raina

作物学报ACTAAGRONOMICASINICA2012,38(4):754759/zwxb/

ISSN0496-3490;CODENTSHPA9E-mail:xbzw@

本研究由湖南省自然科学基金项目(09JJ3063)资助。

第一作者联系方式:E-mail:shechaowen@,Tel:

Received(收稿日期):2011-08-04;Accepted(接受日期):2011-12-19;Publishedonline(网络出版日期):2012-02-13.

URL:/kcms/detail/

DOI:10.3724/SP.J.1006.2012.00754

花生的荧光显带和rDNA荧光原位杂交核型分析

佘朝文1,2,3张礼华1蒋向辉1,2,3

1怀化学院生命科学系,湖南怀化418008;2怀化学院民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室,湖南怀化418008;3怀化学

院湘西药用植物与民族植物学湖南省高校重点实验室,湖南怀化418008

摘要:建立花生准确而详细的核型对于阐明其起源和开展其基因组研究十分重要。本研究采用DAPI显带和5S、

45SrDNA探针双色荧光原位杂交对花生有丝分裂中期染色体进行了分析。结果表明,花生的单倍基因组总长度为

(81.06±3.74)μm,最长染色体为(4.72±0.15)μm,最短染色体为(2.62±0.14)μm;有15对染色体显示了着丝粒区DAPI+

带,其中10对为强带,5对为弱带;有2对5SrDNA位点和5对45SrDNA位点,其中1对5S与1对45S位点同线。

综合染色体测量数据、DAPI+带和rDNA杂交信号,对花生染色体进行了准确配对和排列,建立了详细的分子细胞遗

传学核型。花生的核型公式为2n=4x=40=38m+2sm(SAT),核型不对称类型属于2A型。

关键词:花生;核型;荧光显带;rDNA;荧光原位杂交

luorescenceBanding

andFluorescenceinsituHybridizationwithrDNAProbes

SHEChao-Wen1,2,3,ZHANGLi-Hua1,andJIANGXiang-Hui1,2,3

1DepartmentofLifeSciences,HuaihuaUniversity,Huaihua418008,China;2KeyLaboratoryofRearchandUtilizationofEthnomedicinalPlant

ResourcesofHunanProvince,Huaihua418008,China;3KeyLaboratoryofXiangxiMedicinalPlantandEthnobotanyofHunanHigherEducation,

Huaihua418008,China

Abstract:damentalforclarificationofthe

study,themitoticmetaphachromosomesofthespecieswereanalyzed

usingDAPIbandinganddoublefluorescenceinsituhybridization(FISH)nhaploidkaryo-

typelengthwas(81.06±3.74)μm,thelongestchromosomepairwas(4.72±0.15)μmandtheshortestchromosomepairwas

(2.62±0.14)μomplementsofthespecies,fifteenpairsofthechromosomesdisplayedcentromericDAPI+bandsincluding

tenpairsofstrongbandsandfivepairsofweakbands;andtwopairsof5Sandfivepairsof45SrDNAsiteswereshowed,withone

ingthechromosomemeasurementswithDAPI+bandsandrDNAFISHsignals,the

chromosomeswereexactlypairedandarranged,

eawas2n=4x=40=38m+2sm(SAT)andtheasymmetrickaryotypebelongedto2Atype.

Keywords:Arachishypogaea;Karyotype;Fluorochromebanding;rDNA;Fluorescenceinsituhybridization

花生(ArachishypogaeaL.)广泛栽培于热带、亚热带

和温带暖和地区,其油分和蛋白质含量丰富,对人类的

营养有重要贡献。花生是异源四倍体(2n=4x＝40),具有

AABB基因组,系落花生属(Arachis)的2个二倍体物种杂

交后染色体加倍产生的野生四倍体种(ola)经人

工驯化而来[1-2]。最新的研究表明,nsis和A.

