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山东医药2019年第59卷第28期

ENPP2对管内皮细胞增殖和迁移的

影响及机制

婷1，苏晓灵1，刘1，

年蔚1，李卫1，魏晓娟1,2

(1青海省人民医院，西宁810001；2深圳市龙华区中心医院•广东医科大学附属龙华中心医院)

摘要：目的探讨焦磷酸酶/磷酸二酯酶2(ENPP2)对血管内皮细胞(HUVEC)增殖和迁移的影响及机制。方

法将HUVEC细胞随机分为2组、组,分别感染过表达病毒2和对照病毒,采

用qRT-PCR法检测HUVEC细胞LPA受体(

LPAR1-LPAR6)、ENPP2表达,CCK-8法检测HUVEC细胞的增殖能

力,Transwell法检测HUVEC细胞的迁移能力丄PA试剂盒检测HUVEC细胞LPA水平,Westernblotting法检测EN-

PP2表达及AKT信号通路的磷酸化水平;之后将HUVEC细胞随机分为LPAR1拮抗剂Ki16198组和对照组,CCK-8

法和Transwell法分别检测Ki16198干预前后HUVEC细胞增殖和迁移能力，Westernblotting法检测Ki16198干预前

后HUVEC细胞AKT信号通路的磷酸化水平。结果2组ENPP2mRNA,蛋白相对表达量分别为0.186士

0.004,1.261

±0.080,组分别为0.002±0.000,0.532±0.031，两组比较P<0.05

；2组HUVEC细

胞增殖倍数、迁移能力及HUVEC细胞上清中LPA水平均高于Ad.

Null组(P均<0.05);HUVEC细胞中LPAR1-

LPAR6的相对表达量分别为0.377士0.011,0.004士0.002,0.002士0.001,0.000士0.000,0.000士0.000,0.007士

0.001,其中LPAR1表达最高;与组相比,2组AKT表达升高(P

<0.05)Ki16198干预后HUVEC

细胞的倍数与对照组统(P>0.05),但HUVEC的低(P<0.05)；与

对照组相比,Ki16198干预后HUVEC细胞AKT表达下降(P<0.05)

。

结论ENPP2可促进HUVEC细胞的增殖与

，其机制可能通过激活AKT实现。

关键词:血管内皮功能障碍;血管内皮；焦磷酸酶/磷酸二酯酶2;细胞增殖；

doi：10.3969/.

1002-266X.2019.28.011

中图分类号:R54文献标志码:A文章编号；1002-266X(2019)28-0044-04

EffectsofENPP2onproliferationandmigrationofvascularendothelialcells

BA/Yuting1,SUXiaoZing,

£/U

Yanmin,NZ4NWei,£/Wei,XiaRuan,

CH4NGRong

(1QinghaiProvinciaZPeopZe'sHospitaZ,Xining810001,China)

Abstract:ObjectiveTodetecttheeffectandmechanismofectonucleotidepyrophosphata/phosphodiestera2(EN-

PP2)onproliferationandmigrationin

vascularendothelialcells(HUVEC).MethodsHUVECwererandomlydividedin­

oup,respectively,whichwereinfectedwithoverexpressingvirus

2and

con

­

.

TheexpressionofENPP2was

evaluated

byqRT-PCRandWestern

oliferationwasas

­

sdbyCCK-8assayandcellmigrationwasperformedbytranswellchambersafteradenovirus-mediatedENPP2genetrans­

trationoflysophosphatidicacid(LPA)insupernatantof

2orcontrol

vectorwasdetermined

by

ression

ofLPAreceptors(LPAR1〜LPAR6)res­

sionofP-AKT/AKTwas

determinedbyWestern

hat,HUVECwererandomlydivided

intotheki16198group

andcontrolgroup,andthecellproliferationandcellmigrationwereassdby

s

TheENPP2mRNAandproteinwas0.186±0.004and1.261±0.080,respectively,2groupversus

0.002±0.000and0.532±0.031,respectively,oup(bothP<0.05).Themigration,proliferation,and

2group

were

significantlyhigher

thantho

oup(allP<0.05).Theexpressionof

LPAR1-LPAR6inthe

HUVECwas0.377±0.011,

0.0^±0.002,0.002

±

0.001,0.000±0.000,0.000±0.000,and

0.007±0.001,withthehighestreceptorofLPAR1；oup,AKTexpressionincreadintheAd.

ENPP2group(P<0.05);nosignificantdifferencewasfoundintheproliferationratio

ofHUVECafterKi16198intervention

通信作者:常荣(E-mail:qhschangrong@)

44

山东医药2019年第59卷第28期

ascomparedwiththatofthecontrolgroup(P>0.05/,butthemigration

ability

of

HUVECdecreadsignificantly(P<

0.05).Comparedwiththecontrolgroup,AKTexpressiondecreadafterKi16198interventionintheHUVEC(P<0.05).

