legea

角膜基质细胞在p(HEMA-MMA)改性前后的粘附率、形貌

与力学性能变化

严拓;孙蓉;邓华;覃百花;敖宁建

【摘要】采用原子力显微镜(AFM)对改性前后材料表面粘附生长的角膜基质细胞

的亲和力、三维形貌和力学性能进行了分析.结果显示,改性后材料的细胞亲和力有

较大改善,且材料表面细胞三维形态更加正常,铺展更为舒展,与材料的接触面积较大.

细胞力学性能分析也发现改性后材料表面细胞具有更高的粘附力和杨氏模量,以及

更低的硬度,说明未改性p(HEMA-MMA)材料具有明显的细胞毒性,这种毒性作用

导致在其表面生长的细胞的细胞骨架遭到破坏,细胞健康状态明显不如改性后材料

表面细胞.因此,改性后的Col/bFGF-p(HEMA-MMA)更适合作为人工角膜材料使

用.

【期刊名称】《分析测试学报》

【年(卷),期】2010(029)003

【总页数】5页(P232-236)

【关键词】原子力显微镜;p(HEMA-MMA);三维形貌;粘附率;细胞力学性能

【作者】严拓;孙蓉;邓华;覃百花;敖宁建

【作者单位】暨南大学,生物医学工程系,广东,广州,510632;暨南大学,化学系,广东,

广州,510632;暨南大学,化学系,广东,广州,510632;暨南大学,生物医学工程系,广东,

广州,510632;暨南大学,生物医学工程系,广东,广州,510632

【正文语种】中文

【中图分类】O776.1

据统计,目前全世界已有超过100万人由于角膜疾病而致盲。由于同种异体角膜移

植术具有供体不足、免疫排斥等缺点,人工角膜成为患者复明的希望[1-3]。

pHEMA(聚甲基丙烯酸羟乙酯)作为目前在人工角膜领域应用广泛的水凝胶材料,具

有无毒无害、高亲水性、高透光率等特点,但同时存在强度低、细胞亲和力差、不

能支持细胞生长等缺点[4-7],常导致人工角膜受到宿主组织的排斥而使移植失败。

笔者在前期工作中[8-9],将I-型胶原和bFGF(碱性成纤维生长因子)等生物大分子成

功引入p(HEMA-MMA)共聚合材料表面,制备了Col/bFGF-p(HEMA-MMA)复合

材料。本文研究了角膜基质细胞在p(HEMA-MMA)改性前后材料上的细胞粘附情

况,同时利用原子力显微镜对不同材料表面粘附的细胞的形貌及力学性能进行观测,

从而推断出Col/bFGF-p(HEMA-MMA)对角膜基质细胞的毒性,为评价其在人工

角膜的应用前景提供了依据。

1.1仪器与试剂

原子力显微镜(AutoprobeCPRearch,Thermomicroscopes,美国);新西兰大

白兔(暨南大学动物中心);DMEM培养基、双抗(杭州四季青生物工程公司);24孔

细胞培养板(日本IWAKI公司);所用试剂均为分析纯。

1.2角膜基质细胞的原代培养

取新西兰白兔2只,处死后用新洁尔灭消毒,0.5%庆大霉素滴眼液冲洗结膜囊,沿角

膜缘剪取角膜。用PBS液漂洗3次,反复刮除角膜上皮及内皮,剪碎成约1mm3小

块,培养箱(37℃、5%CO2)内消化3h,1000r/min离心10min,PBS漂洗1次

后加入DMEM培养基(含10%胎牛血清和1%双抗),吹打均匀后将细胞悬液接种

于培养瓶中培养。首次换液时间为1周,以后每3天更换培养液1次,待细胞传代稳

定,生长旺盛时留取实验备用。

1.3角膜基质细胞在不同材料表面的粘附率

角膜细胞以3×105个/mL分别接种于组织培养板(TCPS)、p(HEMA-MMA)和

Col/bFGF-p(HEMA-MMA)材料表面,放入37℃5%CO2培养箱中培养。24h后,

取出材料,用PBS缓冲液冲洗数次将未贴壁细胞冲洗干净。胰蛋白酶充分消化,将材

料上的细胞配成细胞悬液,用血细胞计数板计数。以TCPS上的细胞数计为100%,

其他材料上细胞以其相对百分比计算。

1.4AFM样品制备

角膜基质细胞以一定浓度接种于p(HEMA-MMA)和Col/bFGF-p(HEMA-MMA)