ipaensis最有可能分别是花生A和B基因组的供体[3-6]。

花生的染色体较小,且大多数为中部着丝粒染色体,

很难区分。很早就有学者开始研究花生染色体的数目、形

态和在细胞分裂中的行为,识别了两对与众不同的染色

体,即长度最小的染色体(称为“A”染色体)和具有次缢痕

的染色体[7-8]。许多学者对花生及其不同亚种、变种的核

型进行过研究[9-14],但均仅根据形态特征区分染色体,染

色体配对和测量难以准确。因此,花生准确的核型建立需

要更多的识别标记。采用优先结合AT或GC碱基序列的

荧光染料可以对染色体进行荧光显带,区分染色体上不

同类型的异染色质,例如,DAPI(4’,6-diamino-2-pheny-

lindoledihydrochloride)可以显示染色体的AT丰富区,而

CMA(chromomycinA3)可以显示染色体的GC丰富区[15]。

在染色体上物理定位rRNA基因(rDNA)序列的荧光原位

第4期佘朝文等:花生的荧光显带和rDNA荧光原位杂交核型分析755

杂交(FISH)技术,不仅可以提供5S和45SrDNA的染色体

位置信息,而且可以为染色体的识别提供有效标记[16]。

Raina和Mukai[17]最早对包括花生在内的落花生属部分物

种进行了rDNAFISH定位和DAPI显带研究,但未进行核

型分析。Seijo等[3]结合rDNAFISH定位和DAPI显带比

较分析落花生属的花生、野生四倍体种及部分二倍体物种,

探讨了花生A、B基因组的起源,但未提供花生详细的核

型分析数据。

本研究采用改良的酶解去壁火焰干燥法制备分散且

形态良好的有丝分裂中期染色体,用DAPI荧光显带,用

5S和45SrDNA探针进行双色荧光原位杂交,并根据

DAPI+带和rDNA杂交信号,结合染色体测量,准确识别

染色体,建立花生详细的分子细胞遗传学核型,为花生

起源的阐明和基因组的进一步研究提供可靠依据。

1材料与方法

1.1试验材料和染色体制片

花生密枝变种(eavar.

hypogaea)即弗吉尼亚型(Virginiatype)大花生品种,由湖

南省农业科学院提供。

用根尖按Song等[18]的方法制备有丝分裂染色体。种

子萌发后剪取根尖,用饱和α-溴萘预处理1.5h,然后用

甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定。将固定的根尖水洗后用1%的

纤维素酶(cellulaRS)、1%的果胶酶(pectolyaY23)及

1%的蜗牛酶(cytohelica)的混合液(用柠檬酸缓冲液配制,

pH4.5)在28℃下酶解1.5h。以火焰干燥法制片。染色体

装片置–20℃贮存备用。

1.2探针标记、原位杂交和信号检测

45SrDNA来自番茄基因组,其质粒由美国Nebraska

大学Arumuganathan教授提供。用地高辛-11-UTP缺口平

移标记试剂盒(RocheDiagnostics,Mannheim,Germany)标

记分离纯化的45SrDNA质粒。

5SrDNA探针来自用水稻基因组DNA作模板的PCR

标记扩增反应。混合物总体积为25μL,含dATP、dGTP、

dCTP各200μmolL–1、dTTP60μmolL–1、生物素-11-dUTP

(BoehringerMannhrim)140μmolL–1、正向引物5′-GGATG

CGATCATACCAGCAC-3′和反向引物5′-GGGAATGCA

ACACGAGGACT-3′各10pmolL–1、模板DNA50ng和Taq

聚合酶(上海生物工程有限公司)1U。按照94℃变性1min,

55℃退火1min,72℃延伸2min,进行35~40个循环,后

延长72℃,10min后终止反应。

按照She等[19]的方法进行原位杂交及其检测。用链

亲和素-CY3(AmershamBiosciences)和生物素化抗链亲

和素(VectorLaboratories)检测和放大生物素标记的5S

rDNA杂交信号,用羊抗地高辛-Fluorescein(RocheDi-

agnostics)和兔抗羊-Fluorescein(VectorLaboratories)检测

和放大地高辛标记的45SrDNA杂交信号。

1.3观察和拍照

用装有CCD照相系统(PhotomatricsCoolSNAPEZ)

