southern杂交

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地高辛标记探针的Southern杂交技术

根据核酸变性与复性的特性，特定核苷酸序列的单链DNA或RNA能够在一定条

件下与具有互补性的核酸链退火形成双链结构，称之为核酸杂交。将已知的特定核

苷酸序列的单链DNA或RNA进行标记，制成核酸探针，就可以用它检测样品中是否

存在同源序列，或确定不同物种之间的亲缘关系，已成为分子生物学中一类重要的

检测手段，在科学研究和实践中具有十分广泛的用途。它可用于基因组特定DNA序

列的定位，测定相关片段的同源性、从cDNA文库、基因组文库中筛选完整基因等。

还可以用于构建DNA分子的酶切图谱和遗传图—指纹分析等。

核酸杂交检测都是在滤膜上进行的，常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜

等。其基本过程包括以下几步。首先将待检样品DNA或RNA分子直接点加到滤膜上，

或经过凝胶电泳分离再通过毛细管作用或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在

凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的，这个过程称为核酸印迹（nucleicacid

blotting）转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法（dotandslot

blotting）、菌落和嗜菌斑印迹法（colonyandplaqueblotting）；然后将具有核

酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。最后，经

过放射自显影技术或光化学、免疫学技术显示出不同的颜色，根据颜色的有无和深

浅判定结果。根据操作方式和检测对象的不同，核酸杂交技术主要有以下几种：斑

点杂交技术（Dotblot）、Southern杂交技术（Southernblot）、Northern杂交技

术（Northernblot）。前两者用于检测DNA，后者用于检测RNA。本实验主要介绍

Southern杂交技术。

1主要容

rnBlot方法的原理。

琼脂糖凝胶电泳。

转移至硝酸纤维素膜/尼龙膜及膜处理。

4.介绍随机引物法标记DNA探针，Southernblot的预杂交、杂交及显色过程。

2目的要求

掌握Southernblot方法的原理；掌握随机引物法标记DNA探针，印迹法转移

DNA至硝酸纤维素膜及膜处理。

3实验原理

Southern杂交技术是由rn在1975年首先发明的用于检测

DNA的一种核酸杂交技术，并因此而得名。Southern杂交的原理是将待检测的DNA

分子用限制性切酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按照其在

凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其他标记物

标记的DNA探针进行反应。如果待测物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基

互补原理进行结合，游离的探针洗涤后用显影或其他合适的技术进行检测，从而显

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示出待检的片段及其相对大小。

Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的

方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹

（blotting）；二是固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的温度和离子强

度下退火，即分子杂交过程。见图1。

图rnblot印迹杂交原理示意图

（a）核酸切酶消化的基因组DNA；（b）琼脂糖凝胶电泳分离DNA片

段；

（c）凝胶中的DNA谱带转移到硝酸纤维素滤膜上；（d）滤膜与标记的DNA分子探

针杂交；

（e）显色显示杂交的DNA谱带。

Southernblot方法十分灵敏，在理想的条件下，用放射性同位素标记的特异

性探针和放射自显影技术，即便每条电泳带仅含2ngDNA也能被清晰地检测出来。

一、实验仪器：

尼龙膜；恒温水浴，塑料带，剪刀，平头镊子，封口机，烤箱，台式高速离心

机，高压灭菌锅，电泳仪，水平电泳槽，微量移液器，摇床，吸水纸，3MMWhatman

滤纸，干烤皿，玻璃平台等。

二、溶液配制

1．待检基因组DNA、DIG标记和检测试剂盒、各种限制性切酶等。

2．其他试剂

(1)20XSSC(1000mL):

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组分浓度3.0M的Nacl，0.3M的柠檬酸钠

NaCl175.32g

柠檬酸钠88.26g

NaOH调pH值到7.0，

(2)洗涤缓冲液Washingbuffer200ml

组分浓度：0.1MMaleicacid,0.15MNacl;pH7.5(20℃);0.3%(v/v)

Tween20.

