m i a

中图分类号

：

Ｓ

８５２．６５９．２

文献标志码

：

Ａ

文章编号

：

１６７３

－

４６９６

（

２０１０

）

１１

－

１１５６

－

０５

表达猪圆环病毒

２

型

ＳＨ１

分离株

Ｃａ

ｐ

蛋白的

重组杆状病毒的构建与鉴定

李文良

，

王先炜

，

马

涛

，

李玉峰

，

姜

平＊

（

南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室

，

江苏南京

２１００９５

）

摘要

：

通过

ＰＣＲ

方法扩增完整的猪圆环病毒

２

型

（

ＰＣＶ２

）

ＯＲＦ２

基因

，

随后将其克隆到

Ｂａｃ

－

ｔｏ

－

Ｂａｃ

杆

状病毒表达系统

ｐ

ＦａｓｔＢａｃＴＭＨＴ

Ｂ

载体中

，

将筛选获得的阳性重组质粒

ｐ

Ｆ

－

Ｃａ

ｐ

转化至含有杆状病毒穿梭载

体的

ＤＨ１０Ｂａｃ

感受态大肠杆菌中

，

经蓝白菌落筛选和

ＰＣＲ

鉴定

，

获得重组表达载体

ｒＢａｃ

－

Ｃａ

ｐ

。

在脂质体介

导下转染处于对数生长期的

Ｓｆ９

昆虫细胞

，

获得重组杆状病毒

ｒＡｃ

－

Ｃａ

ｐ

。

Ｗｅｓｔｅｒｎ

－

ｂｌｏｔ

和间接免疫荧光试验

结果表明

，

成功构建了表达

ＰＣＶ２Ｃａ

ｐ

蛋白的重组杆状病毒

，

表达的蛋白具有良好的反应原性

，

这为进一步

研究

Ｃａ

ｐ

蛋白的功能及免疫学特性奠定了基础

。

关键词

：

猪圆环病毒

２

型

；

ＯＲＦ２

基因

；

杆状病毒表达系统

Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ

ａｎｄ

ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ

ｏｆ

ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ

ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ

ｅｘ

ｐ

ｒｅｓｓｉｎ

ｇ

Ｃａ

ｐ

ｐ

ｒｏｔｅｉｎ

ｏｆ

ｐ

ｏｒｃｉｎｅ

ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ

ｔ

ｙｐ

ｅ

２ＳＨ１ｉｓｏｌａｔｅ

ＬＩ

Ｗｅｎ

－

ｌｉａｎ

ｇ

，

ＷＡＮＧ

Ｘｉａｎ

－

ｗｅｉ

，

ＭＡ

Ｔａｏ

，

ＬＩ

Ｙｕ

－

ｆｅｎ

ｇ

，

ＪＩＡＮＧ

Ｐｉｎ

ｇ

（

Ｋｅ

ｙ

Ｌａｂｏｒａｔｏｒ

ｙ

ｏ

ｆ

Ａｎｉｍａｌ

Ｄｉｓｅａｓｅｓ

Ｄｉａ

ｇ

ｎｏｓｔｉｃｓ

ａｎｄ

Ｉｍｍｕｎｏｌｏ

ｇｙ

ｏ

ｆ

ｔｈｅ

Ｍｉｎｉｓｔｒ

ｙ

ｏ

ｆ

Ａ

ｇ

ｒｉｃｕｌｔｕｒｅ

／

Ｎａｎ

ｊ

ｉｎ

ｇ

Ａ

ｇ

ｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ

Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ

ｙ

，

Ｎａｎ

ｊ

ｉｎ

ｇ

２１００９５

，

Ｃｈｉｎａ

）

Ａｂｓｔｒａｃｔ

：

Ｔｈｅ

ｃｏｍ

ｐ

ｌｅｔｅ

ＯＲＦ２

ｇ

ｅｎｅ

ｗａｓ

ａｍ

ｐ

ｌｉｆｉｅｄ

ｆｒｏｍ

ｐ

ｏｒｃｉｎｅ

ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ

ｔ

ｙｐ

ｅ

２

（

ＰＣＶ２

）

ＳＨ１ｉｓｏｌａｔｅ

ｂ

ｙ

ＰＣＲ

ａｎｄ

ｔｈｅｎ

ｃｌｏｎｅｄ

ｉｎｔｏ

ｔｈｅ

ｄｏｎｏｒ

ｖｅｃｔｏｒ

ｐ

ＦａｓｔＢａｃＴＭＨＴ

Ｂ

ｏｆ

Ｂａｃ

－

ｔｏ

－

Ｂａｃ

Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ

Ｅｘ

ｐ

ｒｅｓｓｉｏｎ

Ｓ

ｙ

ｓ

－

ｔｅｍ．Ａｆｔｅｒ

ｓｅ

ｑ

ｕｅｎｃｉｎ

ｇ

ａｎｄ

ａｎａｌ

ｙ

ｓｉｓ

，

ｔｈｅ

ｐ

ｕｒｉｆｉｅｄ

ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ

ｐ

ｌａｓｍｉｄ

ｐ

Ｆ

－

Ｃａ

ｐ

ｗａｓ

ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ

ｉｎｔｏ

Ｅｓｃｈｅ

－

ｒｉｃｈｉａ

ｃｏｌｉ

ＤＨ１０Ｂａｃ

ｃｏｍ

ｐ

ｅｔｅｎｔ

ｃｅｌｌｓ

ｃｏｎｔａｉｎｉｎ

ｇ

ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ

ｓｈｕｔｔｌｅ

ｖｅｃｔｏｒ．Ｔｈｅ

ｗｈｉｔｅ

ｃｏｌｏｎｉｅｓ

ｗｅｒｅ

ｓｅｌｅｃｔｅｄ

ａｎｄ

ｔｈｅ

ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ

ｂａｃｍｉｄ

ｒＢａｃ

－

Ｃａ

ｐ

ｗａｓ

ｖｅｒｉｆｉｅｄ

ｂ

ｙ

ＰＣＲ．Ｔｈｅｎ

ｔｈｅ

ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ

ｂａｃｍｉｄ

ｗａｓ

ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ

ｉｎｔｏ

Ｓｆ９ｉｎｓｅｃｔ

ｃｅｌｌｓ

，

ｔｈｅ

ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ

ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ

ｒＡｃ

－

Ｃａ

ｐ

ｗａｓ

ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ

ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌ

ｙ

，

ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ

ｂ

ｙ

Ｗｅｓｔｅｒｎ

－

ｂｌｏｔ

ａｎｄ

ｉｎｄｉｒｅｃｔ

ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ

ａｓｓａ

ｙ

ｗｉｔｈ

ａｎｔｉｂｏｄ

ｙ

ａ

ｇ

ａｉｎｓｔ

Ｃａ

ｐ

ｐ

ｒｏｔｅｉｎ．Ｔｈｅ

ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ

Ｃａ

ｐ

ｐ

ｒｏｔｅｉｎ

ｗｉｔｈ

ｇ

ｏｏｄ

ｒｅａｃｔｏ

ｇ

ｅｎｉｃｉｔ

ｙ

ｌａｉｄ

ｔｈｅ

ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ

ｆｏｒ

ｆｕｒｔｈｅｒ

ｓｔｕｄｉｅｓ

ｏｆ

ｔｈｅ

ｆｕｎｃｔｉｏｎ

ａｎｄ

ｉｍｍｕｎｏ

－

ｌｏ

ｇ

ｉｃ

ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ

ｏｆ

ｔｈｅ

ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ

Ｃａ

ｐ

ｐ

ｒｏｔｅｉｎ．

Ｋｅ

ｙ

ｗｏｒｄｓ

：

ｐ

ｏｒｃｉｎｅ

ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ

ｔ

ｙｐ

ｅ

２

（

ＰＣＶ２

）；

ＯＲＦ２

ｇ

ｅｎｅ

；

ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ

ｅｘ

ｐ

ｒｅｓｓｉｏｎ

ｓ

ｙ

ｓｔｅｍ

猪圆环病毒

２

型

（

ｐ

ｏｒｃｉｎｅ

ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ

ｔ

ｙｐ

ｅ

２

，

ＰＣＶ２

）

是近年来危害养猪业的重要病原之一

，

与断

奶仔猪多系统衰竭综合征

（

ＰＭＷＳ

）、

猪皮炎肾病综

合征

（

ＰＤＮＳ

）、

猪呼吸道病以及繁殖障碍等疾病的

发生密切相关［

１

－

２

］。

现在已经使用猪圆环病毒相关

疾病

（

ＰＣＶＡＤ

）

这一名词来概括表示与

ＰＣＶ２

有关

的所有疾病［

２

］。

ＰＣＶ２

感染可以造成

５

～

１２

周龄猪

生长迟缓

、

贫血

、

消瘦

、

呼吸困难

、

黄疸

；

还可引起感

染猪的免疫抑制

，

并与多种病毒

、

细菌性疾病混合感

染

，

给世界养猪业造成巨大的经济损失［

３

－

４

］。

对其致

病机理和免疫预防的研究日益成为当前的热点

。

ＰＣＶ２

属于圆环病毒科圆环病毒属

，

是迄今发

现的最小的动物病毒

，

直径仅为

１７ｎｍ

，

无囊膜

，

其

基因组为一条长约

１．７６ｋｂ

的共价闭合环状单链

收稿日期

：

２０１０

－

０７

－

０６

；

修回日期

：

２０１０

－

０９

－

３０

基金项目

：

国家科技支撑计划项目

（

２００６ＢＡＤ６Ａ０７

）；

农业行业专项

（

２０１００３０６０

）；

国家生猪现代产业体系建设专项

（

ｎ

ｙ

ｃ

ｙ

ｔｘ

－

００９

）

作者简介

：

李文良

（

１９８４

），

男

，

河南开封人

，

博士生

。

＊

通讯作者

，

Ｔｅｌ

：

０２５

－

８４３９５５０４

，

Ｅ

－

ｍａｉｌ

：

ｊ

ｉａｎ

ｇｐ

＠

ｎ

ｊ

ａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ

中国兽医科学

２０１０

，

４０

（

１１

）：

１１５６

－

１１６０

Ｃｈｉｎｅｓｅ

Ｖｅｔｅｒｉｎａｒ

ｙ

Ｓｃｉｅｎｃｅ

ＤＮＡ［

５

］。

ＰＣＶ２

基因组含有

３

个主要的开放阅读

框

，

即

ＯＲＦ１

，

ＯＲＦ２

和

ＯＲＦ３

。

ＰＣＶ２ＯＲＦ１

由

９４５

个碱基组成

，

编码

３１４

个氨基酸的

Ｒｅ

ｐ

蛋白

，

Ｒｅ

ｐ

蛋

白具有便于

ｄＮＴＰ

结合的

Ｐ

－

ｌｏｏ

ｐ

结构以及螺旋状

的复制起点

，

与病毒的复制密切相关［

６

－

７

］。

ＰＣＶ２

ＯＲＦ２

由

７０２

个碱基组成

，

编码

２３３

个氨基酸

，

构成

病毒的衣壳蛋白

（

Ｃａ

ｐ

），

是主要的免疫原性蛋

白［

８

－

９

］。

ＯＲＦ３

编码的蛋白对病毒的复制非必需

，

但

研究表明该蛋白具有诱导细胞凋亡的活性［

１０

］。

由

于

Ｃａ

ｐ

蛋白对

ＰＣＶ２

的免疫保护起重要作用

，

所以

对

Ｃａ

ｐ

蛋白的研究比较广泛

，

已有多项报道通过不

同载体表达

Ｃａ

ｐ

蛋白用于该蛋白免疫学特性的试

验研究［

１１

－

１４

］。

研究表明中国目前流行的

ＰＣＶ２

以基

因型

２ｂ

为主

，

而

ＰＣＶ２ＳＨ１

分离株也属于

２ｂ

亚

型［

１５

］，

因此选取该毒株更具有实际意义

。

本研究利用

Ｂａｃ

－

ｔｏ

－

Ｂａｃ

杆状病毒表达系统构建

了表达

ＰＣＶ２ＳＨ１

分离株

Ｃａ

ｐ

蛋白的重组杆状病

毒

，

并对目的蛋白的表达特性及其抗原性进行鉴定

。

结果表明

Ｃａ

ｐ

蛋白能够在

Ｓｆ９

细胞中高效表达

，

且

具有良好的反应原性

。

本研究为

Ｃａ

ｐ

蛋白的免疫

学特性和

ＰＣＶ２

亚单位疫苗的研究奠定了基础

。

１

材料与方法

１．１

质粒

、

菌株

、

细胞与抗血清

含猪圆环病毒

２

型

（

ＰＣＶ２

）

ＳＨ１

株

ＯＲＦ２

基因

的阳性重组质粒

ｐ

Ｓｈｕｔｔｌｅ

－

Ｃａ

ｐ

由

Ｗａｎ

ｇ

等［

１４

］构建

并保存

；

Ｂａｃ

－

ｔｏ

－

Ｂａｃ

杆状病毒表达系统

（

包括转移载

体质粒

ｐ

ＦａｓｔＢａｃＴＭ

ＨＴ

Ｂ

，

ＤＨ１０Ｂａｃ

细菌

，

Ｓｆ９

昆虫

细胞

）

由本实验室保存

；

ＰＣＶ２Ｃａ

ｐ

蛋白单克隆抗体

由本实验室制备并保存

。

１．２

工具酶与试剂

限制性内切酶

、

Ｔ４ＤＮＡ

连接酶购自大连宝生

物工程有限公司

，

Ｔａ

ｑ

ＤＮＡ

聚合酶

、

Ｈｉｓ

标签单抗

购自天根生化科技有限公司

，

昆虫细胞用

Ｇｒａｃｅ

’

