erma

南京某医院成人耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检出情况及耐药基

因分析

张利;孙林春

【摘要】ObjectiveToinvestigatethedeterminationanddrugresistance

geneofmethicillin-resistantStaphylococcusaureus(MRSA)isolatedfrom

adultsinJiangsuProvinceHospitalonIntegrationofChineandWestern

Medicinefrom2011to2017,andtoprovideareferenceforclinicalrational

sAccordingtotheClinicalandLaboratoryStandards

Institute(CLSI)guidelines,gsusceptibility

β-lactamresistancegene

mecA,aminoglycosidemodifyingenzymegenesaac(6′)/aph(2″)andaph

(3)-Ⅲ,macrolide23srRNAmethylageneermA/C,tetracycline-like

ribosomalprotectiveproteingenetetM/K,quinoloneresistancegene

qnrA/BanddisinfectantresistancegeneqacA/Bweredeterminedby

polymerachainreaction(PCR).ResultsThedeterminationrateofMRSA

was31.95％,andtheisolatesofMRSAweremainlyisolatedfromsputum

3departmentswererespiratory

department,asno

MRSAisolatebeingresistanttovancomycin,linezolidandtigecycline.

Therewere0.49％g

resistanceratestocotrimoxazole,rifampicin,cipro?oxacin,tetracycline,

gentamicin,clindamycinanderythromycinwere11.18％,11.57％,21.47％,

63.63％,44.31％,59.41％and62.35％,erminationrate

ofmecAwas100％.Thedeterminationratesofaac(6′)/aph(2″),aph(3)-

Ⅲ,ermA/C,tetM/K,qnrA/BandqacA/Bwere36.67％,27.94％,68.43％,

57.35％,23.63％and52.45％,sionsFrom2011to2017,

susceptibilitytest'sresultscanbeudreferenceforclinicalmedication.%

目的了解江苏省中西医结合医院2011—2017年成人耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

(MRSA)临床分离株的检出情况及其耐药基因,为临床合理用药提供参考依据.方法

采用美国临床实验室标准化协会(CLSI)推荐方法鉴定MRSA.采用纸片扩散法对

MRSA菌株进行药物敏感性试验.采用聚合酶链反应(PCR)检测β-内酰胺类耐药基

因mecA,氨基糖苷修饰酶基因aac(6′)/aph(2″)、aph(3)-Ⅲ,大环内酯类23srRNA

甲基化酶基因ermA/C,四环素类核糖体保护蛋白基因tetM/K,喹诺酮类耐药基因

qnrA/B和耐消毒剂基因qacA/B.结果MRSA的总检出率为31.95％,主要分离自

痰液和创口分泌物样本;检出率居前3位的科室依次为呼吸科、外科和重症监护病

房.未检出对万古霉素、利奈唑胺和替加环素耐药的MRSA菌株;仅有0.49％的

MRSA对奎奴普汀耐药,对复方磺胺甲噁唑、利福平、环丙沙星、四环素、庆大霉

素、克林霉素、红霉素的耐药率分别为11.18％、11.57％、21.47％、63.63％、

44.31％、59.41％、62.35％.多重耐药基因mecA阳性率为

100％,aac(6′)/aph(2″)、aph(3)-Ⅲ、ermA/C、tetM/K、qnrA/B、qacA/B基因

检出率分别为36.67％、27.94％、68.43％、57.35％、23.63％和52.45％.结论

2011—2017年江苏省中西医结合医院成人MRSA多重耐药基因检出率高.MRSA

对多种抗菌药物都不同程度耐药,临床应以药物敏感性试验结果为合理用药的最主

要依据.

