剂),制成10%脑匀浆液。5000g离心5

min,吸取上清,分装保存于-80℃备用。

1.3健康仓鼠脑组织匀浆的制备取4只健康成年仓鼠新鲜脑组织样品,分别称重;以

预冷的0.1mol/LPBS(5mmol/LEDTA,pH7.2)制成10%脑匀浆液。2000g离

心10s,吸取上清,加入1×蛋白酶抑制剂,分装保存于-80℃备用。

1.4PMCA将羊瘙痒症因子22L毒株加至10%健康仓鼠脑组织匀浆:取4℃预冷的

0.2mL离心管分别加入20μL羊瘙痒症因子与180μL健康仓鼠脑组织匀浆,混

匀。37℃振荡孵育1h,取出后进行超声10s,间隔10s,37℃孵育1h,再超声,再孵

育,如此重复30～45个循环,并以200μL健康仓鼠脑组织匀浆作为对照同样超声。

1.5Westernblotting检测将扩增后的样品分为2份,一份用终浓度为50μg/mL

的蛋白酶K(proteinaK,PK)45℃消化2h,另一份加入等体积的蒸馏水作为未PK

消化的对照组,结束消化反应分别加入1μL的PMSF(5mmol/L),所有样品消化后

经12%SDS-PAGE电泳2h,250mA电转2h至硝酸纤维素膜;5%脱脂奶粉封闭

过夜,PrP的小鼠单克隆抗体1H2一抗(1∶5000PrP单克隆抗体1H2)37℃孵育2

h,每隔10minTBST(Tris-buffersaline,pH7.6,含0.5%Tween20)换液洗涤40

min;二抗(1∶5000辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠)37℃孵育1h,每隔10min