ｓ

培养基及特级胎牛血清购自

Ｉｎｖｉｔｒｏ

ｇ

ｅｎ

公司

，

辣根

过氧化物酶和

ＦＩＴＣ

标记的羊抗鼠

Ｉ

ｇ

Ｇ

购自武汉博

士德公司

，

转染试剂购自

Ｐｒｏｍｅ

ｇ

ａ

公司

。

１．３

ＯＲＦ２

基因的扩增

扩增

ＰＣＶ２ＯＲＦ２

全基因的

ＰＣＲ

引物由上海

Ｉｎｖｉｔｒｏ

ｇ

ｅｎ

公司合成

，

扩增目的基因片段大小为

７２３

ｂ

ｐ

。

上游引物

Ｐ１

引入

ＢａｍＨ

Ⅰ

酶切位点

，

下游引

物

Ｐ２

引入

Ｘｈｏ

Ⅰ

酶切位点

，

引物序列如下

（

下划线

处表示酶切位点

）：

Ｐ１

：

５′

－

ＣＴＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＣＧ

－

ＴＡＴＣＣＡＡＧＧＡＧ

－

３′

；

Ｐ

２

：

５′

－

ＣＴＴ

ＣＴＣＧＡＧ

ＴＣ

－

ＡＣＴＴＡＧＧＧＴＴＡＡＧＴＧＧＧ

－

３′

。

ＰＣＲ

反应体系

：

上

、

下游引物

（

１０

ｐ

ｍｏｌ

／

Ｌ

）

各

１．０

μ

Ｌ

；

Ｍ

ｇ

Ｃｌ２

（

２５ｍｍｏｌ

／

Ｌ

）

１．５

μ

Ｌ

；

ｄＮＴＰｓ

（

２．５

ｍｍｏｌ

／

Ｌ

）

２．０

μ

Ｌ

；

１０×ＰＣＲ

ｂｕｆｆｅｒ

２．５

μ

Ｌ

；

稀释的质

粒模板

２．０

μ

Ｌ

；

Ｔａ

ｑ

ＤＮＡ

聚合酶

（

５Ｕ

／

μ

Ｌ

）

０．２

μ

Ｌ

；

灭菌双蒸水补至

２５

μ

Ｌ

。

循环参数

：

９５℃５ｍｉｎ

；

以

９４℃４５ｓ

，

５４℃４５ｓ

，

７２℃４５ｓ

进行

３５

次循环

；

最后

７２℃

延伸

１０ｍｉｎ

。

用

１０

ｇ

／

Ｌ

的琼脂糖凝胶电泳鉴定

ＰＣＲ

产物

，

回收

ＰＣＲ

产物

，

－２０℃

保存备用

。

１．４

重组载体质粒

ｐ

Ｆ

－

Ｃａ

ｐ

的构建与鉴定

将回收的目的基因用

ＢａｍＨ

Ⅰ

＋Ｘｈｏ

Ⅰ

双酶

切

，

回收纯化之后克隆入同样酶切处理的转移载体

质粒

ｐ

ＦａｓｔＢａｃＴＭ

ＨＴ

Ｂ

中

，

转化

Ｅ．ｃｏｌｉ

ＤＨ５

α

感受

态细胞

。

经

ＰＣＲ

和

ＢａｍＨ

Ⅰ

＋Ｘｈｏ

Ⅰ

双酶切鉴定

的阳性质粒进一步通过测序分析

，

序列正确的阳性

重组质粒命名为

ｐ

Ｆ

－

Ｃａ

ｐ

。

测序工作由上海博亚生

物公司完成

。

１．５

重组

Ｂａｃｍｉｄ

质粒

ｒＢａｃ

－

Ｃａ

ｐ

的构建

按照

Ｂａｃ

－

ｔｏ

－

Ｂａｃ

Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ

Ｅｘ

ｐ

ｒｅｓｓｉｏｎ

Ｓ

ｙ

ｓ

－

ｔｅｍ

操作说明

，

将阳性质粒

ｐ

Ｆ

－

Ｃａ

ｐ

转化感受态细胞

ＤＨ１０Ｂａｃ

，

在

ＤＨ１０Ｂａｃ

中

，

重组转移载体

ｐ

Ｆ

－

Ｃａ

ｐ

在

ｈｅｌ

ｐ

ｅｒ

质粒的辅助下与杆状病毒骨架载体

Ｂａｃ

－

ｍｉｄ

发生同源重组

。

经

２

次蓝白菌落筛选

，

挑取白

色菌落培养

，

提取

Ｂａｃｍｉｄ

质粒

，

用

Ｐ１

和

Ｍ１３Ｒ

进

行

ＰＣＲ

鉴定

，

获得含

ＯＲＦ２

基因的重组

Ｂａｃｍｉｄ

质

粒

ｒＢａｃ

－

Ｃａ

ｐ

。

１．６

重组杆状病毒的获得

、

ＰＣＲ

鉴定与病毒扩增

按照转染试剂的操作说明

，

将

ｒＢａｃ

－

Ｃａ

ｐ

转染处

于对数生长期的

Ｓｆ９

细胞

，

２７℃

静置培养

，

每天观

察细胞病变情况

。

在转染后第

５

天收获细胞培养上

清

，

经

５００×

ｇ

离心

５ｍｉｎ

处理得到上清即获得第

１

代重组杆状病毒

，

命名为

ｒＡｃ

－

Ｃａ

ｐ

，

置于

４℃

避光保

存

。

同时将不含外源基因的

Ｂａｃｍｉｄ

转染

Ｓｆ９

细胞

，

获得的病毒即为野生杆状病毒

。

提取第

１

代杆状病

毒

ＤＮＡ

，

用引物

Ｐ１

和

Ｐ２

经

ＰＣＲ

扩增

ＯＲＦ２

基因

，

方法同前

，

以鉴定外源基因是否整合入重组杆状病

毒基因组中

。

将鉴定为阳性的第

１

代重组病毒

ｒＡｃ

－

Ｃａ

ｐ

按

１∶１０

的体积比感染处于对数生长期的

Ｓｆ９

细胞

，

２７℃

培养

３

～

４ｄ

至细胞出现明显病变时

，

即可收获

上清得到第

２

代病毒

；

用同样的方法获得第

３

代病

毒

，

每一代病毒均置于

４℃

避光保存

。

野生杆状病

毒亦用同样方法扩增保存

。

１．７

重组

Ｃａ

ｐ

蛋白在

Ｓｆ９

细胞中的表达与表达产

物的

Ｗｅｓｔｅｒｎ

－

ｂｌｏｔ

鉴定

将第

３

代重组杆状病毒按

１∶１０

体积比感染

７５１１

第

１１

期

李文良等

：

表达猪圆环病毒

２

型

ＳＨ１

分离株

Ｃａ

ｐ

蛋白的重组杆状病毒的构建与鉴定

Ｓｆ９