【期刊名称】《检验医学》

【年(卷),期】2019(034)003

【总页数】6页(P215-220)

【关键词】耐甲氧西林金黄色葡萄球菌;多重耐药;基因

【作者】张利;孙林春

【作者单位】江苏省中西医结合医院检验科,江苏南京210009;南京医科大学附属

儿童医院儿科研究所,江苏南京210008

【正文语种】中文

【中图分类】R446.62

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，SA）是临床最常见的革兰阳性球菌，

可引起重症肺炎、复杂性皮肤及软组织感染、心包炎、伪膜性肠炎或败血症等[1]。

目前，SA对抗菌药物的耐药情况日益严重，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

（methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA），已成为高致死率的

主要病原菌之一[2]。有研究结果表明，MRSA不但对甲氧西林耐药，还对氨基糖

苷类、大环内酯类、四环素类、氟喹喏酮类或磺胺类抗菌药物不同程度耐药，使临

床抗感染治疗面临极大挑战[3]。本研究对分离自不同类型临床样本的1020株

MRSA耐药基因携带情况进行分析，以期为临床合理使用抗菌药物提供参考依据。

1材料和方法

1.1菌株来源

收集2011年1月—2017年12月江苏省中西医结合医院门诊及住院患者送检的

20932例各类临床样本，共分离出3192株SA非重复株，其中1020株经鉴定

为MRSA。质控菌株SA（ATCC25923）、SA（ATCC29213）购自中国科学院

微生物研究所。

1.2仪器与试剂

Bact/Alert血培养仪、YBJSZ42全自动微生物鉴定系统（法国生物梅里埃公司），

7300定量PCR仪（美国ABI公司），GelDocXR凝胶成像仪（美国Bio-Rad公

司），2%NaClM-H琼脂平板（法国生物梅里埃公司），聚合酶链反应

（polymerachainreaction，PCR）引物由华大基因公司设计并合成，Trizol

RNA提取试剂和SuperScriptVILOcDNA合成试剂盒（美国Invitrogen公司），

LightCyclerFastStartDNAMasterSYBRGreenI（瑞士Roche公司）。

1.3MRSA鉴定

根据美国临床实验室标准化协会（theClinicalandLaboratoryStandards

Institute，CLSI）M100-S20文件要求[4]，将0.5麦氏单位SA均匀涂布于2%

NaClM-H琼脂平板，分别贴上头孢西丁和苯唑西林纸片，35℃培养24h后测

量抑菌圈直径。苯唑西林最小抑菌浓度（minimuminhibitoryconcentration，

MIC）≥4mg/L或头孢西丁MIC≥8mg/L判定为MRSA。

1.4体外药物敏感性试验

采用纸片扩散法对MRSA菌株进行体外药物敏感性试验。药物敏感性试验纸片

（万古霉素、利奈唑胺、替加环素、奎奴普汀、利福平、克林霉素、红霉素、苯唑

西林、青霉素、环丙沙星、庆大霉素、四环素、头孢唑林、头孢西丁、复方磺胺甲

噁唑）购自英国Oxiod公司。

1.5DNA模板制备

分离、纯化菌株，挑取2～3个新鲜菌落放入200μL无菌双蒸水中制成细菌悬液，

100℃煮沸10min后冰上冷却，10000×g离心10min，上清液即为细菌

DNA模板。

1.6多重耐药基因检测

参照文献[5-6]设计PCR引物，引物序列见表1。PCR反应体系:稀释后的DNA模

板2μL，2×powerSYBRGreenMasterMix10μL，上、下游引物各1μL，加

蒸馏水至总体积为20μL。PCR扩增条件:94℃预变性5min；94℃40s，60℃

1min，72℃60s，40个循环；72℃10min。反应产物送上海英骏生物技术有

限公司测序。

表1耐药基因PCR引物序列基因名称引物序列（5'～3'）长度（bp）mecA上

游:AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC；下游:AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC

533aac（6′）/aph（2″）上游:CCAAGAGCAATAAGGGCATA；下

游:CACTATCATAACCACTACCG220Aph（3）-Ⅲ上

游:GCCGATGTGGATTGCGAAAA；下游:GCTTGATCCCCAGTAAGTCA292

ermA/C上游:GTTCAAGAACAATCACAGAG；下

游:GGATCAGGAAAAGGACATTTTAC533tetM/K上

游:GTGTGACGAACTTTACCGAA；下游:GCTTTCTATCTCCAAGAACAC501

qacA/B上游:GGTTGTGGAAGAACTTTCTCCTT；下

游:CCAATTCCGGAAGGTAACAC416qnrA/B上

游:ATTTCTCACGCCAGGATTTG；下游:GATCGGCAAAGGTTAGGTCA515

1.7统计学方法

采用SPSS17.0软件进行统计分析，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有

统计学意义。

2结果

2.12011—2017年MRSA检出情况

2014年MRSA检出率最高（35.40%），以后稍有降低。2012、2013年MRSA

检出率与2011年比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；2014、2015、2016、

2017年MRSA检出率均显著高于2011年（P＜0.05）。见表2。

表22011—2017年MRSA的检出情况注:与2011年比较，*P＜0.05年份SA

（株）MRSA（株）MRSA检出率（%）2.722012431111

25.752.692.40*2.88*2016

48616433.74*2.40*

2.2MRSA临床样本类型分布

1020株MRSA主要分离自痰液、创口分泌物、血液、穿刺液、前列腺液、引流

物和胸腹腔积液样本，各类临床样本中MRSA检出率有差异，以痰液样本最高

（48.80%）。见表3。

2.3MRSA科室分布

MRSA在不同科室的检出率不同，检出率居前3位的分别为呼吸科465例

（45.58%）、外科293例（28.73%）、重症监护病房118例（11.57%），以下

依次为感染科57例（5.59%）、泌尿外科42例（4.12%）、老年科27例

（2.65%）、内分泌科21例（2.06%）、其他科室5例（0.49%）。

表3MRSA临床样本类型分布注:与总检出率比较，*P＜0.05、**P＜0.01样本类

型SA（株）MRSA（株）MRSA检出率（%）痰液124660848.80**创口分泌

物49618737.70*血液101215215.02**前列腺液1441711.81**穿刺液98

2727.55引流物651624.62胸腹腔积液131139.92**合计3192102031.95

2.4MRSA耐药情况

未检出对利奈唑胺、万古霉素、替加环素耐药MRSA菌株。1020株MRSA全部

对青霉素耐药。1020株MRSA中，1007株（98.73%）对苯唑西林耐药，1

019株（99.90%）对头孢西丁耐药，5株（0.49%）对奎奴普汀耐药，118株

（11.57%）对利福平耐药，114株（11.18%）对复方磺胺甲噁唑耐药，219株

（21.47%）对环丙沙星耐药，649株（63.63%）对四环素耐药，452株

（44.31%）对庆大霉素耐药，606株（59.41%）对克林霉素耐药，636株

（62.35%）对红霉素耐药；546株（53.53%）同时对2种抗菌药物耐药，337

株（33.04%）同时对3种或3种以上抗菌药物耐药。

2.5多重耐药基因检出率

1020株MRSAmecA基因阳性率为100%，见图1。分别检出aac（6′）/aph

