specificity

清洁验证分析⽅法的专属性、准确度、精密度要求！

翻译：刘

校对：流浪的沙⼦

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译⾃2020年8⽉份发布的《ISPE基准指南：清洁验证⽣命周期–应⽤，⽅法和控制（ISPEBalineGuide:Cleaning

ValidationLifecycle:Applications,Methods,andControls）》

8AnalyticalandBiologicalAssayMethods

清洁验证分析和⽣物分析⽅法

Testingcleaningvalidationsamplesiscriticaltoprovideanaccuratereprentationofthelevelofcleanlinessof

equipmentbothaftercleaning(APIorformulation;cleaningagentandbioburdenasnecessary)andbefore

u(bioburden).APIresidueistypicallytested,t

methodudmustbevalidatedforthesamplebeingtaken[21].Theprimaryconsiderationforthetestmethodisthatitis

estmethodisnotnsitiveenoughto

testresiduelevelslowerthanthecleaninglimit,themethodnsitivitymustbeenhanced,adifferenttestmethodmust

beemployed,orthemanufacturingequipmentmustbededicated[17].

清洁验证样品的检测对于对于提供设备清洁(API或制剂、清洁剂、⽣物负荷)后和使⽤前（⽣物负荷）的清洁⽔平的准确

表征是⾮常重要的。通常测试API残留，因为它可能是配⽅中的⾼危害成分。所⽤的任何测试⽅法都必须经过取样验证

[21]。测试⽅法的主要考虑是它对低于相关分析物的清洗极限的⽔平敏感。如果测试⽅法不够灵敏，⽆法进⾏现场测试

任何⽤于测试⽬标样品的⽅法均应被验证，检测⽅法⾸要考虑的是其灵敏度应低于被检测物的清洁限度。如果试验⽅法

灵敏度不够，⽆法检测低于清洁限度的残留物⽔平，则⽅法灵敏度必须提⾼，或者采⽤其他⽅法，或⽣产设备专⽤。

Aspecificmethod(e.g.,HPLC)ispreferredbyregulatoryagencies[17],butanon-specificmethod(e.g.,TOC)canbe

dentestingisoftenconductedbycompendialmethodsasageneraltest,withindividualspecies

identifiedasnecessary.

监管机构通常⾸选专属性的⽅法（如HPLC)，但⾮专属性的⽅法（如TOC)也可能可以接受，⽣物负荷检测经常采⽤药

典⽅法，必要时进⾏菌种鉴定。

Theanalyticalperformancecharacteristics,orvalidationparameters,shouldconformtothodefinedbyICHQ2[107]:

accuracy,precision,specificity,LOD,LOQ,linearity,range,robustness,andrecovery(eSection8.1).Definitionsof

theparametersareshowninTable8.1.

分析性能特征或验证参数应符合ICHQ2（107）的要求，包括准确度、精密度、专属性、LOD、LOQ、线性、范围、耐

⽤性和回收率（见8.1章），这些参数的定义见表8.1。

8.1AnalyticalMethods

分析⽅法

8.1.1ValidationParameters

验证参数

ValidationparametersaredescribedinTable8.1.

验证参数的描述见表8.1

Table8.1:ICHQ2ValidationParameterDefinitions[107]

Table8.1:ICHQ2ValidationParameterDefinitions[107]

表8.1ICHQ2验证参数定义（107）

Parameter

参数

Definition

定义

Accuracy

准确度

“Expresstheclonessofagreementbetweenthevaluewhichisacceptedeitherasa

conventionaltruevalueoranacceptedreferencevalueandthevaluefound”

表⽰真实值或认可的参考值与测量值之间的相近程度。

Precision

精密度

“Expresstheclonessofagreement(degreeofscatter)betweenariesofmeasurements

obtainedfrommultiplesamplingofthesamehomogeneoussampleundertheprescribed

conditions

是指规定条件下对均质样品多次取样进⾏⼀系列检测结果的接近程度（离散程度）

•Repeatability–theprecisionunderthesameoperatingconditionsoverashortintervaloftime.

Repeatabilityisalsotermedintra-assayprecision.

重复性——指在同样的操作条件下，在较短时间间隔的精密度：也称为间隙测量精密度（Intra-

assayprecision）

•IntermediatePrecision–within-laboratoriesvariations:differentdays,different

analysts,differentequipment,etc.

