何钢

２００８年第２期

生物技术通报

ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ・综述与专论・

收稿日期：２００７－１０－１３

基金项目：生物环境科学与技术研究所科研启动项目“纳米生物技术在重金属污染生物修复中应用的研究”（编号：０６Ａ０２）

作者简介：刘义（１９８２－），男，湖南衡阳人，硕士研究生，研究方向：生物化学与分子生物学专业

通讯作者：何钢（１９６５－），男，湖南湘潭人，教授，硕士，从事生物技术教学和科研；Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｅｇｏｎｇ２６２＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ

当前我国农业环境恶化现象十分严重，据统

计，我国每年因重金属污染导致的粮食减产超过

１０００万ｔ，被重金属污染的粮食多达１２００万ｔ，合

计经济损失至少２００亿元。据农业部环境监测系统

近年的调查，当前我国大多数城市土壤都受到了不

同程度的污染，污染面积近１０００万ｈｍ２。锌是一种

重要的污染来源［１］。

对锌工业污染的治理，传统的方法有化学沉淀

法、电解法、离子交换法和膜技术分离法等，这些方

法最突出的缺点在于处理低浓度废水时，操作繁

琐，运行费用较高，能耗大，且易造成二次污染。而

以耐锌细菌对锌化合物的特异性转化为基础的生

物吸附法却具有经济、高效，无二次污染等优点，尤

其适于处理低浓度污染或大面积污染等，促使人们

转而分离耐锌菌株，研究抗锌机制，并探索将其应

用于生物修复的可行性［２］。

１耐锌菌株的锌抗性机制

作为对锌污染全球性蔓延的反应，许多微生物

进化出一套耐锌基因系统以适应在含锌环境中的

生存，称为锌抗性基因。其机理为：锌抗性基因编码

蛋白－ＡＢＣ（ＡＴＰｂｉｎｄｉｎｇｃａｓｓｅｔｔｅ）蛋白家族以依赖能

量的方式而实现对锌的输出，有的输出系统是ＡＴＰ

酶，有的是阳离子或质子反向转运体［３］。

ＡＢＣ家族首次在革兰氏阴性菌中发现，到

１９９０才在革兰氏阳性菌中发现［３］。ＡＢＣ家族包括１００

多种膜转运体或通道，涉及到许多功能，如有毒物

细菌的锌抗性基因及其在生物修复中的应用

刘义１，２何钢１，２陈介南１周再魁１王义强１，２

（１中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所，长沙４１０００４；

２中南林业科技大学生命科学与技术学院，长沙４１０００４）

摘要：随着工业时代的发展，人源性排放已成为环境锌污染的主要来源。这不但破坏了生态系统的稳定，更经食

物链富集，对人类健康造成严重威胁。利用含锌抗性基因的（重组）细菌等进行锌治理是生物修复的途径之一。阐述了细菌

锌抗性基因的结构、表达产物和一些相关的作用机制，展望其在生物修复方面的应用。

关键词

：细菌锌抗性基因生物修复

Ｚｉｎｃ－ＲｅｓｉｓｔａｎｔＧｅｎｅｏｆＢａｃｔｅｒｉａｉａａｎｄＩｔｓＥｆｆｅｃｔｉｎ

ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ

ＬｉｕＹｉ１，２ＨｅＧａｎｇ１，２ＣｈｅｎＪｉｅｎａｎ１ＺｈｏｕＺａｉｋｕｉ１ＷａｎｇＹｉｑｉａｎｇ１，２

（１ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣｅｎｔｒａｌＳｏｕｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，

Ｃｈａｎｇｓｈａ４１０００４；２ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣｅｎｔｒａｌＳｏｕｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，

Ｃｈａｎｇｓｈａ４１０００４）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｉｔｈｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｉｎｄｕｓｔｒｙ，ｔｈｅｍａｉｎｒｅｓｏｕｒｃｅｏｆｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｚｉｎｃ－ｐｏｌｌｕｔｉｏｎｗａｓｍａｎ’ｓｄｉｓｃｈａｒｇｅ．Ｔｈｉｓ

