blood and bone

OTUD7B在急性髓系白血病细胞中的功能及机制

龚秀峰;吴英理;赵倩;雷虎

【摘要】Objective·Toinvestigatethebiologicaleffectandmechanismof

OTUD7Binacutemyeloidleukemia(AML)s·Theexpressionof

OTUD7Binperipheralbloodmononuclearcellsandbonemarrow

ationship

betweenOTUD7BandsurvivalofAMLpatientswasconfirmedbyusing

odelofM2typeAMLwastablished,andthe

expressionofOTUD7Binthebonemarrow,spleenandliverofthemice

7BwasoverexpresdinAMLcelllinesHL60and

kasumil,/mTOR

pathwayproteinsweredetectedafterOTUD7Boverexpresdandthenthe

cellgrowthinhibitionwasdetectedafteroverexpression

s·TheexpressionofOTUD7Bwaslowerinprimaryleukemia

cellsfromalltypesofAMLpatientsandinthebonemarrow,liverand

spleenofM2typeAMLmice,whichwasclolyrelatedtothesurvivaltime

7BoverexpressioninHL60andkasumilcells

significantlyinhibitedthecellviabilityanddecreadthepercentageofS

7BsignificantlyinhibitedthephosphorylationofAKTand

mTOR,andAKT1overexpressionpartiallyreverdtheinhibitoryeffectof

sion·OTUD7Bexpressionislowinprimary

leukemiaceilsfromAMLpatientsandinbonemarrow,liverandspleenof

vivaltimeofpatientswithlowOTUD7B

pressionofOTUD7Bsignificantlyinhibitedthe

cellviabilityofHL60andkasumi1cellsandtheentryofcellsintoS

ibitoryeffectofOTUD7BoverexpressiononAMLcellsmight

berelatedtotheinhibitionofAKT/mTORsignalingpathway.%目的·探讨

OTUD7B在急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia,AML)细胞中的生物学效应

与作用机制.方法·检测AML患者外周血单个核细胞中OTUD7B基因的表达和

AML患者骨髓单个核细胞中OTUD7B蛋白的表达.利用TCGA数据库验证

OTUD7B与AML患者生存期的关系.构建M2型AML小鼠模型,检测模型小鼠骨

髓、脾脏和肝脏中OTUD7B的表达.在白血病细胞株HL60和kasumi1中过表达

OTUD7B,检测OTUD7B蛋白对细胞活率及细胞周期的影响;在稳定表达OTUD7B

的HL60和kasumi1细胞株中,检测AKT/mTOR通路蛋白的变化;过表达AKT1后

检测OTUD7B引起的细胞生长抑制的变化.结果·OTUD7B在各个类型AML患者

原代细胞中表达量均较低.OTUD7B表达量与AML患者的生存期密切相关.与野生

型小鼠比较,M2型AML小鼠骨髓、肝脏及脾脏中OTUD7B的表达量均较

低.HL60和kasumi1细胞中过表达OTUD7B能够显著抑制细胞活率,降低S期细

胞的比例,并显著抑制AKT和mTOR蛋白的磷酸化;过表达AKT1后能够部分逆转

OTUD7B对细胞的生长抑制作用.结论·OTUD7B在原代AML患者细胞及M2型

AML小鼠的骨髓、肝脏和脾脏中低表达,并且OTUD7B表达量低的患者生存期更

短.OTUD7B过表达能明显抑制AML细胞HL60和kasumi1的细胞活率,并且显著

抑制细胞进入S期.OTUD7B过表达对AML细胞的抑制效应可能与抑制

AKT/mTOR信号通路的活化有关.

【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》

【年(卷),期】2018(038)001

【总页数】6页(P18-23)