的OlympusBX60荧光显微镜观察装片,照相系统用

MetMorph图像软件控制。用含30%抗淬灭剂(Vectashield,

VectorLaboratories)的DAPI溶液(3μgmL–1)复染染色体,

分别用紫外(UV)、蓝色(WB)和绿色(WG)激发滤光片观察

DAPI染色、地高辛标记和生物素标记的杂交信号。用

Photoshop软件处理图片。

1.4核型分析

选取5个分散且染色体形态良好的中期分裂相,用

Photoshop软件测量染色体,按照李懋学和陈瑞阳[20]的方

法计算单倍基因组绝对长度、各染色体的相对长度[(染色

体长度/单倍基因组总长度)×100%]和臂比(长臂/短臂)、染

色体长度比(最长染色体长度/最短染色体长度),确定各

染色体的类型和核型不对称类型。染色体按从长到短顺序

排列。计算rDNA位点的百分距离[(杂交信号中点(或次缢

痕)至着丝粒的长度/染色体臂总长度)×100%]。综合DAPI+

带、rDNA信号和染色体测量数据绘制核型模式图。

2结果与分析

2.1一般核型特征

花生的有丝分裂中期染色体较小,选取染色体凝缩

最短的5个中期分裂相,测得单倍基因组总长度为

(81.06±3.74)μm,最长染色体的长度为(4.72±0.15)μm,

最短染色体(“A”染色体)的长度为(2.62±0.14)μm,其中图

1所展示的中期分裂相,其单倍基因组总长度为85.37μm,

最长染色体为4.92μm,最短染色体为2.64μm。在所有分

裂相中,从形态上可明确区分长度最短、异染色质化程度

最高的“A”染色体和在长臂具有次缢痕的随体染色体

(SAT染色体)。SAT染色体的次缢痕在前期和早中期分裂

相中常常处于拉伸状态,使随体远离长臂近端区(图片未

展示)。从表1可以看出,花生的核型公式为2n=4x=40=

38m+2sm(SAT),即除了SAT染色体(第16染色体)为近中

部着丝粒染色体外,其他19对染色体都为中部着丝粒染

色体。基因组中臂比大于2.0的染色体占0.05,最长与最短

染色体的比为1.80,因此核型不对称类型属于2A型[21]。

2.2DAPI带型

经DAPI染色后,有5对(第1、第2、第3、第5和

第9)染色体没有显示DAPI+带;有15对染色体显示了着

丝粒区DAPI+带,其中10对(第4、第7、第10、第12、

第13、第14、第16、第17、第19和第20)染色体的DAPI+

带的荧光强或较强,5对(第6、第8、第11、第15和第

18)染色体的DAPI+带的荧光弱(图1-b、图2和表1)。不

同对染色体的DAIP+带的大小有差异,部分强DAPI+带延

伸到近着丝粒区,第20染色体(“A”染色体)的DAPI+带最

显著,带区占了染色体总长度的1/3。同一对染色体的2

条同源染色体的DAPI+带的强弱和大小也表现出差异,

如第12和第13染色体。我们的试验表明,花生染色体不

756作物学报第38卷

经过荧光原位杂交实验程序而直接用DAPI染色,也可以

在相应的染色体上显示着丝粒区DAPI+带,不过经过荧

光原位杂交实验程序而用DAPI染色显示的带纹更加明

显和突出。

图15S、45SrDNA探针双色荧光原位杂交和DAPI染色的花生有丝分裂中期染色体

eaafterdoubleFISHwith5Sand45SrDNAprobesandDAPIstaining

a:荧光原位杂交图像,红色为5S信号,绿色为45S信号,数字为核型分析确定的染色体编号;b:DAPI显带染色体的反相图。标尺=5μm。

a:FISHimageinwhichredandgreenare5Sand45Ssignals,respectively,andchromosomenumbersaredesignatedbymeansofkaryotyping;

b:=5μm.