中间精密度——是指实验室内部条件改变，如不同⽇，不同试验分析者，不同仪器等情况下的精

密度。。

•Reproducibility–expresstheprecisionbetweenlaboratories(collaborativestudies,usually

appliedtostandardizationofmethodology)”

重现性是指不同试验室之间的精密度（合作研究，通常⽤于⽅法学的标准化）。

Specificity/Selectivity

专属性/选择性

“Specificityistheabilitytoasssunequivocallytheanalyteintheprenceof

componentswhichmaybeexpectedtobeprent.”

专属性是指可能存在某些组分时，对被分析物准确可靠测定的能⼒。

DetectionLimit

(LOD)

检测限

“Thelowestamountofanalyteinasamplewhichcanbedetectedbutnotnecessarilyquantitated

asanexactvalue”

样品中的被分析物能够被检测到的最低量，但不⼀定要准确定量。

QuantitationLimit

(LOQ)

定量限

“Thelowestamountofanalyteinasamplewhichcanbequantitativelydeterminedwithsuitable

precisionandaccuracy”

是指在合适的准确性和精密度下，能够定量测定样品中被分析物的最低量。

Linearity

线性

“Theability(withinagivenrange)toobtaintestresultswhicharedirectlyproportionaltothe

concentration(amount)ofanalyteinthesample”

是指在给定的范围内检测结果与样品中被分析物的浓度（量）成⽐例关系的能⼒。

Range

范围

“Theintervalbetweentheupperandlowerconcentration(amounts)ofanalyteinthesample

(includingtheconcentrations)forwhichithasbeendemonstrated

thattheanalyticalprocedurehasasuitablelevelofprecision,accuracyandlinearity”

是指样品中被分析物的较⾼浓度(量)和较低浓度(量)的⼀个区间，并已证实在此区间内，该⽅法具

有合适的准确性、精密度和线性。

Robustness

耐⽤性

“Ameasureofitscapacitytoremainunaffectedbysmall,butdeliberatevariationsinmethod

parametersandprovidesanindicationofitsreliabilityduringnormalusage”

是指试验参数适当地发⽣细⼩改变时，测量保持不受影响的能⼒，可⽤于说明正常使⽤时的可靠

性。

Ruggedness

重现性

Thedegreeofreproducibilityoftestresultsobtainedbytheanalysisofthesamesamplesundera

varietyofnormaltestconditionssuchasdifferentlaboratories,analysts,instruments,reagents

lots,ordays

是指样品在正常的测试条件下在不同试验室，分析员、分析仪器、试剂批号、⽇期所获得分析结

果的重现程度

8.1.1.1Accuracy

准确度

Accuracydeterminestheclonessoftestresultstothetruevalueacrosstherange[107].

准确度决定了测试结果在⼀定范围内与真实值的接近程度

Samplextractedintosolutionsaremeasuredandcomparedtostandardsolutionsatcomparableconcentrationsto

aningvalidationsamples,accuracyismeasuredthroughrecoveryofsamplesfrom

equipmencyshouldbe

mpleisthreerecoverylevelsintriplicate,foratotalofnine

recoveries(eChapter7).Accuracyisreportedas%recoveryoftheamountofanalyteintherecoveredsamples

measuredagainsttheamountofanalytespikedontothesamplerecoverysurface.

测定提取溶液中的样品并与同等浓度的标准溶液进⾏⽐较，以确定准确度。对于清洁验证样品，准确度是通过从设备表

⾯回收样品并将回收样品提取到测试溶液中进⾏测量，建⽴准确度应使⽤⾜够数量的数据。⼀种⽅式是三个回收⽔平，

每个⽔平三份，总共九个回收样（见第7章）。准确度报告为回收样品中被测物相⽐取样表⾯上所涂布的量的%回收

率。

AccuracyshouldbedeterminedaroundtheARL,whichisthepointaroundwhichaccuratedataismost

r,forarelativelysafeproduct,mple:

准确度应在可接受残留限度上测定，在可接受限度附近得到准确数据是最重要的。然⽽，对于相对安全的产品，可接受

残留限度可能相对较⾼。例如:

•Typicalaccuracyat75%,100%,and125%ofARL

典型的准确度在可接受残留限度的75%、100%和125%

•IfARL>100µg/25cm2swab,performrecoveryaround100µg/25cm2

如果可接受残留限度>100µg/25cm2,则在100µg/25cm2左右进⾏回收测试

•AdvisabletoextendlinearityuptoARLtounderstandpossiblemethodlimitations

建议将线性扩展到可接受残留限度以了解可能的⽅法限制

•AdvisabletoextendaccuracydowntomethodLOQandonetothreelevelsinbetween,whichiswheremostdata

shouldbe

建议将准确度向下延伸到检测限，采⽤介于两者之间的⼀到三个级别，⼤多数数据都在该区间

8.1.1.2Precision

精密度

Precisiondeterminesthedegreeofagreementamongindividualtestresultsappliedrepeatedlytomultiplesamples

fromahomogeneoussample[107].Itisameasureofthecombinedvariabilityofthesamplerecovery,thesample

extraction,ionmaybeconsideredatthreelevels:repeatability,

IntermediatePrecision(IP),parametersoftherecoveryprocess(eChapter7)canaffectthe

recovery

istocontrolsampleparametervariabilityasmuchaspossible.