【关键词】OTUD7B;急性髓系白血病;增殖抑制;AKT/mTOR信号通路

【作者】龚秀峰;吴英理;赵倩;雷虎

【作者单位】上海交通大学医学院病理生理学系,细胞分化与凋亡教育部重点实验

室,上海200025;上海交通大学医学院病理生理学系,细胞分化与凋亡教育部重点实

验室,上海200025;上海交通大学医学院病理生理学系,细胞分化与凋亡教育部重点

实验室,上海200025;上海交通大学医学院病理生理学系,细胞分化与凋亡教育部重

点实验室,上海200025

【正文语种】中文

【中图分类】R733.71

据统计，中国白血病的发病率为（7～8）/10万，而且每年新增8万例，其中以

急性髓系白血病（acutemyeloidleukemia，AML）居多[1-2]。AML具有治疗

效果差、复发率高等特点，其FAB分型（French-American-Britishclassifi

cationsystems）包括8个亚型（M0-M7）。AML的治疗在过去35年间取得了

较大的进步，特别是M3型急性早幼粒细胞白血病（APL）的治疗取得了较大的成

功，但耐药和复发成了新的临床难题。传统疗法对年轻AML患者预后的改善已基

本达成，但是却没有显著提高老年AML患者生存率，成人AML中60岁以上患

者的治愈率仅5%～15%[3]。虽然造血干细胞移植可缓解有较高复发风险的AML

患者的病情，但却存在造血干细胞的配型难及免疫不相容等问题[4]。CART疗法

在近2年发展较迅速，美国FDA已批准CD19-CART细胞药物上市，用于治疗儿

童和年轻成年急性淋巴细胞性白血病（ALL）患者；但是CART疗法非常昂贵，其

自身存在的炎症因子风暴等问题也是目前临床上的难题，其对AML的治疗应用还

处于研发阶段[5-6]。此外，美国FDA在2017年4月批准了第一个用于靶向治疗

AML的药物Midostaurin，用于治疗FLT3阳性的AML患者。综上所述，AML

的机制研究及药物开发进入了一个快速发展的时期，进一步明确AML的发病机制

对于靶向药物的研发及临床诊断监测AML患者的预后情况具有重要的作用。

去泛素化酶（DUB）是一类参与蛋白翻译后修饰的蛋白，其主要功能是将目的蛋

白的泛素化修饰去掉，从而调控目的蛋白的稳定性及空间定位等。DUB根据性质

不同可以划分为2大类，其中一类属于金属蛋白酶JAMM家族（Jad1/Pad/MPN

domain-containingmetalloenzymes），另一类则属于半胱氨酸蛋白酶。后者

根据泛素蛋白酶结构域的不同又可细分为5个亚类：泛素特异性蛋白酶

（ubiquitinspecificproteas，USP）、碳末端水解酶（ubiquitinC-teminal

hydrolas，UCH）、卵巢肿瘤相关蛋白酶（ovariantumor-likeproteas，

OTU）、MJD蛋白酶（Maehado-Jophdiadomainproteas）和

MCPIP家族（monocytechemotacticprotein-inducedprotein）[7-9]。DUB

参与机体内多方面的生命活动，如挽救蛋白质降解的命运、去除非降解性泛素信号、

维持稳定的泛素含量以及介导泛素的信号转换等[10]。目前已知DUB的生理功能

主要包含4个大的方面：癌症、免疫、干细胞与发育调控、代谢与应激[7,11-14]。

OTUD7B又名Cezanne，属于OTU家族的一员。OTUD7B能够去泛素化TRAF3，

参与调控非经典的NF-κB信号通路；OTUD7B在T细胞的活化及炎症反应中通过

调控Zap70蛋白的去泛素化而实现炎症的抑制[15-16]。近2年的研究发现

OTUD7B的底物还包括HIF1α和GβL蛋白，进一步说明其参与癌症发生的关键

信号通路[17-18]。然而，OTUD7B在AML中的功能尚未阐明，因此我们检测了

AML患者细胞中OTUD7B的表达情况，并进一步研究了OTUD7B在AML细胞

中的功能及作用机制。（生工，中国）。p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR抗体

（CellSignalingTechnology，美国）；OTUD7B、β-actin、HRP偶联的二

抗（Proteintech，中国）；HRP-显色试剂盒（Millipore，美国）；CCK8

（DojindoMolecularTechnologies，日本）；细胞周期检测试剂盒（BD

Biosciences，美国）；OTUD7B质粒（Addgene，美国）；AKT1质粒（Sino，

中国）。

1.1.2主要仪器超净工作台（Thermo，美国）；倒置相差显微镜（Nikon，日

本）；SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳及转印装置（Bio-Rad，美国）；RealtimePCR