图2花生的核型和核型模式图

ea

a:显示DAPI带和rDNA荧光原位杂交信号的核型;b:仅显示DAPI带的核型(反相图);c:显示DAPI带型和5S、45SrDNA位点位置的核型

模式图,纵向标尺为染色体相对长度。

a:KaryotypeshowingDAPIbandsandrDNAFISHsignals;b:KaryotypeshowingDAPIbandsonly(reversion);c:IdiogramdisplayingDAPIbanding

patternsandthelocationsof45Sand5SrDNAsites,inwhichtheordinateindicatestherelativelengthofchromosome.

第4期佘朝文等:花生的荧光显带和rDNA荧光原位杂交核型分析757

2.35S和45SrDNA的FISH定位

经双色荧光原位杂交后,花生显示了2对5SrDNA

位点和5对45SrDNA位点(图1-a和图2-a)。2对5S位

点分别位于第5、第10染色体短臂靠近着丝粒的区域,

它们的百分距离分别是13.95±2.11和26.21±3.09。5对

45SrDNA位点分别位于第5、第8、第9、第13、第16

染色体上。第5染色体的45S位点位于长臂,邻近着丝

粒,其百分距离为26.31±1.94,与这一染色体短臂上的

5S位点同线;第8染色体的45S位点位于短臂,其百分

距离为58.68±4.96,即在臂中部稍偏远端的位置;第9

染色体的45S位点位于长臂邻近着丝粒的区域,其百分

距离为27.83±0.79;第13染色体的45S位点在长臂紧靠

着丝粒的区域,其百分距离为17.66±3.78;第16染色

体的

45S位点位于长臂并形成次缢痕,其杂交信号从长

臂紧靠着丝粒的区域延伸到随体的近端部分,次缢痕的

百分距离为25.91±1.71。5对45S位点中,第16染色体

的杂交信号最强,9号的较强,其他3对的信号较弱且强

度接近。

表1花生染色体测量数据及DAPI+带分布

Table1ChromosomemeasurementsandthedistributionofDAPI+bandsofArachishypogaeaL.

相对长度Relativelength(%)

No.

