分子生物学实验

常⽤分⼦⽣物学实验技术--整理

常⽤的分⼦⽣物学实验技术：

离⼼技术：

是分离纯化蛋⽩质、酶、核酸（DNA、RNA）、细胞的最常⽤⽅法之⼀。

电泳（electrophoresis）：带电粒⼦在电场中向着与其所带电荷相反⽅向电极移动的现象。

可⽤于分离不同分⼦量的⽣物⼤分⼦。

1.蛋⽩质的电泳：

⽤途：蛋⽩质的定量。

2.核酸的电泳：

⽤途：⽤于核酸的分离、鉴定、纯化、回收。

⽐如：我只需要长度300bp左右的分⼦。那么，电泳后，在切胶过程中，只切300bp处的分⼦即可。

蛋⽩质研究相关的技术：

1.含量测定：

2.结构的测定：

（1）⼀级结构的测定：搞清楚蛋⽩质肽链的氨基酸排列顺序。

⽅法：Edman降解法、质谱法（MS,将蛋⽩⽔解，多肽链分成⼩段。检测肽段）

（2）空间结构测定：蛋⽩空间结构分析⽐⼀级结构分析复杂得多。

⽅法：X射线衍射晶体分析法、核磁共振法等。

3.功能的测定：

（1）酵母双杂交（YTH）：

假设：欲检测蛋⽩X与蛋⽩Y是否相互作⽤。

检测⽅法：

将蛋⽩X与报告基因转录因⼦的BD融合；

将蛋⽩Y与AD融合；

确认蛋⽩X与蛋⽩Y形成的复合体能否激活报告基因的表达。如果能激活报告基因的表达，说明：X与Y形成了复合体，则

BD和AD靠近，激活了下游报告基因的表达；反之，报告基因不表达。

原理：

真核⽣物的转录因⼦（尤其是酵母转录因⼦GAL4），包括两个彼此分离、但功能必需的结构域：⼀个是与DNA结合的结

构域-BD；⼀个是转录激活域-AD。BD识别转录因⼦效应基因的上游序列并与之结合；AD通过与转录复合体的其他成分作⽤，启动下游的

基因转录。

即使BD与AD分开，但如果在空间上较为接近时也能激活转录。——利⽤转录因⼦的BD、AD这⼀特性，通过检测转录因

⼦是否启动了其效应基因的表达，可研究蛋⽩质X与Y是否相互作⽤。

（2）蛋⽩质芯⽚技术：⼀种⾼通量、微型化、⾃动化的蛋⽩质分析技术。⼀次试验中可同时检测⼏百甚⾄⼏千种⽬标蛋⽩或多

肽。

（3）免疫印迹技术Westernblotting：利⽤抗原抗体特异反应的原理。

⽤途：检测样品中特定蛋⽩质是否存在以及半定量分析、研究蛋⽩质间的相互作⽤。

（4）免疫共沉定技术（co-immunoprecipitation，Co-IP）

（5）GSTpull-down技术

（6）⽣物信息学预测蛋⽩质

核酸分⼦杂交（nucleicacidhybridization）：指来源不同但具有⼀定同源性的核酸分⼦变性后，在⼀定条

件下复性时单链之间相互配对，形成杂化双链的过程。

在实际操作中，常使⽤标记过的已知序列的特定核苷酸⽚段（即核酸探针）与待测样品进⾏杂交，以确定特定核酸序列是否存在。

核酸探针（probe），根据其性质和来源，基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针和⼈⼯合成的寡核苷酸探针。

（1）基因组DNA探针：制备简单、不易降解、标记⽅法成熟，是最常⽤的探针。

（2）cDNA探针：以mRNA为模板，在反转录酶的催化下合成的DNA分⼦。

cDNA探针均为编码序列，不存在内含⼦和⾼度重复序列，在探查某些基因的差异表达⽅⾯应⽤较多。

（3）RNA探针：是⼀段标记过的RNA分⼦，⽤于探测与之互补的DNA或mRNA链。

RNA探针在杂交效率、观察基因的正反向转录状况、反义核酸研究等⽅⾯有着明显优势。

（4）⼈⼯合成的寡核苷酸探针：如果只知道蛋⽩质的氨基酸排列顺序，⽽不知其编码基因的碱基顺序，可以利⽤⼈⼯合成的寡核

苷酸探针来探查未知基因的序列。

核酸分⼦杂交的类型：

（1）Southern印迹杂交：将电泳分离的待测DNA⽚段转移并结合到⼀定的固相⽀持物上，并与标记过的DNA探针进⾏杂交检测的

⼀种⽅法。

（2）Northern印记杂交：检测样品的RNA的⼀种印迹⽅法。

（3）原位杂交（ISH）：不改变核酸所在的位置，直接与探针进⾏杂交的⽅法。可分为组织原位杂交和菌落原位杂交。

组织原位杂交：a）荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization，FISH）——可对基因在染⾊体上的分布进⾏精确