ConclusionENPP2/LPAcouldenhancethemigrationofHUVECthrough

activating

AKTsignalpathway.

Keywords:vascular

endothelialdysfunction；vascular

endothelialcellctonucleotide

pyrophosphata/phosphodies-

tera

2；cell

proliferation；cellmigration

血管内皮细胞(HUVEC)分布于整个循环系统

中,将血管壁与循环血液分离,在几乎所有的基本血

管功能中发挥重要作用［1］。血管内皮不仅提供了

一种非黏附性、高选择性的物理屏障来控制血管通

透性，还释放出大量的血管活性物质来调节血管收

缩和血管壁的重塑⑵。研究表明，血管内皮功能障

碍是动脉粥样硬化和心血管疾病的早期特征［

］，保

护血管内皮功能可预防心血管疾病的发生⑷。溶

血磷脂酸(LPA)是一种具有广泛生物活性的溶血磷

脂，可引起调节细胞的增殖、迁移、存活等的多种生

长因子样反应⑸。焦磷酸酶/磷酸二酯酶2

(ENPP2)是分泌LPA的一种重要的酶。有研究表

明ENPP2/LPA轴参与血管生成、炎症反应、神经发

育等多种病理生理过程［,］。2018年8月，我们以

HUVEC为研究对象，进一步研究ENPP2/LPA轴对

HUVEC增殖和迁移的影响及其可能机制。

1材料与方法

1.1实验材料HUVEC、过表达腺病毒2

和对照病毒受赠予军事科学院医学研究院放射与辐

射医学研究所实验血液学实验室。胎牛血清购自杭

州四季青生物工程材料有限公司。RPMI1640细胞

培养基购自美国Gibico公司。兔抗人AKT抗体、兔

抗人磷酸化AKT(p-AKT)抗体、GAPDH抗体均购自

CellSignaling

Technology。兔人ENPP2体

购自美国Abcam公司。ECL发光液购自北京庄盟

生物科技有限公司。HRP标记的山羊抗兔抗体购

自北京中杉金桥生物技术有限公司。SBYR荧光定

量PCR试剂盒、反转录试剂盒购自日本TaKaRa公

司。TaqManGeneExpressionMasterMix购自美国

ABI公司。TRIzolReagent美国Invitrogen公司。

BCA蛋白定量检测试剂盒购自美国Thermo公司。

蛋白Marker购自中国Genstar公司。Transwell小室

购自美国Corning公司。4%多聚甲醛、RIPA购自北

京Solarbio公司。CCK-8试剂盒购自日本Dojindo

。LPA测剂技

公司。结晶紫购自美国Cyagen公司。

1.2过表达腺病毒2感染HUVEC细胞

HUVEC细胞计数后制成2x105/mL的细胞悬

液，以1mL/孔铺入6孔板中过夜，次日更换培养基

后随机分为2组、组，分别感染腺

病毒2、,感染剂量为20MOI,6~8

h后根据细胞状态给予补液男7七5%CO2培养箱

培养24h，通过qRT-PCR法、Westernblotting法检测

感染效率较高。

1.3HUVEC细胞LPA受体、ENPP2表达检测采

用qRT-PCR法。分别收集HUVEC细胞和感染了腺

病毒2、的HUVEC细胞3x105/

mL,弃去培养基

，用PBS清洗1或2次，加入1mL

TRIzol,室温静置5min,取上清至1.5mLEP管，加

入氯仿200^L,振荡15s,室温静置5min男七、

12000r/min离心15min,吸取上层无色水相至新

的EP管男□入异丙醇500^L,轻轻混匀液体，室温

静置10min,4°C、12000r/min离心10min,弃上

清,EP管中加入75%乙醇1mL,轻微洗涤沉淀,

4C、7500r/min离心5min,弃上清，真空干燥10

min,加入20灭菌水溶解沉淀，分光光度计检测

RNA浓度。

逆转录反应体系：5qRTMix4皿总RNA2

Mg,水补足至20^L。反应条件:以上液体混匀后短

暂离心,25C、10min,42°C、30min,85C、5min男

C。qRT-PCR反应体系：水3.3咽男SYBRPreMix

5p,L,Primer

1»L,cDNA0.5»L,ROXH0.2»L。

将以上混合液加入96孔板中，每个样品3个副孔,

瞬时离心后上机,PCR扩增程序：

95C30s(预变

性)；95C5s、6C30s男0个循环(PCR阶段)。

1.4ENPP2与LPAR1拮抗剂Ki16198干预HU-

VEC后酸化AKT测采用Westernblot-

ting法。2组、组分别收集感染了

腺病毒2、的HUVEC细胞3x

105/mL,加入细胞裂解液(RIPA60~100mL)，充分

裂解细胞，加入1%PMSF,-80C反复冻融(39

C)细胞3次后4C、12

000r/min离心30min,收

