rapeed

5个与脂肪酸代谢相关基因在油菜不同生育期表达量

刘凯;肖刚;张振乾;官春云;陈社员;邬贤梦

【摘要】为了明晰与脂肪酸代谢相关基因在不同油酸含量油菜中的表达情况，以

出苗后7d、5～6叶期和越冬期的叶片、花瓣和授粉后20～35d的种子为材料，

对5个转录组分析得到的差异基因（Bna0691280，Bna0421530，

Bna0547440，Bna0799930和Bna0764010）在高油酸油菜近等基因系中的表

达情况进行研究。结果发现，在营养生长期（出苗后7d、5～6叶期和越冬期）

的叶片中，5个基因在高油酸油菜材料中的表达量均高于低油酸油菜中的表达量。

在花中除Bna0547440和Bna0764010外，其它3个基因在高油酸油菜中的表达

量高于低油酸油菜中的表达量。在授粉后20～35d的种子中除Bna0799930外，

其余4个基因在高油酸油菜材料中的表达量均低于低油酸油菜中的表达量。研究

结果可为高油酸油菜育种和分子机理研究提供参考。%Inordertounderstand

theexpressionoffattyacidmetabolism-relatedgenesinrapeed

materialswithdifferentoleicacidcontents,inthisstudy,theleavesof7-

dayedlings,in5-6leafstageandoverwinteringperiod,petalsandthe

edsof20-35daysafterpollinationwereudasmaterials,andthe

expressionof5differentialgenes(Bna0691280,Bna0421530,Bna0547440,

Bna0799930andBna0764010)whichobtainedbytranscriptomeanalysisof

ultsshowed

that:intheleaves,theexpressionlevelsinhigholeicrapeedmaterial

heexpressionin

flowers,exceptforBna0547440andBna0764010,theexpressionlevelsof

theother3genesinhighole-icrapeedmaterialwerehigherthantho

hointheedsof20-35daysafter

pollination,theex-pressionlevelsinthehigh-oleicrapeedwerelower

resultsofthisstudycanbeudforthebreedingstudyofmolecular

mechanismofhigholeicrapeed.

【期刊名称】《生物学杂志》

【年(卷),期】2016(033)001

【总页数】4页(P32-34,48)

【关键词】实时荧光定量PCR;脂肪酸代谢;高油酸油菜

【作者】刘凯;肖刚;张振乾;官春云;陈社员;邬贤梦

【作者单位】湖南农业大学农学院，长沙410128;湖南农业大学农学院，长沙

410128;湖南农业大学农学院，长沙410128;湖南农业大学农学院，长沙410128;

湖南农业大学农学院，长沙410128;湖南农业大学农学院，长沙410128

【正文语种】中文

【中图分类】S565.4

AbstractInordertounderstandtheexpressionoffattyacidmetabolism-

relatedgenesinrapeedmaterialswithdifferentoleicacidcontents,inthi

sstudy,theleavesof7-dayedlings,in5-

6leafstageandoverwinteringperiod,petalsandtheedsof20-

35daysafterpollinationwereudasmaterials,andtheexpressionof5di

fferentialgenes(Bna0691280，Bna0421530，Bna0547440，

Bna0799930andBna0764010)whichobtainedbytranscriptomeanalysisof

higholeicrapeednear-

ultsshowedthat:intheleaves,theexpr

essionlevelsinhigholeicrapeedmaterialwerehigherthanthointhel

heexpressioninflowers,exceptforBna0547440

andBna0764010,theexpressionlevelsoftheother3genesinhigholeicr

hos

eintheedsof20-

35daysafterpollination,theexpressionlevelsinthehigh-

oleicrapeedwerelowerthantheexpressioninthelow-

ultsofthisstudycanbeudfo

rthebreedingstudyofmolecularmechanismofhigholeicrapeed.