（2″）、aph（3）-Ⅲ、ermA/C、tetM/K、qnrA/B、qacA/B基因阳性MRSA

374、285、698、585、241和535株，检出率依次为36.67%、27.94%、

68.43%、57.35%，23.63%和52.45%，见图2。

图1mecA基因电泳图

图2aac（6′）/aph（2″）、aph（3）-Ⅲ、ermA/C、tetM/K、qnrA/B、

qacA/B基因电泳图注:（a）aac（6′）/aph（2″）基因电泳图；（b）aph（3）-

Ⅲ基因电泳图；（c）ermA/C基因电泳图；（d）tetM/K基因电泳图；（e）

qnrA/B基因电泳图；（f）qacA/B基因电泳图

528株MRSA同时检出2种耐药基因，309株同时检出3种或3种以上耐药基因。

最常见的2种耐药基因组合形式为aac（6′）/aph（2″）+ermA，共检出301株，

占29.51%；最常见的3种耐药基因组合形式为aac（6′）/aph（2″）

+ermA+tetM，共检出168株，占16.47%，见表5。

表5多重耐药基因检出情况携带基因检出株数检出率（%）aac（6'）/aph（2''）

+ermA30129.51aac（6'）/aph（2''）+ermA+tetM16816.47aac（6'）

/aph（2''）+ermA+tetK787.65ermA+tetM373.63aac（6'）/aph（2''）

+ermA+tetM+tetK131.27

3讨论

MRSA的主要特征为获得了特异性耐药基因mecA而大量表达青霉素结合蛋白2a，

代替原来正常的青霉素结合蛋白2，使细菌与β-内酰胺类抗菌药物的结合力下降，

从而表现出对青霉素类、头孢类或碳青酶烯类等所有β-内酰胺类抗菌药物耐药。

MRSA还普遍表现出对氨基糖苷类、大环内酯类、喹诺酮类和四环素类抗菌药物

耐药，这给临床抗感染治疗带来极大困难[7]。目前，MRSA正在全球范围内快速

扩散流行，在亚洲、北美洲及南美洲部分地区的检出率高达50%[8]。有研究发现，

超过20%的MRSA患者在1年内会发生侵袭性感染[9]。此外，与非MRSA感染

患者相比，MRSA感染患者的住院时间更长、医疗费用更高、病死率更高。了解

医院MRSA的检出情况和耐药基因携带情况，有助于及时掌握MRSA的耐药特点，

合理选择抗菌药物。

2011—2017年江苏省中西医结合医院共检出3192株SA，其中1020株为

MRSA，MRSA检出率为31.95%，低于国外某些大型教学医院MRSA检出率＞

60%的报道，也低于我国一线城市大型综合医院MRSA检出率为50%～80%的报

道[10-11]。2011—2017年，江苏省中西医结合医院MRSA检出率总体呈上升趋

势，其中2014年检出率最高，之后3年逐渐稳定，甚至略有降低，可能与医院近

几年不断加强对MRSA的防控有关。

MRSA分布广泛，但近距离接触是MRSA的主要传播途径。本研究MRSA在痰液

和创口分泌物样本中检出率最高（48.80%和37.70%），说明MRSA以侵染呼吸

道和皮肤黏膜为主，这与LEGESE等[12]认为MRSA主要在机体的鼻腔、口咽、

下呼吸道处定植相符。从科室分布看，检出率居前3位的依次为呼吸科、外科和

重症监护病房，与MRSA在样本中的检出规律基本吻合。外科MRSA主要分离自

痰液和创口分泌物样本，患者皮肤和呼吸道黏膜多严重损伤，合并全身感染及吸入

性损伤；重症监护病房患者发生MRSA感染与患者年龄、病情严重程度、住院时

间、是否气管插管及是否使用呼吸机等有关。

定量PCR是判定MRSA的金标准，本研究结果显示，分离出的MRSAmecA基

因全部为阳性。但由于实验室环境、设备、经济等条件的限制，临床工作中

MRSA检测采用最多的是纸片扩散法。有研究证实纸片扩散法能用于检测各种