集上清。BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，取10

~20咲蛋白进行电泳，然后电转至PVDF膜男0g/

L脱脂奶粉室温封闭2h,分别加GAPDH抗体、EN-

PP2抗体、AKT抗体、p-AKT抗体，室温慢摇1h或4

C过夜。TBST漂洗3次，每次10min,加入含有

HRP标记的二抗TBST5mL(1：5000/,室温孵育45

45

山东医药2019年第59卷第28期

min~1h,TBST漂洗3次，每次10min,ECL发光液

1：1配好后曝光，使用ImageJ软件进行吸光度分

析。2组、组加入LPAR1拮抗剂

Ki16198干预HUVEC细胞，再次检测AKT水平。

1.5细胞增殖检测采用CCK-8法。2

组、组HUVEC细胞感染上述病毒后若效率

超过85%，用胰酶消化细胞后计数，制成5x103/mL

的细胞悬液，以100^L/孔铺入96孔板中，分别在

24、48、72h后每孔加入CCK-810^L,避光孵育2h

后使用全波长酶标仪读取450nm波长处光密度

(OD)值以检测ENPP2对H9c2细胞增殖的影响。

为研究ENPP2调控HUVEC细胞增殖的可能机制，

予HUVEC细胞LPAR1拮抗剂Ki16198后再次检测

HUVEC。

1.6细胞迁移检测采用Transwell实验。HUVEC

细胞计数后制成2X104/mL的细胞悬液加至Tran-

swell

chamber,用的RPMI1640

液补足至200mL,下室加入含10%FBS的RP-

MI1640

800咽男7C5%CO2培养箱培养10h。取

出chamber,用移液抢吸干上室液体,PBS800清

洗3次,4%多聚甲醛800固定30min。吸干上

室多聚甲醛男00mLPBS清洗3次,结晶紫800mL

染色20~30min,吸干上室结晶紫,800mL

PBS清

洗3次,湿棉签轻轻擦拭上室，显微镜取9个视野拍

照后计数。为研究ENPP2调控HUVEC细胞迁移的

可能机制，予HUVEC细胞LPAR1拮抗剂Ki16198

后次测HUVEC。

1.7LPA水平检测HUVEC细胞感染-

PP2、病毒后取细胞培养上清，按LPA检测

试剂盒说明书加入检测液，用全波长酶标仪于450

nm波长处测量OD值。根据标准品的浓度及测得

的OD值计算标准曲线的直线回归方程男艮据测得

的样品OD值在直线回归方程上计算相应浓度。

1.8统计学方法采用SPSS17.0统计软件。计量

数据用x±s表示,多组数据比较采用单因素方差分

析，两组数据比较采用t检验。P<0.05为差异有

统。

2结果

2.1HUVEC细胞中LPA受体表达HUVEC细胞

中LPAR1~LPAR6的相对表达量分别为0.377±

0.011,0.004±0.002、0.002±0.001,0.000±

0.000,0.000±0.000,0.007±0.001,HUVEC细胞

中LPAR1表达最高，其次为LPAR6、LPAR2、

LPAR3、LPAR5、LPAR4。

2.2HUVEC病毒后ENPP2表达Ad.

46

ENPP2组、组ENPP2mRNA相对表达量分

别为0.186±0.004、0.002±0.000,ENPP2蛋白相

对表达量分别为1.261±0.080,0.532±0.031，两

组HUVEC的ENPP2mRNA、白对表达

量比较,P均<0.05。

2.3ENPP2、Ki16198对HUVECAKT

路的影响HUVEC细胞过表达ENPP2后,Ad.

EN-

PP2组、组AKT相对表达量分别为0.539±

0.008,0.107±0.004，两组比较差异有统计学意义

(P<0.05)oHUVEC细胞给予Ki16198后，-

PP2组、组AKT相对表达量分别为0.882±

0.062、1.154±0.074，两组比较差异有统计学意义

(P<0.05)o

2.4过表达ENPP2对HUVEC细胞增殖的影响

2组在24,48、72h时HUVEC细胞的增殖

倍数分别为2.355±0.018,4.365±0.096,4.980±

0.111,组分别为1.

983±

0.050,4.017

±

0.077,4.728±0.059。与组相比，-

PP2组过表达ENPP2后HUVEC细胞于24、48和72

h增殖倍数增加(P均<0.05)。

2.5过表达ENPP2对HUVEC细胞迁移的影响

2组、组数分别为

(569.333±70.465)、(401.000±62.610、个/HP,与

组,2组HUVEC

力增加(P<0.05)o

2.6LPAR1拮抗剂Ki16198对HUVEC细胞增殖

的影响HUVEC细胞给予Ki16198后，2

组在24、48、72h时HUVEC细胞的增殖倍数分别为

2.416±0.010,4.351±0.233,4.994±0.208,Ad.