仪（ABI7900，日本）；流式细胞仪（BDFACSCalibur，美国）；CO2培养箱

（Thermo，美国）；低温高速离心机（Hettich，德国）；LAS4000化学发光成

像系统（GE，美国）。

1材料与方法

1.1主要试剂和仪器

1.1.1主要试剂胎牛血清（FBS，Gemini，南美）；RPMI-1640培养基

（Hyclone，美国）；青霉素/链霉素溶液（100×）

1.2方法

1.2.1细胞培养HL60和kasumi1细胞在含有10%热灭活胎牛血清、青霉素

（100U/mL）和链霉素（100g/mL）的RPMI-1640培养基中培养，放置于

37oC、含有5%CO2的恒温培养箱中。

1.2.2外周血及骨髓单个核细胞分离将AML患者新鲜的外周血及骨髓血分别用聚

蔗糖泛影葡胺分层液（ficollhypaque，GE，美国）400×g离心后，取中间层的

细胞并进一步裂解红细胞，600×g离心获得较纯的单个核细胞。健康对照的单个

核细胞采取同样方法获得。获得的单个核细胞用TRIzol（Takara，日本）进行

RNA提取，或用SDS裂解液（碧云天，中国）进行蛋白提取，获得的RNA及蛋

白用于后续实验。外周血和骨髓样本采集符合伦理学规范，并获患者知情同意。

1.2.3RealtimePCR实验将提取所得的RNA反转录（Takara，日本）为cDNA，

然后进行realtimePCR实验（SYBRGreen，Roche，瑞士），结果分析采用

2ΔΔCt方法。引物序列：OTUD7B正向引物5'-AGCAGACACAGCAGAATA-3'，

反向引物5'-TCAGTTCATTCCACTCCTT-3'；GAPDH正向引物5'-

CTTAGCACCCCTGGCCAAG-3'，反向引物5'-CTTAGCACCCCTGGCCAAG-3'。

1.2.4M2型AML小鼠模型的构建将实验室保存的通过AML1-ETO发病的小鼠

[19]脾脏细胞（1×106）经尾静脉注射到经4.5GyX线辐照的BALB/c小鼠体内。

在发病过程中监测小鼠体内白血病细胞的数目，等到小鼠发病较严重时（19d，

即出现第1只小鼠死亡的时候），处死小鼠取骨髓细胞、脾脏组织和肝脏组织。

将脾脏和肝脏经液氮研磨后加RIPA裂解液提取蛋白，骨髓细胞裂解红细胞后直接

加RIPA裂解液提取蛋白。

1.2.5台盼蓝排斥测试法检测细胞活率及生长抑制率将

空载及过表达OTUD7B的对数生长期的细胞按7.5×104/mL的密度接种于6孔板

中，每孔2mL，培养48h后收集细胞。将空载、过表达OTUD7B的细胞及过表

达OTUD7B和AKT1的细胞以7.5×104/mL的密度接种于6孔板中，每孔2mL，

同样培养48h后进行染色。将部分细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液等体积混合均匀，

在倒置显微镜下计数。根据公式求细胞活率：活细胞率（%）=活细胞总数/（活

细胞总数+死细胞总数）×100。生长抑制率（%）=（空载细胞总数－转染组活

细胞总数）/空载细胞总数×100。

1.2.6流式细胞仪检测细胞周期将预检测细胞1000×g离心5min，收集细胞，

吸除上清后加入1mL预冷PBS重悬细胞，再次离心收集细胞后重悬细胞（密度

为5×105/mL）。离心后用1mL预冷的70%乙醇轻混匀，4℃固定过夜。离心后

用1mL预冷PBS重悬细胞，再次离心收集细胞。在500μL染色缓冲液中加入

10μL碘化丙啶（PI）储液和10μLRNaA溶液，混匀待用。每种细胞样品加

入500μL配置好的PI染色液，轻混匀重悬细胞。37℃避光孵育30min，用400

目筛网过滤后进行流式检测。

1.2.7WesternblottingAML细胞经1000×g、4oC离心5min，PBS洗涤2

次后，弃上清，加入50μL预冷PBS，细胞混匀后加入等体积的2×SDS，混匀后

100oC水浴加热5min，冰上放置5min，循环3次。12000×g室温离心10

min，收集上清。取少量裂解液进行蛋白定量，等量上样，行蛋白电泳。电泳结束

后转移印迹至NC膜（Pall，美国）上，用5%脱脂牛奶室温封闭1h。加入稀释

好的一抗（均为1:1000稀释），4oC孵育过夜。用1×PBST缓冲液洗膜5min，

反复3次。然后加入相对应的二抗室温孵育1h。吸除二抗后，1×PBST缓冲液洗