材料表面,37℃,5%CO2培养箱中培养24h后,取出材料,用PBS缓冲液冲洗数次,

将未贴壁细胞冲洗干净,2.5%(质量分数)戊二醛中固定15min后,PBS冲洗,自然风

干备用。

1.5AFM成像

将表面载有角膜细胞的材料固定于AFM的扫描台上,对样品进行扫描成像,实验采

用100μm扫描器,UL20B硅探针,微悬臂的弹性系数为218N/m,在空气中以接触

模式成像。在两细胞表面相同位置选取100μm×100μm的区域,用监视器定位待

扫描的样品区域,用AFM针尖接触细胞微区,记录力学曲线。AFM图像和数据经仪

器配置软件(IP2.1)处理,以消除扫描方向上的低频背景噪音,所有力学曲线均在同一

扫描速率上测得。

2.1角膜基质细胞在材料表面的粘附率

图1为角膜基质细胞在空白、未改性和改性组材料共培养24h后的粘附率。可以

明显看到,未改性材料表面细胞的粘附率只有50%～60%,而改性后材料细胞的粘附

率则接近90%,角膜细胞的粘附率显著提高。这说明Col/bFGF-p(HEMA-MMA)

材料与细胞的亲和力较改性前明显增加,细胞相容性得到极大提高,能够支持角膜细

胞粘附。

2.2不同表面生长细胞的三维形貌观察

对比图2、3中的细胞,发现改性后材料表面的细胞形态正常,铺展更为舒展,与材料

的接触面积更大,改性前材料表面的细胞则明显较为萎缩,与材料接触面积较小。这

是因为在不同材料表面,细胞的生活环境不同,为适应新的环境,细胞骨架发生重排,从

而导致细胞形貌的差异。

另外,从图中可观察到改性后材料表面细胞的细胞膜更为粗糙,且表面粒子明显较大。

一般认为,细胞膜蛋白单体在培养过程中能够吸附脂类、糖类以及其他蛋白等,为细

胞的新陈代谢提供营养物质。图3中细胞表面蛋白粒子粒径较大,由此推断,改性后

材料表面细胞的蛋白单体吸附的营养物质较多,细胞的新陈代谢旺盛。

2.3不同表面生长细胞的力学性能研究

图4为AFM测得的改性后材料表面细胞的力学曲线图。一般认为,细胞膜表面的

力学性能包括粘弹力(Adhesionforce)、硬度(Stiffness)、杨氏模量

(Young'smodulus)等。

图4中,F为粘弹力。硬度可由下列公式得到:

由Hertz模型[12-13],有如下公式:

通过进一步换算,得到杨氏模量(E):

其中ν是泊松比,ν=0.5;R是探针半径,R=10nm;δ:压痕深度,为细胞高度的1/10。

细胞粘弹性主要依赖于细胞骨架,细胞在生理病理变化过程中会发生粘弹性的变化

[14-16],因此对细胞粘弹性的研究可以推知细胞的状态变化。由图5(A)可知,在改

性材料表面生长的角膜细胞粘弹力为(2328±523)pN,而未改性材料表面细胞则为

(525±117)pN。一般认为粘弹力与细胞表面粒子之间的范德华力有关[17],粒子粒

径越大,粘弹力越大。图5(A)中改性材料上的细胞粘弹力明显大于未改性材料,可以

推断改性材料表面细胞的粒径应大于未改性材料表面,同时图2和图3中也可以看

到改性后材料表面的细胞膜表面粒子较为明显,两部分结果基本一致。

硬度是表征细胞膜表面力学性质的重要参数,可反映刚性随形变的变化。在细胞膜

上分布的粒子,如胶原蛋白、蛋白多糖、糖蛋白以及各种生物大分子,调节细胞的各

种行为,包括细胞增殖、细胞分化、细胞迁移和细胞间的相互作用。由图5(B)可以

看到,未改性材料表面生长的细胞硬度(0.19±0.016)mN/m远高于改性后材料细胞

(0.08±0.022)mN/m。

细胞粘附是指细胞与细胞之间或细胞与基底、基质的粘附,并通过粘附分子相互作

用而形成一定的粘附力。当与不同基底发生作用时,细胞表面的杨氏模量会发生很

大变化。杨氏模量越大,细胞越不易变形[18-19]。图5(C)可知改性前材料表面细胞

的杨氏模量(0.05±0.017)kPa仅为改性后材料细胞(0.51±0.125)kPa的1/10,表明

其容易发生形变。

p(HEMA-MMA)作为角膜材料与宿主组织的相容性问题一直是人工角膜的难点

[20-22]。本文考察了角膜基质细胞在改性前后材料表面的粘附情况,并进一步运用

原子力显微镜对改性前后材料表面生长的角膜基质细胞的三维形貌以及力学性能进

行了分析。结果显示,改性后材料的细胞亲和力明显增强,且生长于改性后材料表面

的细胞形貌较为正常,铺展得更为舒展,同时具有更高的粘附力、杨氏模量,以及更低

的硬度。这些形貌以及力学性能上的差异均来源于材料毒性对于细胞骨架的影响,

使细胞骨架发生重排的结果。说明改性后细胞的新陈代谢更加旺盛,而且细胞健康

状态更好。Col/bFGF-p(HEMA-MMA)有望成为人工角膜领域广泛应用的材料。

【相关文献】

[1]HICKSC,CRAWFORDG,pmentandclinicalasssmentofan

artificialcornea[J].ProgressinRetinalandEyeRearch,2000,19(2):149-170.