ｎｏｔｏｎｌｙｄｅｓｔｒｏｙｅｄｔｈｅｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｅｃｏｌｏｇｙｂｕｔａｌｓｏｐｏｓｅｄａｓｅｒｉｏｕｓｔｈｒｅａｔｔｏｍａｎ’ｓｈｅａｌｔｈｂｙｆｏｏｄｃｈａｉｎ．Ｏｎｅｗａｙｔｏｃｏｎｔｒｏｌ

ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｚｉｎｃ－ｐｏｌｌｕｔｉｏｎｗａｓｔｈｅｕｓｉｎｇｏｆｂａｃｔｅｒｉａｗｉｔｈｚｉｎｃ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｎｅ．Ｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、ｐｒｏｄｕｃｔ、ｍｅｃｈａｎｉｓｍａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ

ｉｎｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎｏｆｚｉｎｃ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｎｅｗｅｒｅｒｅｆｅｒｒｅｄｔｏ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＢａｃｔｅｒｉａＺｉｎｃ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｎｅＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ

生物技术通报ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｕｌｌｅｔｉｎ２００８年第２期

质的外排，营养物质的吸收，离子、肽转运和信号传

递。广泛存在细菌、植物、动物中［４］。ＡＢＣ家族转运

体结构包括４个核心区域，一般这４个核心区域都

是作为一个独立的多肽而被编码，而且，这４个区

域彼此分离，推测有一个区域具有这个转运体的全

部功能［５］（图１）。

ＡＢＣ转运蛋白（图２）是在进化过程中非常保

守，其中ＮＢＤｓ在各种有机体中，高度保守［６］。大多

数细菌利用带有溶质结合蛋白的ＡＢＣ转运体而实

现对Ｚｎ２＋的高吸收。

２锌抗性基因的结构和表达

２．１位于质粒上的锌抗性基因结构和表达

革兰氏阴性细菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ．ｅｕｔｒｏｐｈａ是锌抗性

基因位于质粒上的主要代表，同时也是兼性化能无

机营养菌的代表。这种营养菌适应性很强，对重金

属离子具有很高的抗性水平。该菌种一般都携带抗

锌质粒：ｐＭＯＬ３０。抗锌ｃｚｃ操纵元位于ｐＭＯＬ３０质

粒上。Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ有很多金属抗性系统：３个锌抗性

系统，一个铬酸盐抗性系统，两个二价阳离子抗性

系统。其中阳离子抗性系统包括一个抗锌的ｃｚｃ基

因抗性系统和一个抗Ｎｉ和Ｃｏ的ｃｎｒ基因抗性系

统。

２．１．１Ｒａｌｓｔｏｎｉａ．ｅｕｔｒｏｐｈａ锌抗性基因ｃｚｃＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａ

ｃｚｃＮＩＣＢＡＤＲＳ抗锌基因家族包括８个ＯＲＦ编码多肽

ＣｚｃＮ，ＣｚｃＩ，ＣｚｃＣ，ＣｚｃＢ，ＣｚｃＡ，Ｃｚ，ＣｚｃＲ和ＣｚｃＳ。ＣｚｃＣ、

ＣｚｃＢ和ＣｚｃＡ蛋白构成一种含３个组成部分的化学

渗透的反向转运体输出系统，这种输出系统可以实现

离子输出，并导致细胞膜外的碱性增强，最终形成金

属碳酸盐沉淀。生产上已经利用这个特点来处理工业

废水［８］。

２．１．２锌抗性基因表达蛋白ＣｚｃＣｚｃ输出泵由内

膜（ＣｚｃＡ）、外膜（ＣｚｃＣ）和跨膜（ＣｚｃＣ）组成，它们共

同发挥作用运送细胞外（图３）。其中ＣｚｃＡ是一个

中心蛋白和质子泵

，属于一种阳离子反向转运体。

ＣｚｃＢ是离子结合亚基，ＣｚｃＣ是一种修饰蛋白，这种

修饰蛋白能决定结合金属底物的特异性。ｃｚｃＮ和

ｃｚｃＩ是ｃｚｃ操纵元的上游调节序列，ｃｚ，ｃｚｃＲ和

ｃｚｃＳ是ｃｚｃ操纵元的下游调节序列［９］。

２．２位于染色体上的锌抗性基因结构和表达

革兰氏阴性细菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ原称

绿脓杆菌，是锌抗性基因位于染色体上的主要代

图１ＡＢＣ转运体的结构［５］

ＡＢＣ蛋白包含一个由ＴＭＤｓ（ｔｗｏｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｃｅｄｏｍａｉｎｓ）

形成的水孔，该水孔在细胞膜外侧形成一个很大的开口；

ＮＢＤｓ（（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎｓ蓝色部分）在细胞膜内

侧靠近ＴＭＤｓ并有部分镶嵌在细胞膜内

图２ＡＢＣ蛋白转运底物［７］

①没有结合的ＡＢＣ蛋白识别底物②结合ＡＴＰ③结合的

ＡＴＰ促使底物进入膜内通道，这个过程伴随快速的ＡＴＰ

水解反应④ＡＢＣ同源二聚体分离，回到原始状态

图３Ｃｚｃ模型［８］

质子／阳离子反向转运体由内膜（ＣｚｃＡ）、外膜（ＣｚｃＣ）和跨

膜（ＣｚｃＣ）组成

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２００８年第２期

表。在自然界分布广泛，为土壤中存在的最常见的

细菌之一。对重金属离子也具有很高的抗性水平。

其抗锌基因编码蛋白与Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ中ｃｚｃ基因编码

的蛋白很相似。为了区别，有时也称Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ中

抗锌基因为ｃｚｒ基因。

２．２．１Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ锌抗性基因ｃｚｒｃｚｒ

基因包括５个：ｃｚｒＳ，ｃｚｒＲ，ｃｚｒＣ，ｃｚｒＢ，ｃｚｒＡ（图４）。约

长１２．８ｋｂ。预测基因ｃｚｒＳ、ｃｚｒＲ编码蛋白与传感调

节蛋白ＣｏｐＳ／ＣｏｐＲ和ＰｃｏＳ／ＰｃｏＲ（由质粒上的抗Ｃｕ

基因编码）具有明显的相似性。克隆的ｃｚｒ序列包

含ｃｚｒＣＢＡ下游的ＯＲＦ序列，其预测基因产物涉及

到芳香族化合物的分解作用。ｃｚｒ基因有很强的保

守性，且定位于菌株Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ染色体上２４００ｋｂ

和２５５０ｋｂ之间。

２．２．２锌抗性基因表达蛋白ＣｚｒＣｚｒＣ蛋白与Ｒ．

ｅｕｔｒｏｐｈａ的ＣｚｃＣ、Ｃｎｒ和Ｎｃｃ蛋白功能非常相似，所

以也与代谢产物或有毒物质输出的外层膜因子有

高度的同源性。最明显的特征是ＣｚｒＣ的氨基酸序

列的Ｎ端有一个脂蛋白信号肽剪接位点［１０］。

ＣｚｒＢ显示了与细菌膜融合蛋白（有助于阳离

子、有毒物质、代谢产物等转运输出）有非常明显的

同源性。ＣｚｒＢ的Ｎ端更短，这样就缺失了锌结合位

点的富集Ｈｉｓ的单元，但是，这些富集Ｈｉｓ的单元

并不是必须的［１１］。

ＣｚｒＳ和ＣｚｒＲ蛋白与云南烟草野火病病原细菌

Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅ质粒编码的Ｃｕ抗性蛋白ＣｏｐＳ

和ＣｏｐＲ、Ｅ．ｃｏｌｉ中ＰｃｏＳ和ＰｃｏＲ的Ｃｕ抗性蛋白、Ｒ．

ｅｕｔｒｏｐｈａ－ｌｉｋｅＣＨ３４的有非常高的相似性。ｃｚｒＳ和

ｃｚｒＲ基因在ｃｚｒＣ基因上游５００ｂｐ处，预测编码蛋白

有２２４和４７２个氨基酸，与细菌两种自磷酸化成份

有明显的相似性。通过分析ＣｚｒＲ氨基酸序列，发现

其具有保守的调节天冬氨酸活性的自磷酸化位点。

第６种ＯＲＦ编码的蛋白，在ｃｚｒＡ基因的下游，

与Ｅ．ｃｏｌｉ转录促进子家族Ｘｙ１Ｓ蛋白有６２％￣７４％

的相似性，这种苯甲酸甲苯金属剪接途径的转录激

活因子被不同的ＴＯＬ质粒编码。第７种ＯＲＦ，是从

第６个ＯＲＦ下游的２０ｂｐ处开始，并显示了与检测

苯甲酸甲苯的ｘｙｌＸ和ｂｅｎＡ基因有很高的相似性。

ｃｚｒＳＲ基因的下游和边缘序列，是ＯＲＦ８的一部分，

预测ＯＲＦ８编码蛋白的氨基酸序列与Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ

ＰＡＯ１有毒物质排出系统的ＯｐｒＭ有很高的相似

性。

ｏｒｆ７和ｏｒｆ９，目前没有发现与之有相似性的

ＯＲＦ。Ｏｒｆ８和ｏｒｆ９转录方向与ｃｚｒＳＲ基因相反［１２］。