膜3次，每次5min。加入底物发光的ECL（Millipore，美国）在LAS化学发光

仪上进行显影。

1.2.8病毒的包装及感染将HEK293T细胞种到10cm培养皿中，等到细胞密度

达到80%左右将OTUD7B及辅助质粒VSVG和Gag/pol按照4:2:4的比例进行

细胞转染，6～8h后换液，再过48h后收集病毒。将病毒上清按照1/5体积加

入细胞培养基中，加入polybrene（工作浓度为8μg/μL）后400×g离心2h感

染细胞，培养6～8h后换液继续培养。

1.3统计学方法

采用GraphPadPrism5软件进行统计学分析及作图，实验中所有数据均重复2～

3次。数据以表示，采用Student’st检验，p＜0.05表示差异具有统计学意义。

2结果

2.1OTUD7B在原代AML患者外周血和骨髓单个核细胞中低表达

采用ficollhypaque分离并收集了多例AML患者的外周血或骨髓单个核细胞，

进行挑选后将患者分类，获取了M1～M6各型的样本。采用RNA检测和蛋白检

测2种方式比较患者与健康对照OTUD7B表达的差异。结果显示，OTUD7B在

AML患者外周血单个核细胞中的表达明显低于健康对照（图1A）。Western

blotting结果表明OTUD7B蛋白在AML患者骨髓单个核细胞中的表达量也很低

（图1B）。

2.2OTUD7B与AML患者生存期呈负相关

图1OTUD7B在AML患者外周血和骨髓单个核细胞中的表达Fig1OTUD7B

expressioninperipheralbloodmononuclearcellsandbonemarrow

mononuclearcellsofAMLpatients

通过TCGA数据库获取AML相关数据，分析了81例高表达和81例低表达

OTUD7B的患者数据，采用Kaplan-Meier生存分析法来计算生存期及生存率，

并采用Log-rank检验比较差异。结果表明，OTUD7B表达量高的患者中位生存

期较长（P=0.004）（图2）。

2.3OTUD7B在M2型AML小鼠模型中低表达

图2高表达与低表达OTUD7B的2组AML患者的生存曲线Fig2Survivalcurve

ofAMLpatientswithhighlevelorlowlevelOTUD7B注：根据OTUD7B的表

达将患者分为高低2组，并用Kaplan-Meier生存分析法来计算生存期及生存率。

OTUD7B高表达组中位生存期为671d，而低表达组的中位生存期为366d。

为了进一步验证OTUD7B与白血病的关系，我们构建了M2型AML小鼠模型。

结果发现AML1-ETO诱发的白血病小鼠发病比较成功，小鼠的生存期为3周左右

（图3A）。在构建小鼠模型后的第19日，将2组小鼠处死，并分别取小鼠的骨

髓、脾脏和肝脏，进行OTUD7B蛋白的检测。结果表明，OTUD7B在发病小鼠的

骨髓、脾脏和肝脏中表达量均较低，特别是骨髓中的表达量接近于零（图3B）。

2.4OTUD7B过表达抑制AML细胞的生长

由于AML细胞中OTUD7B的表达量降低，因此我们将OTUD7B重新表达到M2

型AML细胞系中，使其表达升高，然后观察并检测AML细胞的生长情况。结果

表明，HL60和kasumi1细胞中OTUD7B过表达后能够显著抑制细胞的活率，转

染后3日的细胞活率能够降低到50%左右（图4A、B）。此外，细胞周期实验表

明，OTUD7B能够显著降低S期细胞的数量，并且明显增加sub-G1期细胞的数

量（图4C）。以上结果提示OTUD7B能够通过抑制S期细胞的数量而抑制细胞

的生长。

图3OTUD7B在M2型AML小鼠模型中的表达Fig3OTUD7Bexpressionin

M2typeAMLmoumodel

图4OTUD7B过表达抑制AML细胞的生长Fig4OverexpressionofOTUD7B

inhibitingthegrowthofAMLcells

2.5OTUD7B通过抑制AKT/mTOR信号通路而抑制AML细胞的生长

由于OTUD7B的过表达显著抑制了进入S期的细胞比例，我们推测OTUD7B的

功能可能与细胞的增殖信号通路密切相关。再加上近期研究发现OTUD7B和

TRAF2参与了GβL蛋白的去泛素化和泛素化，进而影响mTORC2蛋白的稳定性