马来酸：2.32g

Nacl：1.75g

Tween200.6ml

NaOH固体约1.7g调pH值7.5

(3)马来酸缓冲液Maleicacidbuffer200ml

组分浓度：0.1MMaleicacid,0.15MNacl;pH7.5(20ºC)

马来酸：2.32g

Nacl：1.75g

Tween200.6ml

NaOH固体约1.7g调pH值7.5

(4)检测缓冲液Detectionbuffer100ml

组分浓度：0.1MTris-HCl,0.1MNacl,pH9.5(20ºC)

Tris1.21g,

NaCl0.584g

MgCl

2

1.01g

调ph值到9.5

(5)变性溶液(500mL)：1mol/LNaCl(43.83g)，0.5mol/LNaOH(10

g)，

(6)中和溶液(500mL)：0.5mol/LTris(30.27g)，3mol/LNaCl(87.66

g)，用1mol/LHCl调

(7)5×TBE(250mL)：13.5gTris6.9g硼酸,0.9gEDTA-Na2，定容250

mL

(8)6×溴酚蓝载样液：0.25％溴酚蓝，40％蔗糖

(9)1MTris-HCl(pH8.0):称取12.114gTris-ba,溶于80ml蒸馏水中，

用HCl调pH至8.0后，用蒸馏水定容至100ml，高压灭菌，分装保存。

(10)0.5MEDTA(pH8.0):称取18.61gEDTA，溶于80ml蒸馏水中，用NaOH

调pH至8.0后，用蒸馏水定容至100ml，高压灭菌，分装保存。

(11)TEbuffer：取1MTris-HCl(pH8.0)5ml，0.5MEDTA(pH8.0)1ml，

用蒸馏水定容至500ml，调pH至8.0后，高压灭菌，分装保存。

(12)10%SDS：称取10gSDS，溶于90ml蒸馏水中，68℃加热溶解，用盐

酸调pH至7.2，定容至100ml。

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(13)低严谨度洗膜液：将20X的SSC用蒸馏水稀释成2XSSC，并按照