精密度是测定从⼀个均质样本中重复取出多个样品，每个样品的测试结果之间的⼀致程度【107】，它是对样品回收

率、样品提取和样品测量的综合变异性的⼀种度量。精密度可以考虑三个层次：重复性、中间精密度(IP)和重现性。恢

复过程的所有参数(见第7章)都会影响样品的恢复。关键是尽可能控制样本参数的可变性。回收过程的所有参数（见7

章）均能影响样品的回收，尽可能控制样品参数的变化⾮常重要。

Duringswabsamplemethodvalidation,asufficientnumberofrecoverysamplesshouldberuntohaveastatistically

plesudforaccuracydeterminationarealsoudforprecision.

在擦拭样品⽅法验证过程中，应运⾏⾜够数量的回收样品，以便得到⼀个某种程度上的变量测试具有统计学意义的

RF（回收因⼦）值。⽤于准确度测定的样品也⽤于精密度测定。

Thereilitymeasuredas%RSDisoften

udwithalimitof≤15%forswabsamples.

对于清洁样品的精密度没有官⽅可接收标准。对于擦拭样品，以%RSD来衡量的变异性通常使⽤限度为≤15%。

PrameterDefinition

8.1.1.3Specificity

专属性

Specificitydeterminestheabilitytoassstheanalyteintheprenceofcomponentxpectedtobeprentinthe

samplematrix[107].Forcleaningsamples,theexpectedcomponentsaretheotheringredientsoftheformulation,

potentialdegradants,andthecleaningagent.

专属性决定了在样品中存在预期成分的情况下评估分析物的能⼒[107]。对于清洁样品，预期的成分是配⽅的其他成分、

潜在降解物和清洁剂。

Specificityisthecapabilityofamethodtoparateknowndegradantsidentifiedduringproductdevelopmentand

bilityoftheanalyteinalkalineoracidicsolutionsshouldbe

ghtheabilitytodetectdegradantsis

necessary,antsarestructurallyrelatedtotheanalyteandremovedto

heyarealowleveltobeginwith,theriskoftheirprenceinapost-cleaning

sampleshouldbeminimal.

Anexceptiontothiproachcanbe

leveragedtoeliminateallanalytefromtheresidueandthentheprimarydegradant(s)shouldbemonitored,its

pharmacologicalactivitydetermined,andappropriatecleaninglimitstablishedasnecessary.

此⽅法的⼀个例外是已知分析物在清洁溶液中降解。此⽅法可⽤于从残留物中消除所有分析物，然后监测主要降解物，

确定其药理活性，并在必要时建⽴适当的清洁限度。

Aspecificmethod(e.g.,HPLC)shouldbeabletodistinguishthespecificanalyteofinterestfromtheothermatrix

-specificmethod(e.g.,TOC)isnotabletodistinguishbetweentheanalyteofinterestandother

ore,whenusingTOC,allmeasuredresiduehastobeassumedtobetheanalyte

dTOCgenerallyhavecomparablensitivity,soeitherapproachisacceptableifitcanmeasureto

esarealsocomparablebuteachtechnologycanushortenedanalysistimes.

专属的分析⽅法（如HPLC)应能从其他多个成分中分辨出特定的⽬标物，⾮专属的分析⽅法（如TOC）不能分辨⽬标物

和其他同样的多个成分。因此，当使⽤TOC时，所有测得的残留都被当成⽬标物。HPLC和TOC通常有相当的灵敏度，

因此如果能检测到低于可接受清洁残留限度的值，则两种⽅法都是可接受的。运⾏次数也是相当的，但每种⽅法均应使

⽤较短的分析时间。

Table8.2:AdvantagesandDisadvantagesofSpecificandNon-SpecificMethods专属和⾮专属分析⽅法的优缺点

TestMethod

分析⽅法

Advantage

优势

Disadvantage

劣势

Specific(e.g.,

HPLC)

专属分析⽅法（如

HPLC)