MRSA表型，特别是低水平耐药、异质性耐药的MRSA[13]。MILLER等[14]发现

PBP过表达可使表型对头孢西丁敏感的SA转为对头孢西丁耐药。本研究结果显示，

MRSA对苯唑西林的耐药率为98.73%，对头孢西丁的耐药率为99.90%，与文献

报道一致[15]。MRSA除了携带mecA基因外，还常同时携带其他耐药基因。

MRSA耐氨基糖苷类药物主要是由于获得了氨基糖苷类修饰酶（钝化酶）基因，

其中aac（6′）/aph（2″）基因编码6′位乙酰转移酶/2″位磷酸转移酶双功能酶，

aph（3）-Ⅲ基因编码3'位磷酸转移酶，能修饰卡那霉素、新霉素、链霉素和庆大

霉素等氨基糖苷类药物[16]；本研究中aac（6′）/aph（2″）和aph（3）-Ⅲ基

因检出率分别为36.67%和27.94%，MRSA对庆大霉素的耐药率为44.31%。

erm编码23SrRNA基因甲基化酶，使大环内酯类抗菌药物靶点甲基化，拮抗大

环内酯类药物如红霉素的作用，以ermA/C最为常见；本研究中ermA/C基因的

检出率为68.43%，MRSA对红霉素的耐药率为62.35%。四环素类耐药基因的作

用机制是表达核糖体保护蛋白，阻断四环素与细菌30S核糖体受体结合，或编码

四环素外排泵蛋白，促进四环素清除，以tetM/K作用最显著[16]；本研究中

tetM/K基因检出率为57.35%，MRSA对四环素的耐药率为63.63%。喹诺酮类

抗菌药物的作用靶点是DNA促旋酶和拓扑异构酶Ⅳ，喹诺酮嵌入断裂的DNA链

中间，形成DNA-拓扑异构酶-喹诺酮复合物，阻止DNA拓扑异构变化，抑制细

菌DNA复制转录，qnrA/B基因编码的蛋白能够逆转喹诺酮对DNA旋转酶的抑

制作用，增强由于靶基因突变、外排激活及膜空蛋白缺失引起的喹诺酮耐药[17]；

本研究中，qnrA/B基因检出率为23.63%，MRSA对环丙沙星的耐药率为

21.47%。本研究中，消毒剂耐药MRSA检出率较高，这与医院常规使用消毒剂有

一定关系，MRSA对消毒剂耐药机制为获得了化合物外排泵蛋白，该泵蛋白由

qac基因家族编码，促进细菌将季铵盐类、双胍类消毒剂外排，目前发现的该家族

成员有数十种，其中qacA、qacB容易被葡萄球菌属获得，qacA基因主要编码外

排泵蛋白，qacB基因则在耐重金属质粒中有表达[18]。MRSA对消毒剂耐药应引

起医院重视，在临床工作中应合理选择有效的消毒剂对环境、空气、医疗器械等进

行消毒，注意手卫生，防止耐药菌在院内扩散传播。

万古霉素和利奈唑胺是目前治疗MRSA的一线药物，其中万古霉素是MRSA治疗

的标准药物。但是随着多重耐药情况的日益严重，已经出现了一些对万古霉素中介

耐药、异质性耐药甚至耐药的MRSA[19-20]。万古霉素是治疗MRSA的最后一

道防线，一旦出现耐药，将造成无药可用的严重后果。虽然本研究未发现对万古霉

素和利奈唑胺耐药的MRSA，但医院必须重视，做好监测和防控工作，密切关注

耐药情况。本研究中，大部分耐药基因检出率和耐药表型之间一致性较好，如大环

内酯类耐药基因和耐药表型阳性率分别为68.43%和62.35%，喹诺酮类耐药基因

和耐药表型阳性率分别为23.63%和21.47%，四环素类耐药基因和耐药表型阳性

率分别为57.35%和63.63%。但氨基糖苷类耐药基因和耐药表型检出率分别为

64.61%和44.31%，存在较大差异，这可能是因为由基因到表型有着极其复杂的

调控机制，生物体的某一表型并不单纯由基因控制；另外，同一种药物大多存在不

同的耐药机制交叉作用，导致单纯检测某一耐药基因并不一定能真正反映细菌对某

种药物的耐药情况。临床上仍应重视药物敏感性试验，并以药物敏感性试验结果作

为临床合理用药的最主要参考依据。

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