细胞

，

同时设立野生型杆状病毒和正常

Ｓｆ９

细胞

对照

，

感染后在不同时间

（

第

４８

、

７２

、

９６

、

１２０

小时

）

收

集细胞培养物

。

具体操作

：

弃去细胞培养上清

，

加入

预冷的

０．０１ｍｏｌ

／

Ｌ

ｐ

Ｈ

７．２

的

ＰＢＳ

洗涤细胞

２

次

，

收获细胞

，

以

１２

０００ｒ

／

ｍｉｎ

于

４℃

离心

１０ｍｉｎ

，

弃上

清

，

加入细胞裂解液于冰上裂解细胞

３０ｍｉｎ

，

再于

４

℃１２

０００ｒ

／

ｍｉｎ

离心

１５ｍｉｎ

，

吸取上清

，

加入

５×

上

样缓冲液

（

Ｌｏａｄｉｎ

ｇ

Ｂｕｆｆｅｒ

）

煮沸处理

５ｍｉｎ

。

取

２０

μ

Ｌ

样品进行

ＳＤＳ

－

ＰＡＧＥ

，

用考马斯亮蓝

Ｒ

－

２５０

染

色观察

。

Ｗｅｓｔｅｒｎ

－

ｂｌｏｔ

鉴定采用

Ｈｉｓ

标签单抗和

Ｃａ

ｐ

蛋

白单克隆抗体进行

。

ＳＤＳ

－

ＰＡＧＥ

电泳结束后

，

采用

半干转印的方法将蛋白转印到硝酸纤维素膜上

，

５０

ｇ

／

Ｌ

脱脂乳室温封闭

４ｈ

，

分别加入

１∶２００

稀释的

Ｃａ

ｐ

蛋白单克隆抗体和

１∶１

０００

稀释的

Ｈｉｓ

单抗

，

室温孵育

２．５ｈ

，

ＰＢＳＴ

洗涤

３

次

，

加入

１∶２０

０００

稀

释的

ＨＲＰ

标记的羊抗鼠

Ｉ

ｇ

Ｇ

，

室温孵育

１．５ｈ

，

ＰＢＳＴ

洗涤

３

次

，

加入化学发光显色液

，

在暗室进行

Ｘ

光片显影

，

观察特异性蛋白条带

。

１．８

重组蛋白的间接免疫荧光试验

（

ＩＦＡ

）

用重组病毒

ｒＡｃ

－

Ｃａ

ｐ

感染培养于

９６

孔板的单

层

Ｓｆ９

细胞

，

同时设野生型杆状病毒和正常

Ｓｆ９

细

胞对照

，

细胞出现病变后

，

弃培养上清液

，

ＰＢＳ

洗涤

细胞后用预冷的无水乙醇固定

，

ＰＢＳ

洗

２

次

，

加入

１∶１００

稀释的

Ｃａ

ｐ

蛋白单克隆抗体

，

３７℃

孵育

１ｈ

，

ＰＢＳ

洗

３

次

，

加入

１∶２００

稀释的

ＦＩＴＣ

－

羊抗鼠

Ｉ

ｇ

Ｇ

，

３７℃

孵育

４５ｍｉｎ

，

ＰＢＳ

洗

３

次

，

于荧光显微镜

下观察

，

记录结果

。

２

结果

２．１

重组转移载体质粒的构建与鉴定

将

ＰＣＲ

扩增的

ＰＣＶ２ＯＲＦ２

基因克隆入

ｐ

ＦａｓｔＢａｃＴＭ

ＨＴ

Ｂ

中

，

转化

Ｅ．ｃｏｌｉ

ＤＨ５

α

感受态细

胞

，

挑单菌落提取质粒

，

进行

ＰＣＲ

鉴定

。

取

ＰＣＲ

鉴

定为阳性的质粒进行

ＢａｍＨ

Ⅰ

＋Ｘｈｏ

Ⅰ

双酶切鉴

定

，

结果切出

１

条与

ＯＲＦ２

片段大小一致的片段

（

见

图

１

）。

测序结果分析证实

ＯＲＦ２

基因正确克隆入

ｐ

ＦａｓｔＢａｃＴＭ

ＨＴ

Ｂ

中

，

且序列与原有序列完全一致

，

符合原有阅读框

，

将阳性质粒命名为

ｐ

Ｆ

－

Ｃａ

ｐ

。

２．２

重组

Ｂａｃｍｉｄ

（

ｒＢａｃ

－

Ｃａ

ｐ

）

的构建与鉴定

将

ｐ

Ｆ

－

Ｃａ

ｐ

转化含

Ｂａｃｍｉｄ

的感受态细胞

ＤＨ１０Ｂａｃ

中

，

发生位点特异性的转座

，

经

３

种抗生

素

（

卡那霉素

、

四环素

、

庆大霉素

）

抗性筛选和蓝白

菌落筛选

，

挑白色菌落进行培养

，

提取质粒

，

用

Ｐ１

和

Ｍ１３Ｒ

进行

ＰＣＲ

鉴定

，

扩增出大小约为

１

４００ｂ

ｐ

的条带

，

而以

Ｂａｃｍｉｄ

为模板的对照中未扩出条带

（

见图

２

）。

证明成功获得了重组的

ｒＢａｃ

－

Ｃａ

ｐ

。

图

１

ｐ

Ｆ

－

Ｃａ

ｐ

的酶切鉴定

Ｆｉ

ｇ

．１

Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ

ｏｆ

ｔｈｅ

ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ

ｐ

Ｆ

－

Ｃａ

ｐ

ｂ

ｙ

ｅｎｚ

ｙ

ｍｅ

ｄｉ

ｇ

ｅｓｔｉｏｎ

Ｍ

：

ＤＮＡ

分子质量标准

；

１

：

ＯＲＦ２

基因的

ＰＣＲ

产物

；

２

、

３

：

ｐ

Ｆ

－

Ｃａ

ｐ

的

ＢａｍＨ

Ⅰ

＋Ｘｈｏ

Ⅰ

双酶切产物

Ｍ

：

ＤＬ２０００ＤＮＡ

Ｍａｒｋｅｒ

；

１

：

ＰＣＲ

－

ａｍ

ｐ

ｌｉｆｉｅｄ

ＯＲＦ２

ｇ

ｅｎｅ

；

２

，

３

：

Ｐｒｏ

－

ｄｕｃｔｓ

ｆｒｏｍ

ｐ

Ｆ

－

Ｃａ

ｐ

ｄｉ

ｇ

ｅｓｔｅｄ

ｗｉｔｈ

ＢａｍＨ

Ⅰ

ａｎｄ

Ｘｈｏ

Ⅰ

图

２

ｒＢａｃ

－

Ｃａ

ｐ

的

ＰＣＲ

鉴定

（

Ｐ１

／

Ｍ１３Ｒ

）

Ｆｉ

ｇ

．２

Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ

ｏｆ

ｒＢａｃ

－

Ｃａ

ｐ

ｂ

ｙ

ＰＣＲ

（

Ｐ１

／

Ｍ１３Ｒ

）

Ｍ

：

ＤＮＡ

分子质量标准

；

１

、

２

：

ｒＢａｃ

－

Ｃａ

ｐ

；

３

：

野生型

Ｂａｃｍｉｄ

Ｍ

：

１ｋｂ

ｐ

ｌｕｓ

ＤＮＡ

Ｍａｒｋｅｒ

；

１

，

２

：

ｒＢａｃ

－

Ｃａ

ｐ

；

３

：

Ｗｉｌｄ

ｔ

ｙｐ

ｅ

Ｂａｃｍｉｄ

２．３

重组病毒的获得与重组蛋白的

Ｗｅｓｔｅｒｎ

－

ｂｌｏｔ

鉴定

采用

ＰＣＲ

方法用引物

Ｐ１

和

Ｐ２

扩增

ＯＲＦ２

基

因

，

于

７３０ｂ

ｐ

左右可见明显条带

（

见图

３

），

而野生杆

状病毒无条带

，

证明得到阳性重组杆状病毒

。

将此

阳性重组杆状病毒

ｒＡｃ

－

Ｃａ

ｐ

接种

Ｓｆ９

细胞

，

在不同

时间点收取样品进行

ＳＤＳ

－

ＰＡＧＥ

分析

，

染色不能直

接观察到明显的目的蛋白条带

。

取感染后第

７２

小

时的样品用

Ｈｉｓ

标签单抗和

Ｃａ

ｐ

蛋白单克隆抗体对

重组蛋白进行

Ｗｅｓｔｅｒｎ

－

ｂｌｏｔ

鉴定

，

发现

Ｃａ

ｐ

蛋白能与

Ｈｉｓ

标签单抗和

ＰＣＶ２Ｃａ

ｐ

蛋白单克隆抗体产生特异

性结合

，

而正常昆虫细胞和野生病毒感染的细胞无此

染色反应条带

（

见图

４

）。

Ｗｅｓｔｅｒｎ

－

ｂｌｏｔ

鉴定结果证

实

，

ＰＣＶ２Ｃａ

ｐ

蛋白在昆虫细胞中得到了正确的表达

。

２．４

重组蛋白的

ＩＦＡ

分析

用

Ｃａ

ｐ

蛋白阳性血清对

ｒＡｃ

－

Ｃａ

ｐ

感染后第

７２

８５１１

中国兽医科学第

４０

卷

小时的

Ｓｆ９

细胞进行

ＩＦＡ

鉴定

，

荧光显微镜观察可

见

Ｓｆ９

胞浆内有亮绿色的荧光

，

而野生病毒转染的

Ｓｆ９

细胞和正常

Ｓｆ９

细胞没有可见的特异荧光

（

见图

５

），

进一步证明了

Ｃａ

ｐ

蛋白在昆虫细胞中得到了正

确的表达

，

具有较好的反应原性

。

图

３

ｒＡｃ

－

Ｃａ

ｐ

的

ＰＣＲ

鉴定

（

Ｐ１

／

Ｐ２

）

Ｆｉ

ｇ

．３

Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ

ｏｆ

ｒＡｃ

－

Ｃａ

ｐ

ｂ

ｙ

ＰＣＲ

（

Ｐ１

／

Ｐ２

）

Ｍ

：

ＤＮＡ

分子质量标准

；

１

：

野生型杆状病毒

；

２

：

ｒＡｃ

－

Ｃａ

ｐ

Ｍ

：

ＤＬ２０００ＤＮＡ

Ｍａｒｋｅｒ

；

１

：

Ｗｉｌｄ

ｔ

ｙｐ

ｅ

ＡｃＭＮＰＶ

；

２

：

ｒＡｃ

－

Ｃａ

ｐ

图

４

ｒＣａ

ｐ

的

Ｗｅｓｔｅｒｎ

－

ｂｌｏｔ

鉴定

Ｆｉ

ｇ

．４

Ｗｅｓｔｅｒｎ

－

ｂｌｏｔ

ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ

ｏｆ

ｒＣａ

ｐ

Ａ

：

一抗为

Ｈｉｓ

单抗

；

Ｂ

：

一抗为

Ｃａ

ｐ

单抗

；

１

：

野生型杆状病毒接种

Ｓｆ９

细胞后第

７２

小时收获的样品

；

２

：

ｒＡｃ

－

Ｃａ

ｐ

接种

Ｓｆ９

细胞后第

７２

小时

收获的样品

Ａ

：

ａｎｔｉ

－

Ｈｉｓ

ｍＡｂ

ａｓ

ｐ

ｒｉｍａｒ

ｙ

ａｎｔｉｂｏｄ

ｙ

；

Ｂ

：

ａｎｔｉ

－

Ｃａ

ｐ

ｍＡｂ

ａｓ

ｐ

ｒｉｍａｒ

ｙ

ａｎｔｉｂｏｄ

ｙ

；

１

：

Ｌ

ｙ

ｓａｔｅｓ

ｏｆ

Ｓｆ９ｃｅｌｌｓ

ｉｎｆｅｃｔｅｄ

ｗｉｔｈ

ＡｃＭＮＰＶ

ａｔ

ｈｏｕｒ

ｐ

ｏｓｔｓ

ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ

７２

；

２

：

Ｌ

ｙ

ｓａｔｅｓ

ｏｆ

Ｓｆ９ｃｅｌｌｓ

ｉｎｆｅｃｔｅｄ

ｗｉｔｈ

ｒＡｃ

－

Ｃａ

ｐ

ａｔ

ｈｏｕｒ

ｐ

ｏｓｔｓ

ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ

７２

图

５

重组

Ｃａ

ｐ

蛋白的

ＩＦＡ

分析

２００×

Ｆｉ

ｇ

．５

ＩＦＡ

ａｎａｌ

ｙ

ｓｉｓ

ｏｆ

Ｃａ

ｐ

ｐ

ｒｏｔｅｉｎ

ｅｘ

ｐ

ｒｅｓｓｅｄ

ｂ

ｙ

ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ

ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ

Ａ

：

ｒＡｃ

－

Ｃａ

ｐ

感染

Ｓｆ９

细胞

；

Ｂ

：

野生型杆状病毒感染

Ｓｆ９

细胞

；

Ｃ

：

正常

Ｓｆ９

细胞

Ａ

：

Ｓｆ９ｃｅｌｌｓ

ｉｎｆｅｃｔｅｄ

ｗｉｔｈ

ｒＡｃ

－

Ｃａ

ｐ

；

Ｂ

：

Ｓｆ９ｃｅｌｌｓ

ｉｎｆｅｃｔｅｄ

ｗｉｔｈ

ＡｃＭＮＰＶ

；

Ｃ

：

Ｓｆ９ｃｅｌｌｓ

３

讨论