•Separatesanalyteofinterestfrommatrix

components

从其他多个成分中分辨出特殊⽬标物

•Canbetestedinalowervolumeto

increansitivity

能在较低体积下进⾏测试，以提⾼灵敏度

•NotasvariableasTOC

不像TOC那般变异性

•Notlimitedbyswabsolvent

不受擦拭溶剂限制

•Newerinstrumentshaveshorterrun

times

新型的分析仪器可缩短运⾏时间

•Longermethoddevelopmenttimeline

较长的分析⽅法开发时间

•Individualinjectionscanbelengthy

单个进样时间可能较长

•Allinstrumentresponisassumedtobetheanalyte

Non-Specific(e.g.,

TOC)

⾮专属分析⽅法（如

TOC）

•Shortermethoddevelopmenttimeline

较短的分析⽅法开发时间

•Newerinstrumentshaveshorterrun

times

新型的分析仪器可缩短运⾏时间

•Allinstrumentresponisassumedtobetheanalyte

ofinterest

仪器上的所有响应都被当成⽬标分析物

•Generallyrequiresagreaterdilutionfactor,which

couldlimitnsitivity

通常需要更⼤的稀释因⼦，这可能限制灵敏度

•Variablerespon,particularlyatlow

levels(ppbrange)

响应变异性⼤，特别是在低存在⽔平时（ppb级）

•Swabsolventlimitedtoaqueous

擦拭溶剂仅限于⽔

Disvantage

8.1.1.4LOQ/LOD

定量限/检测限

LOQ(alsoknownasQuantitationLimit)isthelowestamountofanalytethatcanbedeterminedwith

acceptableaccuracyandprecisionunderthestatedexperimentalconditions,whileLOD(alsoknownasDetection

Limit)isthelowestamountofanalytethatcanbedetectedunderthestatedexperimentalconditions[107].

LOQ（也被称为定量限）是指在规定的实验条件下和可接受的准确度和精密度下能被确定的最低分析物的量，LOD（也

被称为检测限）是指在规定的实验条件下能被检测到的最低分析物的量。

8.1.1.5Linearity

线性

Linearityistheabilityofanassaytoelicitadirectandproportionalrespontochangesinanalyteconcentration[107].

线性是指含量对于分析物浓度变化产⽣直接和成⽐例响应的能⼒。

8.1.1.6Range

范围

Rangeistheintervalbetweentheupperandlowerlevelsofanalytethathasbeendemonstratedtobedeterminedwith

asuitablelevelofprecision,accuracy,andlinearity[107].

范围是指样品中被分析物的较⾼浓度(量)和较低浓度(量)的⼀个区间，已证实在此区间内，该⽅法具有合适的准确性、精

密度和线性。

8.1.1.7Robustness

耐⽤性

Robustnessisthemeasureofthecapacitytoremainunaffectedbysmallbutdeliberatevariationsin

proceduralparameters,forexample,changesto[107]:

耐⽤性是指试验参数适当地发⽣细⼩改变时，检测能⼒仍然不受影响，例如，下列变化：

•Mobilepha

•流动相

•Columntemperature

•柱温

•Wavelength

•波长

•Injectionvolume

•进样体积

•Samplesolvent

•样品溶剂

8.1.1.8IntermediatePrecision(IP)/Ruggedness/Reproducibility

中间精密度（IP)/重现性/重复性

Ruggednessisthedegreeofreproducibilityoftestresultsobtainedbytheanalysisofthesamesamplesunderavariety

ofnormaltestconditionssuchasdifferentinstruments,analysts(calledIP),laboratories(calledreproducibility),

reagentslots,ordays[107].

是指样品在正常的测试条件下在不同分析仪器，分析员（称为IP）、试验室（称为重复性）、试剂批号、⽇期所获得分

析结果的重现程度

8.1.1.9SolutionStability(Sample/Standard)

溶液稳定性（样品/标准品）

Solutionstabilityisthemeasureofhowlongstandardandsamplescanberetainedandcontinuetodemonstrate

consistentdetectorrespon.

溶液稳定性是指衡量标准品和样品的保存时间并持续表现出⼀致的检测器响应的能⼒。

•Standardsolution

•标准溶液

•Samplesolutionafterextraction

•提取后的样品溶液

•Samplebeforeextraction(swab)

•提取前的样品（擦拭）

•Driedsampleonthecoupon

•⼲燥样品

8.1.2Methodology

⽅法学

Threspecificandnon-specific

ficmethodcandist-

specificmethodmeasurestheanalyteofinterestalongwithothercomponentsofthematrixthatelicitaresponfrom

hodofchoiceisbadonthemostappropriateforthespecificcircumstances,firstconsidering

tmethodsrequirevalidation.