TBST换液洗涤40min;ECL化学发光方法显色,Kodak胶片曝光成像。

2结果

2.1PMCA方法的建立将羊瘙痒因子22L毒株原液按终浓度为

1∶10,1∶100,1∶1000(体积分数)分别与健康仓鼠脑组织匀浆混合,经45个循环的

超声与孵育后,扩增产物进行Westernblotting检测。结果发现经过45次循环扩

增后,含有终浓度为1∶10和1∶100稀释的羊瘙痒因子22L的反应中出现明显的

蛋白酶抗性PrPSc(图1,第2列,第3列),1∶1000稀释的条带(图1,第4列)也可辨

别。而含有终浓度为1∶10,1∶100,1∶1000(体积分数)羊瘙痒因子22L毒株但未

经超声孵育的对照组(图2)以及不含有羊瘙痒因子22L毒株的健康仓鼠脑组织匀浆

对照组(图3)无明显PK抗性PrPSc的存在。表明超声孵育组的PrPSc含量在不同

程度上较未超声孵育组有所增加,由图2、3可知,22L毒株原液稀释浓度在检测范

围为10-4的时候无法检测出结果,所以建立以羊瘙痒因子22L毒株原液按终浓度

为1∶10000(体积分数)的PMCA检测方法,以扩增时间为0、10、20、30、40h

的时段分别检测PrPSc的存在,结果表明,在0h时刻未能检测出结果,而在10、20、

30、40h时间段检测出PrPSc含量递增效果(图4)。进一步验证扩增效果,发现终

浓度为1∶1000稀释比的羊瘙痒因子扩增反应组(图1,第2列)经PMCA产生的

PrPSc信号明显强于1∶100稀释比未经扩增反应组(图2,第2列),新产生的PrPSc

以双糖基化类型为主,在后期以1∶10000羊瘙痒因子敏感性扩增反应组可见有的

单糖基化条带(图5,第5列)。这表示羊瘙痒因子22L仓鼠适应株可利用正常仓鼠

脑组织在体外进行复制,新产生的PrPSc与原始的PrPSc一并保持着原有理化特性。

该试验经重复后,结果表明,建立的PMCA可以支持羊瘙痒因子22L在体外稳定的

复制,而且正常脑匀浆在该条件下不会自发产生PK抗性蛋白(图3)。

图4PrPScPMCA方法的建立注:①1,羊瘙痒因子22L毒株终浓度10-4原液脑组织

匀浆混合物未经超声孵育直接上样作为对照;2,终浓度10-4原液的脑组织匀浆混合

物经10次循环超声孵育;3,终浓度10-4原液的脑组织匀浆混合物经20次循环超

声孵育;4,终浓度10-4原液的脑组织匀浆混合物经30次循环超声孵育;5,终浓度

10-4原液的脑组织匀浆混合物经40次循环超声孵育。②样品1～5经过PK酶消

化上样。

2.2PMCA方法的敏感度性检测鉴于验证其敏感性,将羊瘙痒因子22L毒株原液按

终浓度为1∶100(10稀释)起始,用10%健康仓鼠大脑组织匀浆进行10倍递增稀释,

经如上45次循环后进行Westernblotting检测。结果发现在10-2～10-5稀释

度之间出现明显的蛋白酶抗性PrPSc信号,10-2与10-3稀释度下PrPSc信号强度

无明显差别,提示PrPSc在PMCA中的复制能力保持稳定,并且10-4与10-5PrPSc

信号强度基本保持不变;在10-6稀释度时仍可见有微弱的PrPSc信号,在10-7稀

释度下已经检测不到PrPSc信号(图5,第3-8列)。图5第2列未经超声的毒株原

液条带显示出蛋白酶抗性的PrPSc信号弱于其他稀释浓度下经超声过的样品(图5)。

图5PrPScPMCA方法的敏感度检测注:①1,不含毒株原液的脑组织匀浆混合物经

超声孵育作为对照;2,羊瘙痒因子22L毒株原液直接上样作为对照;3～8,终浓度10-

2～10-7毒株原液的脑组织匀浆混合物经超声孵育。②样品1～8经过PK酶消化

上样。

2.3不同试验条件对PMCA扩增效果的影响超声波降解和SDS这两个因素都能使

生物大分子变性,已有研究结果表明,这两种因素对PrP的结构有影响。试验结果表

明,在缺乏超声波降解和SDS的条件下,可以通过将正常的脑组织匀浆与1∶50倍

稀释的羊痒病脑组织匀浆混合,能够产生6倍的PrPSc。超声波强度过强会导致病

变朊蛋白的变性,太弱不能有效地破碎增殖的PrPSc聚合体,并且不同毒株PMCA

条件也不同,需要认真摸索(Surachai,2004)。

在体外扩增PrPSc时,最适的pH为6～8,但也因物种而有所差异。这些因素说明

PrPC转化为PrPSc将在pH环境最佳的细胞部位发生,比如细胞膜的外表面或是细

胞质内。动力学和温度控制试验表明PrPSc扩增的适宜温度为25～37℃,而不是

4℃。正常脑匀浆(PrPC)的制备过程应当尽量保持低温以免其中所含的底物(PrPC)

降解。制备好的脑匀浆应当保存在-80℃并且避免反复冻融,解冻时应在4℃环境,否

则会对扩增效率产生不利影响(Castilla等,2006)。

3讨论

PMCA包括周期性的加速朊病毒复制,每个周期由两个阶段组成。第一阶段把含有

微量的PrPSc样本与大量的PrPC共孵育,诱导更多的PrPSc聚合物。第二阶

段,PrPSc聚合物大量增殖后,使用超声打破聚合物,成倍的复制“种子”。因此,每个

周期的PrPSc聚合物分裂为“种子”数目是指数的方式增加的。循环性的系统允

许经过许多周期的扩增复制以便达到常规检测PrPSc水平。从某种意义来讲

PMCA概念上类似于DNA扩增聚合酶链反应(PCR)(Soto等,2002;Castilla

等,2005;Saá等,2006)。

在本研究中,将羊瘙痒因子22L感染仓鼠脑组织的PrPSc与正常仓鼠的组织匀浆混

合,利用PMCA技术,实现了PrPSc在体外的大量扩增。PMCA技术通过超声波脉

冲,将PrPSc聚集体破碎,在37℃孵育下使PrPSc蛋白分子能够与更多的PrPC结

合并相互作用,当使后者构象转变成为PrPSc分子后,再次使用超声脉冲,从而使新产

生的PrPSc与更多的PrPC结合。

目前传染性海绵状脑病的活体诊断面临着很大困难,由于除脑组织以外其他组织中

的PrP含量极少,用常规方法无法检测,如何提高检测技术上的灵敏性成为首要问

题,PMCA的技术使得含有朊病毒的样品中PrPSc成倍聚集扩增而提高含量,以达到

常规方法检测范围。近来,急需一种快速和灵敏的朊病毒检测技术以控制北美地区

的CWD和欧洲的BSE和vCJD的传播(Soto等,2003)。PMCA技术的开创提高了

检测感染病例的精确性,并促进了以消灭这些疾病为目标的公共卫生项目的开展。

此项技术原则上可以用于增加PrPSc检测技术的敏感性,因此可以利用PMCA技术

在体外模拟这些原本在体内发生的扩增,以此来进行诊断与治疗方法的研究。

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