近年来

，

ＰＣＶ２

的危害逐渐被重视

，

疫苗免疫被

认为是控制该病的有效手段

。

目前

，

ＰＣＶ２

相关疾

病的疫苗研究包括全病毒灭活疫苗

、

弱毒疫苗

、

ＤＮＡ

疫苗

、

重组活载体疫苗和亚单位疫苗及

ＰＣＶ１

－

ＰＣＶ２

嵌合重组疫苗［

１４

，

１６

－

１７

］。

但从安全性因

素考虑

，

活疫苗的使用受到了限制

。

亚单位疫苗因

其不含有核酸成分

，

不具有复制能力

，

是一种安全

、

有效的疫苗

，

成为当前

ＰＣＶ２

疫苗研究的热点

。

ＰＣＶ２ＯＲＦ２

基因编码的

Ｃａ

ｐ

蛋白是病毒结构

蛋白的重要成分

，

在致病性和诱导机体保护性免疫

应答中起重要作用

。

研究表明

，

ＯＲＦ２

基因表达的

Ｃａ

ｐ

蛋白具有与抗原性相关的线性表位

，

与机体的

免疫应答保护反应相关

，

因此

，

国内外许多研究者利

用不同的表达系统表达重组的

Ｃａ

ｐ

蛋白

，

可用于诊

断方法的建立和候选疫苗的研究［

１１

－

１４

，

１６

－

１７

］。

本试验通过

ＰＣＲ

扩增获得国内优势流行基因

型

ＰＣＶ２ｂＳＨ１

毒株的

ＯＲＦ２

基因

，

利用

Ｂａｃ

－

ｔｏ

－

Ｂａｃ

杆状病毒表达系统获得了能大量

、

稳定地表达

ＰＣＶ２Ｃａ

ｐ

蛋白的重组杆状病毒

，

并证明表达的蛋

白具有良好的反应原性

，

可用于诊断抗原或重组亚

单位疫苗的开发

，

而且重组蛋白含有

６×Ｈｉｓ

ｔａ

ｇ

，

方

便后续纯化工作

。

杆状病毒表达系统表达外源蛋白具有产量高

、

抗原性好

、

操作简便快速等优点

，

因此已在多种疫病

的研究中得到广泛应用

。

此外

，

杆状病毒表达系统

具有与动物细胞相似的转录翻译及翻译后加工等功

９５１１

第

１１

期

李文良等

：

表达猪圆环病毒

２

型

ＳＨ１

分离株

Ｃａ

ｐ

蛋白的重组杆状病毒的构建与鉴定

能

，

表达的外源蛋白基本保持原有的生物活性

。

本

试验构建的

ｒＡｃ

－

Ｃａ

ｐ

感染

Ｓｆ９

细胞后

，

阳性重组病

毒大量存在于上清液中

，

表达的

Ｃａ

ｐ

蛋白存在于

Ｓｆ９

细胞的细胞浆内

，

ＩＦＡ

的结果也证实了这一点

，

这与

Ｋｉｍ

等［

１８

］的报道一致

。

Ｗｅｓｔｅｒｎ

－

ｂｌｏｔ

结果表

明

，

重组蛋白在感染

Ｓｆ９

细胞

４８ｈ

后即可表达

，

直

至

１２０ｈ

仍可表达

，

且表达量较稳定

，

以

７２ｈ

最高

，

ＳＤＳ

－

ＰＡＧＥ

结果显示重组蛋白表达量相对于细胞

裂解总蛋白量仍很少

，

不能清晰辨出

，

笔者也尝试用

Ｎｉ

－

ＮＴＡ

对目的蛋白进行纯化

，

但洗脱回收效率低

，

效果较差

。

尽管如此

，

上述研究结果表明

Ｃａ

ｐ

蛋白

在重组杆状病毒中得到正确表达

，

且具有良好的抗

原性

，

可以与

ＰＣＶ２Ｃａ

ｐ

蛋白单克隆抗体发生特异

性反应

，

这为

ＰＣＶ２

基因工程亚单位疫苗的研制和

诊断方法的建立开辟了一条途径

，

同时

，

也为进一步

研究

ＰＣＶ２

结构蛋白的功能奠定了基础

。

参考文献

（

Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ

）

［

１

］

秦承学

，

姜平

，

王先炜

，

等

．

表达猪圆环病毒

２

型

Ｒｅ

ｐ

蛋白的重

组杆状病毒的构建与鉴定

［

Ｊ

］

．

畜牧与兽医

，

２００７

，

３９

（

１０

）：

１

－

５．

ＱＩＮ

Ｃｈｅｎ

ｇ

－

ｘｕｅ

，

ＪＩＡＮＧ

Ｐｉｎ

ｇ

，

ＷＡＮＧ

Ｘｉａｎ

－

ｗｅｉ

，

ｅｔ

ａｌ．Ｃｏｎ

－

ｓｔｒｕｃｔｉｏｎ

ａｎｄ

ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ

ｏｆ

ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ

ｉｎｓｅｃｔ

ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ

ｅｘ

ｐ

ｒｅｓｓｉｎ

ｇ

Ｒｅ

ｐ

ｐ

ｒｏｔｅｉｎ

ｏｆ

ｐ

ｏｒｃｉｎｅ

ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ

ｔ

ｙｐ

ｅ

２

［

Ｊ

］

．Ａｎｉｍａｌ

Ｈｕｓｂａｎｄｒ

ｙ

＆Ｖｅｔｅｒｉｎａｒ

ｙ

Ｍｅｄｉｃｉｎｅ

，

２００７

，

３９

（

１０

）：

１

－

５．

（

ｉｎ

Ｃｈｉｎｅｓｅ

）

［

２

］

ＤＯＮＧ

Ｊ

Ａ

，

ＩＮ

－

ＳＯＯＮ

Ｒ

，

ＤＡＥ

－

ＳＵＢ

Ｓ

，

ｅｔ

ａｌ．Ｐｈ

ｙ

ｌｏ

ｇ

ｅｎｅｔｉｃ

ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ

ｏｆ

ｐ

ｏｒｃｉｎｅ

ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ

ｔ

ｙｐ

ｅ

２ｉｎ

ＰＭＷＳ

ａｎｄ

ＰＤＮＳ

Ｋｏｒｅａｎ

ｐ

ｉ

ｇ

ｓ

ｂｅｔｗｅｅｎ

１９９９ａｎｄ

２００６

［

Ｊ

］

．Ｖｉｒｕｓ

Ｒｅｓ

，

２００７

，

１２９

（

２

）：

１１５

－

１２２．

［

３

］

ＨＡＲＤＩＮＧ

Ｊ

，

ＣＬＡＲＫ

Ｅ．Ｒｅｃｏ

ｇ

ｎｉｚｉｎ

ｇ

ａｎｄ

ｄｉａ

ｇ

ｎｏｓｉｎ

ｇ

ｐ

ｏｓｔ

－

ｗｅａｎｉｎ

ｇ

ｍｕｌｔｉｓ

ｙ

ｓｔｅｍｉｃ

ｗａｓｔｉｎ

ｇ

ｓ

ｙ

ｎｄｒｏｍｅ

（

ＰＭＷＳ

）［

Ｊ

］

．Ｓｗｉｎｅ

Ｈｅａｌｔｈ

Ｐｒｏｄ

，

１９９８

，

５

（

５

）：

２０１

－

２０３．

［

４

］

赵浩军

，

王先炜

，

姜平

，

等

．ＰＭＷＳ

患病猪群中

ＰＣＶ２

与

ＣＳＦＶ

、

ＰＰＶ

、

ＰＲＲＳＶ

混合感染的调查

［

Ｊ

］

．

畜牧与兽医

，

２００７

，

３９

（

３

）：

３２

－

３５．

ＺＨＡＯ

Ｈａｏ

－

ｊ

ｕｎ

，

ＷＡＮＧ

Ｘｉａｎ

－

ｗｅｉ

，

ＪＩＡＮＧ

Ｐｉｎ

ｇ

，

ｅｔ

ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔｉ

－

ｇ

ａｔｉｏｎ

ｏｆ

ＣＳＦＶ

，

ＰＰＶ

，

ＰＲＲＳＶ

ａｎｄ

ＰＣＶ２ｃｏ

－

ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ

ｉｎ

ＰＭ

－

ＷＳ

ｐ

ｉ

ｇ

ｈｅｒｄｓ

［

Ｊ

］

．Ａｎｉｍａｌ

Ｈｕｓｂａｎｄｒ

ｙ

＆Ｖｅｔｅｒｉｎａｒ

ｙ

Ｍｅｄｉｃｉｎｅ

，

２００７

，

３９

（

３

）：

３２

－

３５．

（

ｉｎ

Ｃｈｉｎｅｓｅ

）

［

５

］

ＦＥＮＡＵＸ

Ｍ

，

ＨＡＬＢＵＲ

Ｇ

Ｐ

，

ＨＡＱＳＨＥＮＡＳ

Ｇ

，

ｅｔ

ａｌ．Ｃｌｏｎｅｄ

ｇ

ｅｎｏｍｉｃ

ＤＮＡ

ｏｆ

ｔ

ｙｐ

ｅ

２

ｐ

ｏｒｃｉｎｅ

ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ

ｉｓ

ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ

ｗｈｅｎ

ｉｎ

ｊ

ｅｃｔｅｄ

ｄｉｒｅｃｔｌ

ｙ

ｉｎｔｏ

ｔｈｅ

ｌｉｖｅｒ

ａｎｄ

ｌ

ｙ

ｍ

ｐ

ｈｎｏｄｅｓ

ｏｆ

ｐ

ｉ

ｇ

ｓ

：

ｃｈａｒａｃ

－

ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ

ｏｆ

ｃｌｉｎｉｃａｌ

ｄｉｓｅａｓｅ

，

ｖｉｒｕｓ

ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ

，

ａｎｄ

ｐ

ａｔｈｏｌｏ

ｇ

ｉｃ

ｌｅｓｉｏｎｓ

［

Ｊ

］

．Ｖｉｒｏｌｏ

ｇｙ

，

２００２

，

７６

（

２

）：

５４１

－

５５１．

［

６

］

ＭＡＮＫＥＲＴＺ

Ａ

，

ＭＡＮＫＥＲＴ

Ｊ

，

ＷＯＬＦ

Ｚ

Ｋ

，

ｅｔ

ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ

－

ｔｉｏｎ

ｏｆ

ａ

ｐ

ｒｏｔｅｉｎ

ｅｓｓｅｎｔｉａｌ

ｆｏｒ

ｒｅ

ｐ

ｌｉｃａｔｉｏｎ

ｏｆ

ｐ

ｏｒｃｉｎｅ

ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ

［

Ｊ

］

．Ｊ

Ｇｅｎ

Ｖｉｒｏｌ

，

１９９８

，

７９

（

２

）：

３８１

－

３８４．

［

７

］

ＬＩＵ

Ｃ

Ｍ

，

ＩＨＡＲＡ

Ｔ

，

ＮＵＮＯＹＡ

Ｔ

，

ｅｔ

ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏ

ｐ

ｍｅｎｔ

ｏｆ

ａｎ

ＥＬＩＳＡ

ｂａｓｅｄ

ｏｎ

ｔｈｅ

ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ

ｅｘ

ｐ

ｒｅｓｓｅｄ

ｃａ

ｐ

ｓｉｄ

ｐ

ｒｏｔｅｉｎ

ｏｆ

ｐ

ｏｒｃｉｎｅ

ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ

ｔ

ｙｐ

ｅ

２ａｓ

ａｎｔｉ

ｇ

ｅｎ

［

Ｊ

］

．Ｊ

Ｖｅｔ

Ｍｅｄ

Ｓｃｉ

，

２００４

，

６６

（

３

）：

２３７

－

２４２．

［

８

］

ＣＨＥＵＮＧ

Ａ

Ｋ．Ｔｒａｎｓｃｒｉ

ｐ

ｔｉｏｎａｌ

ａｎａｌ

ｙ

ｓｉｓ

ｏｆ

ｐ

ｏｒｃｉｎｅ

ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ

ｔ

ｙｐ

ｅ

２

［

Ｊ

］

．Ｖｉｒｏｌｏ

ｇｙ

，

２００３

，

３０５

（

１

）：

１６８

－

１８０．

［

９

］