KeywordsReal-

timequantitativePCR;fattyacidmetabolism;higholeicacidrapeed

高油酸油菜是近年来兴起的一种油菜新品种，其菜籽油中的油酸含量高于75%，

有较好的营养保健功能[1]。为了更好地了解其油酸合成的分子机理，国内外进行

了大量的研究[2-9]，但多集中在fad2[5-9]。为了进一步挖掘与油酸合成相关的

基因，在本研究中以高油酸油菜近等基因系材料授粉后20~35d种子的转录组分

析得到的5个与脂肪酸代谢相关基因为对象，分别取高油酸油菜近等基因系材料

幼苗期、5~6叶期、越冬期、花期和种子成熟期等不同时期的材料，采用定量

PCR方法对这些差异基因在不同生育期表达量进行了研究，以期从中找出不同材

料间的差异，为高油酸油菜育种和油酸合成分子机理研究提供参考。

1.1材料

1.1.1试验材料

高油酸油菜近等基因系材料由国家油料改良中心湖南分中心提供。本试验研究的5

个与脂肪酸代谢相关的基因来自高油酸油菜近等基因系材料授粉后20~35d种子

的转录组分析。转录组分析以低油酸油菜为对照组，高油酸油菜为处理组，对差异

在1.5倍以上基因进行GO分类分析，采用FDR≤0.001和log2Ratio≥2作为标

注筛选差异基因，共得到6414个差异基因，1296个基因上调表达，5118个基

因下调表达。通过路径富集分析和KEGG注释显示共有2043个差异基因被富集

表达，分为119个分类，其中与脂肪酸代谢相关的有5个基因(结果未发表)。

1.1.2仪器设备

Nanodrop2000微量紫外分光光度计(Thermo)，CFX96CFX384荧光定量

PCR(Thermo)，Eppendorf超低温离心机等。

1.2方法

1.2.1样品制备

在出苗后7d幼苗去根，5~6叶期(2014年12月4日)和越冬期(2015年1月3

日)嫩叶，盛花期(2015年3月15日)自交套袋的花，在授粉后20~35d(2015年

4月10日)未成熟种子，以上材料各取10株以上，混合保存于-80℃备用。

1.2.2RNA提取

采用TransZolUpPlusRNAKit(TransGeneBiotech)提取总RNA，具体方法参

照说明书。经Nanodrop2000微量紫外分光光度计检测浓度、纯度，琼脂糖凝

胶电泳检测RNA无明显降解，保存于-80℃备用。

1.2.3定量PCR研究

采用TransScriptAll-in-OneFirst-StrandcDNA(TransGeneBiotech)进行逆转

录反应，具体方法参照说明书。采用Primer5.0设计引物，由上海生工技术公司

合成。UBC21(ubiquitin-conjugatingenzyme21)作为内参基因，引物序列

为:5′-CCTCTGCAGCCTCCTCAAGT(F)；5′-

CATATCTCCCCTGTCTTGAAATGC(R)，使用CFX96TMReal-

TimeSystem(BIO-RAD,USA)参考文献[3]进行。基因表达情况采用比较周期阈

值法进行评价[10]。数据分析采用ANOVA和PostHoctest，P<0.05为显著差

异。试验进行3次，取平均值。需要进行研究的基因及其引物情况如表1所示。

2.1出苗后7d不同材料间基因表达情况

5个基因在出苗后7d材料中表达量结果如图1所示。由图1可知，5个基因在高

油酸油菜材料中的表达量均显著高于低油酸油菜中的表达量，其中Bna0799930

和Bna0547440在不同材料中表达量差异较大。γ-谷氨酰转肽酶是催化γ-谷氨肽

和氨基酸生成γ谷氨酸和肽反应的酶。Janczur等[11]研究了甘蓝型油菜品系

DHO-120的重金属累积和螯合系统对铅胁迫，发现该酶为对铅胁迫有潜在修复

能力的螯合肽的限速酶，在根和茎中表达量同时伴随着酶活性的增加。

2.25~6叶期叶片中与光合相关基因表达情况

5个基因在5~6叶期不同材料叶片中的表达量结果如图2所示。由图2可知，5

个基因在高油酸油菜中的表达量高于低油酸油菜中的表达量，但与幼苗期相比表达

量差异明显减少，Bna0799930在不同材料中表达量差异较大。

2.3越冬期叶片中与光合相关基因表达情况

5个基因在越冬期不同材料叶片中的表达量结果如图3所示。由图3可知，5个基

因在高油酸油菜中的表达量高于低油酸油菜中的表达量，但与幼苗期相比表达量差

异明显减少，Bna0691280在不同材料中表达量差异较大，与前面两个时期相比

差异增幅较大，而Bna0799930和Bna0764010差异较小。

2.45~6花中与光合相关基因表达情况

5个与脂肪酸代谢相关基因在不同材料花中的表达量结果如图4所示。由图4可

知，5个基因的表达情况与前面3个时期明显不同，Bna0547440和

Bna0764010在高油酸油菜中的表达量低于低油酸油菜中的表达量，其余3个基

因在高油酸油菜材料中的表达量高于低油酸油菜中的表达量。

2.5授粉后20~35d种子中与光合相关基因表达情况

5个基因在授粉后20~35d不同材料种子中的表达量结果如图5所示。由图5可