[18]，因此我们检测了OTUD7B过表达对AKT和mTOR蛋白磷酸化的影响。结

果表明，OTUD7B在HL60和kasumi1细胞中过表达能够显著抑制AKT和

mTOR的磷酸化（图5A）。为了进一步验证AKT在OTUD7B引起的细胞生长抑

制中的作用，我们在OTUD7B过表达的细胞中进一步过表达AKT1蛋白，图5B

显示了AKT1过表达的效率。AKT1的挽救实验表明AKT1过表达之后能够显著逆

转OTUD7B造成的细胞生长抑制（图5C）。以上结果表明OTUD7B抑制AML

细胞的生长与其抑制AKT/mTOR信号通路密切相关。

图5OTUD7B通过抑制AKT/mTOR信号通路而抑制AML细胞的生长Fig5

OTUD7BinhibitsthegrowthofAMLcellsbyinhibitingtheAKT/mTOR

signalingpathway

3讨论

蛋白的翻译后修饰在调节蛋白的功能和生命活动方面具有重要的作用，其功能主要

通过调控基因的表达、控制蛋白的降解、调节蛋白的定位等实现。DUB能够将底

物蛋白的泛素去除，从而实现蛋白的稳定性增加或活性/定位的改变。DUB家族参

与了细胞生长发育、细胞周期、信号转导等几乎所有的生命活动。我们的研究结果

表明：OTUD7B在AML细胞中低表达，其表达量与AML患者的生存期具有显著

相关性，并且OTUD7B低表达是AKT/mTOR信号通路过度激活进而促进白血病

细胞增殖的重要因素。上述研究提示，OTUD7B在AML中是一个重要的抑癌蛋

白，活化该蛋白可显著抑制AML细胞的生长。

关于OTUD7B的研究目前并不是很多，但TCGA数据分析及已发表文章表明：

OTUD7B的功能涉及免疫与炎症通路、AKT/mTOR细胞增殖信号通路、HIF1α

低氧调控通路等。虽然我们证明了AKT/mTOR通路在OTUD7B抑制白血病细胞

生长过程中有重要作用，但并不能完全排除NF-κB信号通路的作用。NF-κB通路

在AML中过度激活的研究较为透彻，TAK1-NF-κB轴被认为是治疗AML的有效

靶标[20]。然而，NF-κB通路分为经典和非经典2种方式，经典方式由IκB降解

促使NF-κB的入核，而非经典方式由P52/RelB介导NF-κB的入核。目前的研究

发现OTUD7B去泛素化TRAF3，参与调控非经典的NF-κB信号通路[16]，但是

TRAF3在AML细胞中的功能尚未阐明，因此OTUD7B过表达之后是否可以通过

去泛素化TRAF3而抑制AML细胞的增殖尚需进一步的研究。另一方面，

OTUD7B对于HIF1α蛋白稳定性是必需的，并且OTUD7B的缺失通过分子伴侣

介导的自噬途径导致HIF1α降解[17]。同时低氧可以诱导AML细胞分化，因此

OTUD7B的过表达能否促进或增强低氧诱导的AML细胞的分化还有待进一步研

究。我们初步的研究结果表明：OTUD7B过表达在短时间内产生的效应主要是增

殖抑制，表现为S期细胞的比例显著降低。

PI3K/AKT/mTOR通路是促进细胞增殖的重要信号通路，其异常激活在AML细胞

中较为常见[21-22]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体（mTORC）根据组成的不

同可分为mTORC1和mTORC2，其中mTORC2的组成蛋白主要有Rictor、

mSin1、mSLT8和Protor等[23-24]。最近的研究表明K63位多聚泛素化的

mLST8决定了mTORC2形成和活化的稳态，而mTORC2参与介导AKT第473

位丝氨酸的磷酸化，从而促进细胞的增殖[18]。而且OTUD7B在HEK293T细胞

中能够结合并去泛素化mLST8，目前其功能在肺癌细胞中得到验证[18]。本研究

中，我们发现OTUD7B过表达抑制了AKT和mTOR的磷酸化，而且AKT1过表

达后减弱了OTUD7B的生长抑制效应，但是OTUD7B在AML细胞中作用于

AKT/mTOR信号通路的具体机制尚不清楚。基于目前的研究结果，我们假设

OTUD7B在AML细胞中去泛素化mLST8导致mTORC2不能组装和活化，进一

步阻断了AKT第473位丝氨酸磷酸化，从而抑制AML细胞的增殖。但该假设仍

需后续实验的验证。

参·考·文·献

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