ＮＡＷＡＧＩＴＧＵＬ

Ｐ

，

ＭＯＲＯＺＯＶ

Ｉ

，

ＢＯＬＩＮ

Ｓ

Ｒ

，

ｅｔ

ａｌ．Ｏ

ｐ

ｅｎ

ｒｅａｄｉｎ

ｇ

ｆｒａｍｅ

２ｏｆ

ｐ

ｏｒｃｉｎｅ

ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ

ｔ

ｙｐ

ｅ

２ｅｎｃｏｄｅｓ

ａ

ｍａ

ｊ

ｏｒ

ｃａ

ｐ

ｓｉｄ

ｐ

ｒｏｔｅｉｎ

［

Ｊ

］

．Ｊ

Ｇｅｎ

Ｖｉｒｏｌ

，

２０００

，

８１

（

９

）：

２２８１

－

２２８７．

［

１０

］

ＬＩＵ

Ｊ

，

ＣＨＥＮ

Ｉ

，

ＤＵ

Ｑ

，

ｅｔ

ａｌ．Ｔｈｅ

ＯＲＦ３

ｐ

ｒｏｔｅｉｎ

ｏｆ

ｐ

ｏｒｃｉｎｅ

ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ

ｔ

ｙｐ

ｅ

２ｉｓ

ｉｎｖｏｌｖｅｄ

ｉｎ

ｖｉｒａｌ

ｐ

ａｔｈｏ

ｇ

ｅｎｅｓｉｓ

ｉｎ

ｖｉｖｏ

［

Ｊ

］

．

Ｊ

Ｖｉｒｏｌ

，

２００６

，

８０

（

１０

）：

５０６５

－

５０７３．

［

１１

］

王海燕

，

郭振光

，

盛瑜

，

等

．

表达

ＰＣＶ２Ｃａ

ｐ

蛋白重组杆状病毒

对小鼠的保护力试验

［

Ｊ

］

．

扬州大学学报

：

农业与生命科学版

，

２００８

，

２９

（

２

）：

１

－

５．

ＷＡＮＧ

Ｈａｉ

－

ｙ

ａｎ

，

ＧＵＯ

Ｚｈｅｎ

－

ｇ

ｕａｎ

ｇ

，

ＳＨＥＮＧ

Ｙｕ

，

ｅｔ

ａｌ．Ｐｒｏ

－

ｔｅｃｔｉｏｎ

ｏｆ

ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ

ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ

ｅｘ

ｐ

ｒｅｓｓｉｎ

ｇ

ｔｈｅ

ｃａ

ｐ

ｓｉｄ

ｐ

ｒｏ

－

ｔｅｉｎ

ｏｆ

ｐ

ｏｒｃｉｎｅ

ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ

２ｉｎ

ｍｉｃｅ

［

Ｊ

］

．Ｊｏｕｒｎａｌ

ｏ

ｆ

Ｙａｎ

ｇ

ｚｈｏｕ

Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ

ｙ

：

Ａ

ｇ

ｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ

ａｎｄ

Ｌｉ

ｆ

ｅ

Ｓｃｉｅｎｃｅ

Ｅｄｉｔｉｏｎ

，

２００８

，

２９

（

２

）：

１

－

５．

（

ｉｎ

Ｃｈｉｎｅｓｅ

）

［

１２

］

ＷＵ

Ｐ

Ｃ

，

ＣＨＩＥＮ

Ｍ

Ｓ

，

ＴＳＥＮＧ

Ｙ

Ｙ

，

ｅｔ

ａｌ．Ｅｘ

ｐ

ｒｅｓｓｉｏｎ

ｏｆ

ｔｈｅ

ｐ

ｏｒｃｉｎｅ

ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ

ｔ

ｙｐ

ｅ

２ｃａ

ｐ

ｓｉｄ

ｐ

ｒｏｔｅｉｎ

ｓｕｂｕｎｉｔｓ

ａｎｄ

ａ

ｐｐ

ｌｉｃａ

－

ｔｉｏｎ

ｔｏ

ａｎ

ｉｎｄｉｒｅｃｔ

ＥＬＩＳＡ

［

Ｊ

］

．Ｊ

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ

，

２００８

，

１３３

（

１

）：

５８

－

６４．

［

１３

］

樊惠英

，

陈焕春

，

佟铁铸

，

等

．

猪圆环病毒

２

型

ＯＲＦ２

基因在昆

虫细胞中的表达及其特性

［

Ｊ

］

．

生物工程学报

，

２００５

，

２１

（

６

）：

９７５

－

９７８．

ＦＡＮ

Ｈｕｉ

－

ｙ

ｉｎ

ｇ

，

ＣＨＥＮ

Ｈｕａｎ

－

ｃｈｕｎ

，

ＴＯＮＧ

Ｔｉｅ

－

ｚｈｕ

，

ｅｔ

ａｌ．Ｔｈｅ

ｅｘ

ｐ

ｒｅｓｓｉｏｎ

ｏｆ

ｐ

ｏｒｃｉｎｅ

ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ

ｔ

ｙｐ

ｅ

２ＯＲＦ２

ｇ

ｅｎｅ

ｉｎ

ｉｎｓｅｃｔ

ｃｅｌｌｓ

ａｎｄ

ｉｔｓ

ｃｈａｒａｃｔｅｒ

［

Ｊ

］

．Ｃｈｉｎｅｓｅ

Ｊｏｕｒｎａｌ

ｏ

ｆ

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ

ｇｙ

，

２００５

，

２１

（

６

）：

９７５

－

９７８．

（

ｉｎ

Ｃｈｉｎｅｓｅ

）

［

１４

］

ＷＡＮＧ

Ｘ

Ｗ

，

ＪＩＡＮＧ

Ｗ

Ｍ

，

ＪＩＡＮＧ

Ｐ

，

ｅｔ

ａｌ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ

ａｎｄ

ｉｍｍｕｎｏ

ｇ

ｅｎｉｃｉｔ

ｙ

ｏｆ

ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ

ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