有各种⽅法⽤于测试清洁验证样品，专属性的和⾮专属性的，专属性的⽅法能从样品的其他成分中分辨出⽬标分析物，

⾮专属性的⽅法⽬标分析物与测试⽅法中产⽣响应的其他多个成分⼀道被测试，⽅法的选择基于最适宜的具体情况，⾸

⾮专属性的⽅法⽬标分析物与测试⽅法中产⽣响应的其他多个成分⼀道被测试，⽅法的选择基于最适宜的具体情况，⾸

先考虑专属⽅法，其次是⾮专属⽅法。所有测试⽅法应被验证。

8.1.2.1SpecificTestMethods

专属检测⽅法

HofHPLCfortestingcleaning

validatachromatographicmethod

thatpassasamplethroughapackedcolumnandparatestheanalyteofinterestfromtheothercomponentsofthe

methodcanparatetheresidueofinterestfromthecomponentsoftheformulationaswellasthe

-designedHPLCrecoverystudycandemonstrateaccuracy,precision,linearity,range,LOD,and

LOQinasinglerun.

HPLC是清洁验证中最常的专属检测⽅法，HPLC⽤于检测清洁验证样品是公认的，能解决所有的验证参数。HPLC是⼀

种⾊谱⽅法，该⽅法通过将样品流过装填好的柱⼦将⽬标分析物从样品的其他成分中分离出来。⼀个HPLC⽅法能从制

剂的多成分及清洁剂中分离出⽬标残留物，⼀个设计良好的HPLC⽅法的回收率研究能证明准确度、精密度、范围、检

测限和定量限。

Typically,HPLCmethodsforassayaredesignedtoquantitatelevelsdownto0.1%oftheAPI,makingnsitivitywell

r,thensitivityofHPLCisdependentonthechemicalstructureoftheresidueof

interestandthedetector,whichcanquantitatetheresidue.

通常，HPLC分析⽅法被设计⽤于定量0.1%的API⽔平，使灵敏度远低于⼤多数计算的可接受清洁残留⽔平。然

⽽，HPLC的灵敏度依赖于⽬标残留物的化学结构和检测器。

HPLCassaymethodscanbelengthy,30to40minperinjection,whichcouldbeanissueforquickturnaroundof

samples.

HPLC分析⽅法可能时间较长，每次进样为30到40分钟，可能是快速样品周转的⼀个问题。

UofotherspecifictestmethodssuchasGC,MS,orIRcanbeudincertainsituationsandaresubjecttothesame

validationparameters.

使⽤其他的专属检测⽅法，如GC,MS或IR可⽤于某种特定条件下并且遵从于同样的验证参数。

8.1.2.2Non-SpecificTestMethods

⾮专属的检测⽅法

TOCilysisinvolvestheoxidation

ivityisdowntotheppmorppblevel.A

well-designedTOCrecoverystudycanalsodemonstrateaccuracy,precision,linearity,range,LOD,andLOQina

singlerun.

TOC是清洁验证中最常⽤的⾮专属性检测⽅法，TOC分析包含了碳的氧化和产⽣的⼆氧化碳的检测。灵敏度可低⾄ppm

或ppb，⼀个设计良好的TOC回收率研究也能证明准确度、精密度、线性、范围、检测限和定量限。

InaTOCanalysis,allorganiccarbonisdetected;therefore,anyresiduedetectedmustbeconsideredtheresidueof

nlimittheeffectivelinearrangeoftheresidue

assay.

在⼀个TOC的分析中，所有的有机碳均能被检测，因此，检测到的残留⼀定会被认为是⽬标残留，⽤于TOC分析的残留

必需是溶于⽔的，这就限制了残留物含量的有效线性范围。

Uofothernon-specifictestmethodssuchaspHorconductivitycanbeudincertainsituationsandrequireonly

Uofothernon-specifictestmethodssuchaspHorconductivitycanbeudincertainsituationsandrequireonly

instrumentcalibration.

⾮专属检测⽅法如pH或电导率能⽤于某种特定条件下，只需要仪器校准。

Uofothernon-specificmethods(,conductivity)canbeappliedincertainsituationsifastrongscientific

justificationisprovidedtoensureitisappropriateandprovidesthenecessarycontrolsforaneffectivecleaningprocess.

在某些特定条件下，如果提供了有⼒的科学依据以确保其适⽤，并为有效的清洁过程提供必要的控制，则可使⽤其他⾮

专属的⽅法（例如pH值、电导率）。

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