Null组分别为2.355±0.018,4.219±0.116,4.980

±0.111，两组24、48、72h时HUVEC细胞的增殖倍

数比较差异无统计学意义(P均>0.05)o

2.7LPAR1拮抗剂Ki16198对HUVEC细胞迁移

的影响HUVEC细胞给予Ki16198后，2

组细胞迁移个数分别为(314.333±21.733)、

(423.667±27.683)个/HP，两组比较差异有统计学

意义(P<0.05)o

2.8表达ENPP2对HUVEC

LPA水平的影响2组、组细胞培

养上清中LPA水平分别为(612.267±69.940)、

(476.184±

15.995/nmoL/L,两组比较差异有统计

学意义(P<0.05)o

3讨论

新生血管是局部组织再生及修复的最主要因

素,血管内皮细胞的增殖、分化、迁移以及汇聚是组

山东医药2019年第59卷第28期

织新生血管化的重要步骤，而其功能的障碍贯穿冠

状动脉粥样硬化性心脏病及心血管事件的整个过

程⑻。内皮功能障碍是动脉粥样硬化的一个重要

特征,包括细胞增殖缺陷和异常凋亡,其中内皮细胞

的增殖能力通过修复血管内皮来应对损伤是维持内

皮细胞壁完整性所必需的⑼o

ENPP2是维持LPA水平的主要酶ENPP2/LPA

信号通路的异常与心血管疾病密切相关。为研究

ENPP2/LPA轴在HUVEC细胞中的调控作用，我们

首先研究了ENPP2对HUVEC细胞增殖和迁移的影

响

。结果显示，过表达ENPP2可以促进HUVEC细

胞的增殖和迁移。提示ENPP2在新生血管化中发

挥重要作用。

LPA是一种小的、普遍存在的磷脂，通过结合并

激活G蛋白偶联受体（LPAR1〜6）而发挥细胞外信

号分子作用,具有神经发生、血管生成、促进细胞迁

移、存活及致癌作用［10］o其中LPAR1、LPAR3〜5

广泛分布于心血管组织中。Shlyonsky等［11］研究显

示，在慢性低氧诱导的肺动脉高压模型中，大鼠肺组

织和血清中LPA水平明显升高，低氧组动物的血清

对大鼠原发性肺成纤维细胞具有明显的趋化作用，

LPAR1和LPAR3的拮抗剂可阻止细胞迁移,LPA可

以促进血管生成,有助于肺血管的重塑。为了进一

步研究ENPP2促进HUVEC细胞增殖和迁移的可能

作用机制，我们检测了HUVEC细胞中LPA受体表

达及细胞培养上清中LPA浓度。结果显示,HUVEC

细胞可表达LPAR1~6，主要表达LPAR1、LPAR6、

LPAR2o进一步研究，结果显示，过表达ENPP2可

以促进HUVEC细胞LPA浓度的升高，提示ENPP2

可促进LPALPA受体结合进一步

促进HUVEC细胞的增殖和迁移。LPAR1主要通过

活化MAPK、PI3K/AKT、Rho等途径发挥作用，介导

细胞的增殖、存活和迁移［13

］o另外，有研究表明,

ENPP2/LPA轴可通过调控AKT信号通路促进

H9c2细胞的增殖和迁移［14］oHwang等［14〕认为，

LPA通过激活LPA1/3受体,刺激血管内皮细胞增

殖、迁移、丝裂原活化蛋白激酶磷酸化、Rh。

和Ca2+

活化，发挥血管生成效应。本研究结果显示,过表达

ENPP2可以上调HUVEC细胞p-AKT活性，提示

AKT信号通路参与ENPP2调控的HUVEC细胞的

增殖和迁移。Ki16198是LPA受体拮抗剂，可同时

拮抗LPAR1和LPAR3，本研究发现，与对照组相比,

Ki16198对HUVEC细胞的增殖没有影响，但能抑制

HUVEC的,,测HUVEC

细胞给予Ki16198后AKT信号通路表达的情况，结

果显示，Ki16198可以下调HUVEC细胞p-AKT表

达，提示Ki16198可能通过拮抗LPAR1进而调控

AKT影响HUVEC的。

综上所述，ENPP2/LPA轴可能通过调节AKT

调控HUVEC的和，LPA受

体拮抗剂Ki16198可能通过抑制LPAR1进而抑制

AKT而调控HUVEC的。

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(收稿日期：2019-06-02)

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