[2]LEGEAISJM,dgenerationofartificialcornea(BiokproⅡ)[J].Biom

aterials,1998,19(16):1517-1522.

[3]HICKSC,FRCOPHTH,HELENFJ,prosthes:Advancingtowardatrue

artificialcornea[J].SurveyofOphthalmology,1997,42(2):175-189.

[4]SHYHDL,GINGHH,cialcornea:surfacemodificationofsilicone

rubbermembranebygraftpolymerizationofpHEMAviaglowdischarge[J].Biom

aterials,1996,17(6):567-595.

[5]TRAIANV,viewofthedevelopmentofartificialcorneaswithporous

skirtsandtheuofPHEMAforsuchanapplication[J].Biomaterials,2001,22(24):3311-

3317.

[6]XIAL,SAROJINIV,TRAIANV,sis,physicalcharacterization,andbio

logicalperformanceofquentialhomointerpenetratingpolymernetworksponges

badonpoly(2-hydroxyethylmethacrylate)[J].JBiomedMaterRes,1999,47(3):404-411.

[7]DAVIDA,ZOYAG,TRAIANV,ingfordrug-inducedspoliationofthehyd

rogelopticoftheAlphaCorTMartificialcornea[J].ContactLens&Anterior

Eye,2006,29(2):93-100.

[8]严拓,覃百花,敖宁建.p(HEMA-MMA)表面固定I-型胶原和碱性成纤维生长因子(bFGF)改善细胞

相容性的研究[J].高分子通报,2010(待刊出).

[9]严拓,邓华,孙蓉,等.I-型胶原接枝pHEMA/pMMA复合材料的制备[C].天津:全国高分子会议学术

论文报告会论文集,2009:622.

[10]HORBERJKH,ngprobeevolutioninbio

logy[J].Science,2003,302(5647):1002-1005.

[11]HUGELT,HOLLANDNB,CATTANIA,moleculeopomechanicalcyc

le[J].Science,2002,296(5570):1103-1106.

[12]BROCHUH,'smodulusofsurface-boundliposomesbyatomic

forcemicroscopyforcemeasurements[J].Langmuir,2008,24(5):2009-2014.

[13]DIMITRIADISEK,HORKAYF,MARESCAJ,inationofelasticmoduliofthin

layersofsoftmaterialusingtheatomicforcemicroscope[J].BiophysJ,2002,82(5):2798-

2810.

[14]NAGAYAMAM,HAGAH,cchangeoflocalstiffnessdistribution

correlatingtocellmigrationinlivingfibroblasts[J].CellMotilityandthe

Cytoskeleton,2001,50(4):173-179.

[15]LAURENTVM,KASASS,YERSINA,ntofrigidityinthelamellipodiaofm

igratingcellsrevealedbyatomicforcemicroscopy[J].BiophysJ,2005,89(1):667-675.

[16]PIERREHP,KATEP,DETLEFK,chnicalapproachtoquantifycell-

celladhesionforcesbyAFM[J].Ultramicroscopy,2006,106(8/9):637-644.

[17]胡明铅,蔡继业.不同刺激条件下人外周血淋巴细胞超微结构与粘滞力的AFM分析[J].分析测试

学报,2008,27(12):1263-1268.

[18]蔡小芳,杨筱曦,蔡继业,等.正常人眼角膜上皮细胞的原子力显微镜观察[J].分析测试学

报,2009,28(8):881-885.

[19]CAIXiaofang,GAOShijun,CAIJiye,nateinducedmorphologicalandm

echanicalchangesofJurkatcellstudiedbyAFM[J].Scanning,2009,31(2):83-89.

[20]白华,高峰,黄一飞,等.新型PHEMA一体式人工角膜植入碱烧伤兔角膜的实验研究[J].解放军医

学杂志,2003,28(12):1082-1083.

[21]郭萍,陈家祺,王智崇,等.改良PHEMA/PMMA一体化人工角膜治疗兔角膜碱烧伤的实验研究[J].

眼科研究,2006,24(6):593-597.

[22]崔红平,郎莉莉,郑一仁,等.新型PMMA非穿透一体式人工角膜植入兔干眼模型的实验研究[J].

同济大学学报:医学版,2007,28(4):21-24.