知，除Bna0799930外，其余4个基因在高油酸油菜材料中的表达量均低于低油

酸油菜中的表达量，5个基因在不同材料中表达量差异较小。

3.1结论

由上述结果可得到如下结论：在营养生长期(出苗后7d、5~6叶期和越冬期)的叶

片中，5个基因在高油酸油菜材料中的表达量均高于低油酸油菜中的表达量。在花

中Bna0547440和Bna0764010在高油酸油菜中的表达量低于低油酸油菜中。在

授粉后20~35d的种子中除Bna0799930外，其余4个基因在高油酸油菜材料

中的表达量均低于低油酸油菜中的表达量。

3.2讨论

在营养生长期，5个与脂肪酸代谢相关的基因在高油酸油菜中的表达量高于低油酸

油菜中，在后续研究中可进行进一步研究，以确定其是否具有同样的表达情况，如

结果与本研究一致，则可利用实时荧光定量PCR的方法对该基因进行测定，在油

菜生育前期进行高油酸油菜育种材料的筛选，加快育种进程。

在授粉后20~35d种子中除Bna0799930外，其余4个基因在高油酸油菜材料

中的表达量均低于低油酸油菜中的表达量。此时期为油菜产量形成关键时期，可能

是这4个基因对油酸合成起负向调控作用，可通过基因沉默等方式进行进一步验

证；Bna0799930可通过过量表达进行其功能验证，从而找出影响油酸合成的基

因。

【相关文献】

[1]张振乾，肖钢，谭太龙，等.高油酸油菜研究进展及其前景展望[J].作物杂志，2009(5)：1-6.

[2]GuanM,LiX,rrayanalysisofdifferentiallyexpresdgenesbetweenB

rassicanapusstrainswithhigh-andlow-

oleicacidcontents[J].PlantCellRep,2012,31(5):929-943.

[3]ZhangZQ,XiaoG,LiuRY,micanalysisofdifferentiallyexpresdproteins

betweenXiangyou15varietyandthemutantM15[J].FrontBiol，2014,9(3):234-

243.[18]JahanJ,logicalandanatomicalstudiesofleavesofdifferentplantsaffec

tedbymotorvehiclexhaust[J].JournalofIslamicAcademyofSciences,1992,5(1):21-23.

[4]ZhangZQ,XiaoG,LiuRY,entconstructionofanormalizedcDNAlibraryoft

hehigholeicacidrapeeded[J].AfricanJournalofAgriculturalRearch,2011,6(18):4

288-4292.

[5]SureshaGS,RaiRD,larcloning,expressionanalysisandgrowthte

mperaturedependentregulationofanoveloleatedesaturagene(fad2)homologuefro

mBrassicajuncea[J].AustralianJournalofCropScience,2012,6(2):296-308.

[6]黄永娟，张凤启，杨甜甜，等.EMS诱变甘蓝型油菜获得高油酸突变体[J].分子植物育种，2011，

9(5)：611-616.

[7]JungJH,KimH,GoYS,ficationoffunctionalBrFAD2-

1geneencodingmicrosomaldelta-

12fattyaciddesaturafromBrassicarapaanddevelopmentofBrassicanapuscontaining

higholeicacidcontents[J].PlantCellRep,2011,30(10):1881-1892.

[8]PengQ,HuY,WeiR,aneoussilencingofFAD2andFAE1genesaffectsboth

oleicacidanderucicacidcontentsinBrassicanapuseds[J].PlantCellRep,2009,29(4):

317-325.

[9]陈松，张洁夫，浦惠明，等.转基因高油酸油菜T-DNA插入拷贝数及整合位点分析[J].分子植

物育种，2011，9(1)：17-24.

[10]LivakKJ,isofrelativegeneexpressiondatausingreal-

timequantitativePCRandthe2(-DeltaDeltaC(T))Method[J].Methods,2001,25(4):402-

408.

[11]JanczurKL,NucP,WasinkiewiczK，etal.甘蓝型油菜的修复能力-螯合系统对重金属耐受

与累积反应和γ-谷氨酰转肽酶的合成[C].武汉：第十二届国际油菜大会论文集，2007：236.