100:1(2XSSC:10%SDS)加入10%SDS，配成2XSSC0.1%SDS。

(14)高严谨度洗膜液：将20X的SSC用蒸馏水稀释成0.5XSSC，并按照

100:1(0.5XSSC:10%SDS)加入10%SDS，配成0.5XSSC0.1%SDS。

(15)BlockingSolution:用Maleicacidbuffer将6#中的10XBlocking

Solution稀释成1X的工作液，现配现用。

(16)AntibodySolution:将4#试剂离心，按照1:5000加入Blocking

Solution，2-8℃可保存12小时，即每5mlBlockingSolution中加1ulAb

抗体，与地高辛标记探针结合。

(17)Colorsubstratesolution(显色液)：将5#试剂按照1:50用Detection

buffer稀释，即从5#中取100ul加入5mlDetectionbuffer，要避光，现

配现用，用于显示抗体结合位点。

(18)杂交液DiGEasyHyb：将64ml无菌去离子水分两部分倒入试剂7#瓶，

37ºC摇动溶解5min。

三、基因组DNA的提取、酶切与电泳分离

(1)酶切反应体系

DNA1μg/μl15μg

10×酶切buffer5μl

限制性切酶（10U/μl）6μl

加ddH2O至50μl

(2)混匀后于37ºC酶切1-3h，酶切完成后，取3μl酶切反应物电泳分析，

检测酶切效果

(3)酶切完成后，加入EDTA，65℃加热灭活限制酶,样品即可直接进行电泳分

离，必要时可进行乙醇沉淀，浓缩DNA样品后再进行电泳分离。

四、琼脂糖凝胶电泳

(1)用0.5×TBE配制0.8%的琼脂糖凝胶，凝胶厚度约为0.5cm。

(2)待凝胶充分凝固后，在点样孔中依次加入：阳性对照：质粒酶切产物，阴

性对照：水及检测样品。

(3)加入电泳缓冲液至刚好与胶面持平，加100V电压，电泳5min待溴酚蓝

进入胶中后，将电压降至80V电泳30min，

(4)电泳结束后，染色，长波紫外线下观察电泳结果，用1保鲜膜覆盖在凝胶

上，复制下各分子量参照物及各DNA样品带的位置，在凝胶旁置1标尺照像

五、变性与转膜

(1)将胶浸于4倍体积的变性溶液中，在摇床上温和摇动2×15min，变性

液要能没过胶。

(2)将胶在双蒸水中稍微洗涤，然后放入4倍体积的中和溶液中，在摇床上温

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和摇动2×15min，中和液要能没过胶。

(3)转膜：20×SSC浸湿一whatman3mm滤纸放在支撑平台上，此平台要比凝

胶稍大，形成一个“桥”，凝胶反放在浸湿的whatman3mm滤纸上注意两者之

间不能有气泡。

(4)照凝胶的大小剪一硝酸纤维素滤膜/尼龙膜（长，宽略大0.2cm，剪去与凝

胶对应的一角）。膜放在凝胶上。

(5)尼龙膜上放一whatman3mm滤纸（长，宽略小0.2cm）一叠吸水纸、上置一

玻璃板，其上放一重约0.2～0.5kg的物品。在20×SCC的转移缓冲液中充分转

移18～24h及时换掉浸湿的吸水纸。

(6)固定：将膜在2×SSC溶液中短暂漂洗，除去过多的盐分，然后DNA结

合面朝上，放在一干净的滤纸上晾干后，夹在两层滤纸中间，120ºC烘箱中30

min，或者80ºC2h，促进DNA与硝酸纤维素滤膜/尼龙膜结合。

六、预杂交与杂交

(1)预杂交DiGEasyHyb：将64ml无菌去离子水分两部分倒入试剂7#瓶，37

ºC摇动溶解5min，预热一定体积的DiGEasyHyb（10ml/100cm2膜）至杂交温

度42ºC。预杂交60min，在不加探针的情况下，仅将膜放在杂交液中42ºC

下充分润湿。（此过程可以延长至数小时）

(2)探针变性：Dig标记的探针1ul（约25ng/ml）加40µlH

2

O,95ºC变性

10min后迅速放在冰上冷却10min。

(3)杂交：将变性的探针加入预热的DIGEasyHyb（3.5ml/100cm2）中，混匀，

避免泡沫，倒出预杂交液，加入探针和DIGEasyHyb混合液，继续在42ºC

下温浴过夜（单拷贝探针）。

含有探针的DiGEasyHyb杂交液可重复利用，杂交结束后放入离心管中于-20

ºC保存，可重复使用几次，只需在使用前于68ºC处理10min即可,不要煮

沸DiGEasyHyb杂交液

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七、洗膜与显色

(1)洗膜：2×SSC，0.1%SDS室温下洗涤5分钟，洗2次。

0.5×SSC，0.1%SDS65-68ºC温和振荡15分钟，洗2次

(2)免疫与显色：

a.杂交和洗膜后，用马来酸缓冲液（WashingBuffer，Buffer1）浸泡1-5min

b.在100ml1×Blocksolution（Buffer2）中温育30min

c.用1×Blocksolution（Buffer2）稀释抗体–DIG-抗原偶联物至150mU/ml

（1:5000）

d.用10mlantibodysolution处理膜30min

e.用100ml马来酸洗膜15min，洗2次

f.在20mldetectionbuffer（Buffer3）中平衡2-5min

g.在8ml新鲜配制的colorsubstratesolution中处理膜5分钟，放在塑

料袋或盒中，保持黑暗中。注意不要在显色过程中摇动(颜色沉淀在几分钟开

始出现，在16h完成显色反应(在显色过程中膜可在光亮处短暂暴露几次)。

h.5h后斑点出现，可在20ml水中洗膜5min中止反应。

i.结果照像

注意事项

1.膜的大小及预杂交、杂交过程中所用试剂的量可根据需要进行适当调整。

2．将凝胶中和至中性时，要测pH，防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维素膜。

3.要注意赶走凝胶和滤纸及硝酸纤维素膜/尼龙膜之间的气泡。

思考题

1．什么是印迹技术？

2．说明什么是探针？

3．简述Southernblot技术的原理及应用。