定位；可对特定RNA在组织或细胞中的空间分布及表达⽔平进⾏测定。分辨率⾼达100-200Kkb。b）基因组原位杂交（genomeinsitu

hybridization，GISH）：主要⽤于⽐较基因组学。利⽤物种之间基因组DNA同源性的差异，以⼀个物种的基因组DNA作为探针，与另⼀个

物种的染⾊体进⾏原位杂交，分析杂交信号在染⾊体上的分布及强弱程度，⽐较鉴别不同物种的基因组之间的亲缘关系，探讨基因组的进化

机制和速率。

（4）斑点杂交和狭缝印记杂交：将DNA或RNA变性后直接点样于固相⽀持膜上，经紫外交联或烘烤固定后，与核酸探针分⼦进⾏

杂交的⼀种检测⽅法，整个过程不需要电泳。

相⽐前⼏种的优点：操作简单迅速、⼀张膜上可检测多个样品。缺点：⽆法检测所测核酸样品分⼦量⼤⼩。

⽤途：检测拷贝数、基因转录⽔平的变化。

基因芯⽚（genechip）：

包括DNA芯⽚或DNA微阵列、cDNA芯⽚，以斑点杂交为基础建⽴的⾼通量检测基因表达的⼀种⽅法，它将⼤量已知序列的寡核苷酸或

cDNA探针固于固相表⾯作为探针，然后与标记的待测核酸进⾏杂交，通过对杂交信号的检测分析，获得待测核酸的各种序列及表达信息。

特点：⾼通量、⼤规模、⾼灵敏度、⾼⾃动化。

⽤途：基因表达谱分析、基因组⽐较研究及发现新基因、DNA序列分析、基因诊断、药物筛选、新药发现、合理⽤药、中草药鉴定等⽅

⾯。

可检测细胞的RNA表达量、细胞的基因组的拷贝数变化、基因组的snp。

聚合酶链反应（polymerachainreaction，PCR）是⼀种由引物（primer）介导，利⽤DNA聚合酶在体外

扩增⽬的基因的⽅法，也叫基因扩增技术。

1.反应体系：模板DNA、耐热DNA聚合酶、两种引物、四种dNTP、含有Mg2+的缓冲液。

2.反应过程：⼀般由25~35轮循环构成，每轮循环包括三个反应步骤。

（1）变性。将反应体系加热到94~95摄⽒度，持续30秒左右，使待扩增DNA完全解链成双链，作为聚合反应的模板。若DNA⽚段

长或GC含量⾼，需设置更长时间及更⾼的温度，以保证模板完全解链。

（2）退⽕。使温度迅速下降到适宜温度并维持30秒，使引物与模板DNA两条链的3`端互补配对。由于引物⽚段短，结构简单，⽽

且数量远远超过模板DNA的数量，所以DNA模板单链之间结合的机会极少。

（3）延伸。将反应体系温度升⾼到72摄⽒度，此时DNA聚合酶将以单链DNA为模板，将单核苷酸逐个添加到引物的3`端，使新链

不断延长，直⾄合成结束。

产物的检测：PCR完成后，需要进⾏严格的检测分析，以确定是否得到了预期产物。常⽤的检测⽅法如下：

凝胶电泳、酶谱分析法、序列测定分析、核酸分⼦杂交。

产物的纯化：

⽅法：可⽤酚-氯仿抽提加⼄醇沉淀法，也可以电泳后直接将⽬的条带切下，再利⽤商品化的胶回收试剂盒进⾏纯化。

PCR引物：

（1）长度：⼀般为15~30nt。

（2）引物的3`末端：这是延伸开始的地⽅，绝对不能发⽣错配，不能进⾏修饰。

（3）引物的5`末端：引物的5`末端可以进⾏⼀定程度的修饰，如加酶切位点、标记⽣物素、荧光、地⾼⾟，引物突变位点或突变

序列、引⼊启动⼦序列等。

（4）还有其它⼀些特点，⽐如：碱基组成、引物⾃⾝结构引物浓度等。

PCR技术的应⽤：获得⽬的基因、定点突变、基因表达、基因诊断、基因组测序。

衍⽣的PCR技术：

（1）反转录PCR（revertranscriptionPCR，RT-PCR）：将RNA的反转录与PCR过程结合的⼀种PCR技术。即在反转录酶的

作⽤下，以mRNA为模板反转录⽣成cDNA，再以cDNA为模板进⾏PCR扩增。

RT-PCR的引物有3种。a）随机引物：对未知的、长的或具有发卡结构的RNA进⾏反转录，特异性最低。

b）Oligo（dT15-18）：适⽤于有polyA尾巴的mRNA；c）特异性引物：与⽬的序列互补，是反义寡核苷酸，适⽤于⽬的序列已知的情况。

注意：确保RNA中⽆RNa及基因组DNA的污染。

⽤途：分析基因的转录⽔平、构建RNA⾼效转录系统等。

（2）定量RT-PCR（quantitativeRT-PCR，QRT-PCR）：

在反应体系中设⽴⼀定的RNA竞争性参考标准（RNAcompetitivereferencestandard，RNA-CRS），与⽬标mRNA⼀起

进⾏扩增，就能对⽬的基因的表达⽔平做出半定量或定量分析，这就是RT-PCR。

（3）实时荧光定量PCR（real-timefluorescencequantitativePCR，FQ-PCR）：在PCR反应体系中加⼊荧光标记分⼦，利⽤荧

光信号的累积实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线对原始模板进⾏定量的⽅法。

原理：形成双链时发出荧光。

重要概念：

Ct值：PCR过程中扩增产物的荧光信号打到设定的荧光阀值时所需的循环次数即为循环阀值Ct。

溶解曲线：双链变成单链时需要的温度。

扩增曲线：

基因失活技术：利⽤技术，在DNA或mRNA⽔平封闭或降低致病基因的表达。

常⽤的基因失活技术有：反义核酸、RNA⼲扰（RNAinterference，RNAi）、核酶、三链DNA。

RNAi：双链RNA诱发的转录后基因沉默。

质粒