短臂±SD

S＃±SD

长臂±SD

L＃±SD

总长度±SD

Total±SD

臂比±SD

Armratio±SD

染色体类型

Type

着丝粒DAPI+带

CentromericDAPI+

bands§

12.56±0.183.35±0.385.91±0.441.31±0.17m

22.64±0.113.08±0.175.72±0.201.17±0.08m

32.58±0.073.05±0.135.63±0.111.18±0.07m

42.45±0.063.12±0.155.58±0.101.28±0.08m

＋＋

52.64±0.202.93±0.095.57±0.281.12±0.06m

62.46±0.072.99±0.185.45±0.151.22±0.10m

＋

72.07±0.113.20±0.225.27±0.251.55±0.13m

＋＋

82.45±0.132.80±0.085.25±0.151.15±0.06m

＋

92.32±0.082.90±0.135.23±0.191.25±0.05m

102.42±0.132.59±0.175.01±0.301.07±0.03m

＋＋

112.24±0.082.76±0.184.99±0.141.24±0.12m

＋

122.31±0.022.66±0.164.97±0.151.15±0.07m

＋＋

132.24±0.082.68±0.084.91±0.051.20±0.08m

＋＋

142.25±0.152.58±0.064.83±0.201.15±0.05m

＋＋

152.09±0.132.64±0.144.73±0.251.26±0.09m

＋

161.45±0.103.13±0.194.58±0.252.18±0.14sm※＋＋

171.97±0.072.50±0.184.47±0.141.27±0.12m

＋＋

181.95±0.122.47±0.224.42±0.311.27±0.09m

＋

191.75±0.152.49±0.074.25±0.201.43±0.11m

＋＋

201.58±0.101.69±0.133.28±0.221.07±0.05m

＋＋

＃S和L分别代表短臂和长臂;※随体染色体,随体长度包含在内,但次缢痕拉伸部分未计入长度;§＋＋和＋分别表示着丝粒区DAPI+强

带和弱带。SD为标准差。

＃SandLreprentshortarmandlongarm,respectively.※Satellitechromosome,thelengthofthesatelliteisincluded,butthelengthoftheex-

tendedcondaryconstrictionixcluded.§＋＋and＋reprentstrongandweakcentromericDAPI+bands,:standarddeviation.

3讨论

花生具有AABB基因组[1],Seijo等[3]的研究认为,A

基因组染色体全部具有着丝粒区DAPI+带,而B基因组染

色体则全部缺乏DAPI+带,而且不同亚种和栽培变种具

有相似的带型。我们的结果显示,花生有15对染色体具

有着丝粒区DAPI+带,其中10对染色体的DAPI+带的荧

光强或较强,5对染色体的DAPI+带的荧光较弱,这与

Seijo等[3]报道的结果不同,其可能原因是,我们制备的

染色体形态更好、背景更干净,DAPI显带更加充分,而且

通过Photoshop软件处理获得的反相图像,使DAPI+带纹

的辨别更加准确无误。我们的双色荧光原位杂交结果显示,

花生具有2对5SrDNA位点、5对45SrDNA位点,且有

1对5S与1对45S同线,这与Seijo等[3]的结果是一致的。

我们精确测定了各rDNA位点在染色体上的位置,得出了

各位点的百分距离,发现与Seijo等[3]报道的位置存在一

些差异。根据我们的DAPI显带结果,不能将花生的染色

体明确地区分为A基因组和B基因组,因此,我们按从长

到短顺序排列染色体,建立其核型(图2)。根据5S和45S

杂交信号判断,我们所建核型中的第5、第8、第9、第

758作物学报第38卷

10、第13、第16染色体分别对应于Seijo等[3]报道的核

型中的B3、B7、B10、A3、A2、A10染色体。核型中的

第20染色体为最小的染色体即“A”染色体,对应于Seijo

等[3]的核型中的A9染色体。第8(即B7)染色体具有弱的

着丝粒区DAPI+带,可见花生的B基因组的部分成员也具

有DAPI显带的着丝粒异染色质。

花生的染色体不仅较小,而且大部分染色体对之间

的大小差异也很小,仅根据相对长度、臂比等形态学测量

指标难以进行同源染色体的准确配对和不同对染色体的

精确区分,这很可能是不同作者所报道的核型数据[9-14]差

异较大的主要原因。我们通过DAPI显带和rDNA双色荧

光原位杂交,获得了更多的染色体识别标记,再结合染

色体的相对长度和臂比等测量数据,可以对花生的各染

色体进行准确区分,进而建立其详细而准确的表明异染

色质分布和5S、45S位点位置的分子细胞遗传学核型。

我们的结果表明,花生的核型公式为2n=4x=40=38m+

2sm(SAT),与王建波等[13]及Lavia和Aveliano[14]报道的相

同,而与其他人报道的有差异[9-12]。我们测得花生单倍基

因组染色体的总长度较Seijo等[3]报道的长13.78μm,这

种差异可能是所测定的染色体的凝缩程度不同造成的,

也可能与供试花生的品种差异有关。

花生分为密枝亚种(ea)和疏枝亚种

(iata),前者包含密枝变种(ea)和多

毛变种(a),后者则有疏枝变种(iata)等

4个变种[22],常规方法分析发现变种间在核型上存在差

异[11-12,16],6个变种间在分子细胞遗传学核型上是否也存

在差异,有待对其他变种采用本文同样的方法进行比较

分析。

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