感受态细胞

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感受态细胞的制备步骤和原理

实验目的

为了获得大量的质粒作为克隆载体，我们需要将购买来的质粒通过转化的方法导入细菌的细胞内。

制备出感受态的细胞，我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中，使其繁殖，就能获得大量质粒。

本次实验的目的就是增加质粒的数量。同时，我们能掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本

原理和实验技术方法。

实验原理及过程

实验步骤

1挑取一个JM109单菌落于3mlLB(无抗生素)培养基中，37℃，180rpm培养过夜。

[让菌复苏，进入对数期的早中期。此时更容易制得感受态细胞。]

2取0.4mL过夜培养物加入到40mLLB(无抗生素)培养基中，37℃250rpm大约2.5小时。

[减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数，以减少菌的变异。]

3取培养物置于40mL的灭菌离心管中，冰浴10min，4000rpm4℃离心10min，弃上清。（将所有上

清倒光，可以将离心管倒过来）

[使细菌的生长停止，代谢减慢。因为这时已经没有培养基了，如果细菌仍有很高的代谢效率，则

有大量细菌死亡。]

4菌体重悬于10mL100mmol/L冰冷CaCl2中，轻吹，4℃30min，4000rpm离心5min弃上清。

[细菌处于0度，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸

盐混合物黏附于细胞表面（羟基来源于细胞壁上的糖，磷酸来源于DNA），经短时间420C热激处

理，促进细胞吸收DNA复合物。（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）]

5菌体重悬于1mL100mmol/L冰冷的CaCl2中，轻吹，用于转化。

[除去所有的LB以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。防止细胞分裂，以致大量细胞死亡。（一

定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）]

6取感受态细胞100uL，加入2uLpET-21a质粒，冰浴30min受体菌：感受态细胞100uL，加入2uL

无菌双蒸水阴性对照：0.1mol/LCaCl2溶液100uL，加入2uL阴性对照

[第一个阴性对照是为了验证LB中的抗生素有活性；第二个阴性对照是为了验证CaCl2溶液和

pET-21a质粒未被污染。]

[冰浴是为了降低细胞代谢率，防止细胞大量死亡。]

7热激42度，90s

【在低温处理后，热激，可以使细胞壁热胀冷缩，再低温，使细胞壁上黏附的质粒进入细胞体内。】

8冰浴2min

9加入800uL无抗生素的LB，37℃复苏1h

【用LB复苏细胞，使细胞恢复活力，从而使细胞中的质粒表达抗抗生素的基因，只有这样才能使

转化成功的细菌在有抗生素的LB平板上生长。】

10取100ul细胞直接在含50ug/mLCarbenicillin(羧苄西林)的LB培养基上铺平板，将平皿放置37oC

温箱30min至液体被吸收。倒置平皿37oC培养过夜，出现菌落。

【这些菌落为转化成功的菌落，而对照组应该没有菌落。在目的菌落的旁边有可能出现卫星菌落，

这是因为亩的菌落的抗性基因似的菌落周围的抗生素失效，长出了转化为成功的菌落。用羧苄西林

因其对酸稳定、不易被细菌降解，所以可以降低卫星菌落的数量。

因为抗生素高温易失活，所以应等到LB600C时（热而不烫），加入抗生素。】