谷氨酰胺合成酶

谷氨酰胺合成酶活性的测定

一．试剂

（1）酶提取缓冲液（0.05mol/LTris-HCl，pH8.0；内含2mmol/L

Mg2+、2mmol/LDTT、0.4mol/L蔗糖）

称取Tris[三（羟甲基）氨基甲烷]1.5295g，MgSO4·7H2O0.1245g，

DTT（二硫苏糖醇）0.1543g和蔗糖34.23g，去离子水溶解后，用

0.5~1.0mol/LHCl调至pH8.0，最后定容至250mL。

（2）酶反应液

1.对照反应液A（0.1mol/LTris-HCl缓冲液，pH7.4；内含80mmol/L

Mg2+、20mmol/L谷氨酸钠盐、20mmol/L半胱氨酸和2mmol/LEDTA-Na2）

称取1.2236gTris、1.9918gMgSO4·7H2O、0.3451g谷氨酸钠盐、

0.2422g半胱氨酸、0.0744gEDTA-Na2，分别用去离子水浴解后，

用0.5~1.0mol/LHCl调至pH7.4，定容至100mL。

2.完全反应液B（含盐酸羟胺、pH7.4的0.1mol/LTris-HCl缓冲

液）

除了反应混合液A的成分外，再添加80mmol/L盐酸羟胺（每100mL

中含0.5560g盐酸羟胺）。

（3）显色剂（0.2mol/LTCA、0.37mol/LFeCl3和0.6mol/LHCl混

合液）

称取3.3176gTCA（三氯乙酸）和10.1021gFeCl3·6H20，用去离

子水溶解后，加5mL浓盐酸，定容至100mL。

（4）40mmol/LATP溶液

称取0.2420gATP溶于10mL去离子水中（临用前配制）。

二．实验步骤

（1）粗酶液的提取

取10mL藻液，在4500r/min离心15分钟，去掉上清液，加5mL酶提

取液，超声波破碎10min，4℃,12000g离心20min,上清液即为粗酶

提取液

（2）GS活性的测定

取1.0mL完全反应液B于10mL离心管中，加入0.5mL粗酶液和0.5mL

ATP溶液，混匀，于37℃下保温0.5h，加入1mL显色剂终止反应，

摇匀，室温下放置5min后，于3500r/min下离心10min，取上清液

于540nm下测定吸光度，以加入1.0mL对照反应液A的为对照。

三．结果处理及计算

GS活性[A540/(g·h）]=

A540为540nm处的吸光度；

m为样品质量（g）；

Vt为粗酶液总体积（mL）；

Vs为反应体系中加入的粗酶液体积（mL）；

t为反应时间（h）。