ｃｚｒ系统和上述ｃｚｃ，ｃｏｐ和ｐｃｏ系统最主要的

区别在于调节基因的位置和转录的起始方向。在Ｐ．

ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ中，ｃｚｒＳＲ处于ｃｚｒＣＢＡ基因的上游，而且

是从相反的方向开始转录

，而ｃｏｐＲＳ，ｐｃｏＲＳ和

ｃｚｃＲＳ被定位于金属抗性基因的下游，两个基因同

方向并由一个相同的启动子起始转录。

３锌抗性基因的转移

虽然目前已分离到的耐锌菌不少，但真正能够

大规模直接用于生物治理的却不多，比如有些菌营

养要求较高或增殖周期长，有些菌降解能力偏低不

能满足实际应用等。随着近年来分子生物学技术的

飞速发展

，人们已能按自己的意愿，运用基因工程

技术构建具有超强锌富集能力及高选择性的基因

重组植物及微生物。其分子机制就在于锌抗性基因

的可转移性，而且实验证实：耐锌质粒的转化能赋

予宿主菌与野生型相似的耐锌性。

４耐锌菌株在生物修复方面的应用

耐锌菌株的分离以及基于锌操纵元的转移性

所构建的基因工程植物和微生物为锌污染的生物

治理提供了丰富的物质基础。目前开展的工作主要

图４Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ抗锌操纵元的克隆和基因结构［１３］

Ａ：ｃｚｒ带有ｐＬＡＦＲ３重组粘粒，ｐＭＯＬ８６４，ｐＭＯＬ８６５，

ｐＭＯＬ８６６，ｐＭＯＬ８６７，ｐＭＯＬ８６４亚克隆以及ＣＭＧ１０３＃１３功能

互补锌和抗性序列的限制性酶切图谱；Ｂ：ｐＭＯＬ８８８详细的限

制性图谱和ＯＲＦ的位置，从图中还可以看出转录的方向

刘义等：细菌的锌抗性基因及其在生物修复中的应用

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生物技术通报ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｕｌｌｅｔｉｎ２００８年第２期

１７丁明文，兰恭赞，李海群．畜牧兽医杂志，２００１，２０（５）：２０￣２３．

１８ＷａｔａｎａｂｅＴ，ＳｈｉｎｔａｎｉＡ，ＮａｋａｔａＭ，ｅｔａｌ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，１９９４，２６９

（１３）：９９６６￣９９７３．

１９ＬｅｅＤＣ，ＦｅｎｔｏｎＳＥ，ＢｅｒｋｏｗｉｔｚＥＡ，ｅｔａｌ．ＰｈａｒｒｎａｃｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ，

１９９５，４７：５１￣８５．

２０ＲａａｂＧ，ＫｌａｇｓｂｒｕｎＭ．ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ，１９９７，１３３３（３）：

１７９￣１９９．

２１ＡｋａｇｉＭ，ＹｏｋｏｚａｋｉＨ，ＫｉｔａｄａｉＹ，ｅｔａｌ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９５，７５（６）：１４６０￣

１４６６．

２２Ａｒｔａｖａｎｉｓ－ＴｓａｋｏｎａｓＳ，ＲａｎｄＭＤ，ＬａｋｅＲＪ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８４（５４１５）：

７７０￣７７６．

２３ＨｕｒｓｈＤＡ，ＡｎｄｒｅｗｓＭＥ，ＲａｆｆＲＡ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７，２３７：１４８７￣１４９０．

２４Ｄｅｌｑａｄｉｌｌｏ－ＲｅｙｎｏｓｏＭＧ，ＲｏｌｌｏＤＲ．ＨｕｒｓｈＤＡ，ｅｔａｌ．ＪＭｏｌＥｖｏｌ，

１９８９，２９：３１４￣３２７．

２５ＲａｍａｃｈａｎｄｒａｎＲＫ，ＧｏｖｉｎｄａｒａｊａｎＶ，ＳｅｉｄＣＡ，ｅｔａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ

Ｄｙｎａｍｉｃｓ，１９９５，２０４：７７￣８８．

２６ＹａｎｇＱ，ＡｎｇｅｒｅｒＬＭ，ＡｎｇｅｒｅｒＲＣ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９，２４６，８０６￣８０８．

２７ＧｒｉｍｗａｄｅＪＥ，ＧａｑｎｏｎＭＬ，ＹａｎｇＱ，ｅｔａｌ．ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙ，

１９９１，１４３：４４￣５７．

２８ＹａｍａｓｕＫ，ＷａｔａｎａｂｅＨ，ＫｏｈｃｈｉＣ，ｅｔａｌ．ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ，１９９５，

２２８，５１５￣５２３．

２９ＫｉｎｏｓｈｉｔａＫ，ＦｕｊｉｉＹ，ＦｕｊｉｔａＹ，ｅｔａｌ．ＤｅｖｅｌｏｐＧｒｏｗｔｈＤｉｆｆｅｒ，１９９２，

３４，６６１￣６６８．

３０ＭｉｚｕｎｏＮ，ＵｅｍｕｒａＩ，ＹａｍａｓｕＫ，ｅｔａｌ．ＧｒｏｗｔｈＤｉｆｆｅｒ，１９９３，３５：

５３９￣５４９．

３１ＹａｍａｓｕＫ，ＳｕｚｕｋｉＧ，ＨｏｒｉｉＫ，ｅｔａｌ．ＩｎｔＪＤｅｖＢｉｏｌ，２０００，４４：７７７￣

７８４．

３２ＮｏｒｉｋｏＫ，ＷｉｌｌｉｅＪＳ．ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙ，２０００，２２５：２６７￣２７６．

３３ＲｉｅｓｅＤＪＮ，ＳｔｅｒｎＤＦ．ＢｉｏＥｓｓａｙｓ，１９９８，２０：４１￣４８．

３４ＰｅｒｒｉｍｏｎＮ，ＰｅｒｋｉｎｓＬＡ．Ｃｅｌｌ，１９９７，８９：１３￣１６．

３５ＹａｎｇＺ．ＣｏｍｐｕｔＡｐｐｌＢｉｏｓｃｉ，１９９７，１３（５）：５５５￣５５６．

包括基因工程菌对工业废水的生物清洁、基因工程

植物对土壤的生物修复。很早以前，以微生物的锌

抗性机制为基础进行生物清除的潜能就已被承认；

１９８４年已有报道，但未给出具体操作。直到１９９３年

才初次尝试利用耐锌（重组）菌形成的生物膜清洁

污水中的锌，证明了用微生物进行锌污染的生物修

复的可行性［２］。其后，人们又把锌抗性细菌的纯培

养物移植于多孔载体介质上形成生物膜，再将载体

填充于柱形生物反应器内，可使滤过水中锌的清除

率高达９０％￣９８％［１４］。至于利用基因工程植物对土

壤进行生物修复，人们已经做了大量的工作。如从

高积累植物Ｔｈｌａｓｐｉｊａｐｏｎｉｃｕｍ中克隆到与金属转运

有关的基因，转化到酵母菌中表达，发现酵母的抗

Ｚｎ２＋、Ｎｉ２＋和Ｍｎ２＋的能力大大提升［１５］。

参考文献

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１１ＳａｉｅｒＪｒ，ＭＨＴａｍ，ｅｔａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９４，１１：８４１￣８４７．

１２ＰｏｏｌｅＫ，Ｇｏｔｏｈ，ｅｔａｌ．ＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９６，２１：７１３￣７２４．

１３Ｍａｈ－ｅ－ＴａｌａｔＨａｓｓａｎ，ＤａｎｉｅｌｖａｎｄｅｒＬｅｌｉｅ，ＤｉｒｋＳｐｒｉｎｇａｅｌ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｅ，

１９９９，２３８：４１７￣４２５．

１４ＣａｎｓｔｅｉｎＨ，ｌｉＹ，ＴｉｍｍｉｓＫＮ，ｅｔａｌ．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９９，

６５：５２７９￣５２８４．

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!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

（上接第３４页）

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