lactic

1范围

本标准规定了含乳酸菌食品中乳酸菌（lacticacidbacteria）得检验方法。

本标准适用于含活性乳酸菌得食品中乳酸菌得检验。

2规范性引用文件

本标准中引用得文件对于本标准得应用就是必不可少得。凡就是注日期得引用文件，仅所注日期

得版本适用于本标准。凡就是不注日期得引用文件，其最新版本（包括所有得修改单）适用于本

标准。

3术语与定义

3、1乳酸菌lacticacidbacteria

一类可发酵糖主要产生大量乳酸得细菌得通称。本标准中乳酸菌主要为乳杆菌属

（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）与链球菌属（Streptococcus）。

4设备与材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其她设备与材料如下：

4、1恒温培养箱：36℃±1℃。

4、2冰箱：2℃～5℃。

4、3均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。

4、4天平：感量0、1g。

4、5无菌试管：18mm×180mm、15mm×100mm。

4、6无菌吸管：1mL（具0、01mL刻度）、10mL（具0、1mL刻度）或微量移液器及吸头。

4、7无菌锥形瓶：500mL、250mL。

5培养基与试剂

5、1MRS（ManRogosaSharpe）培养基及莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）改良MRS培养基：

见附录A中A、1。

5、2MC培养基（ModifiedChalmers培养基）：见附录A中A、2。

5、30、5%蔗糖发酵管:见附录A中A、3。

5、40、5%纤维二糖发酵管:见附录A中A、3。

5、50、5%麦芽糖发酵管:见附录A中A、3。

5、60、5%甘露醇发酵管:见附录A中A、3。

5、70、5%水杨苷发酵管:见附录A中A、3。

。3、A中A见附录:山梨醇发酵管5%、08、5．

5、90、5%乳糖发酵管:见附录A中A、3。

5、10七叶苷发酵管:见附录A中A、4

5、11革兰氏染色液：见附录A中A、5。

5、12莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）：化学纯。

5、13半胱氨酸盐酸盐（CysteineHydrochloride）：纯度＞99%。

6检验程序

乳酸菌检验程序见图1。

7操作步骤

样品制备1、7．

7、1、1样品得全部制备过程均应遵循无菌操作程序。

7、1、2冷冻样品可先使其在2℃～5℃条件下解冻，时间不超过18h，也可在温度不超过45℃

得条件解冻，时间不超过15min。

7、1、3固体与半固体食品：以无菌操作称取25g样品，置于装有225mL生理盐水得无菌均

质杯内，于8000r/min～10000r/min均质1min～2min，制成1:10样品匀液；或置于225mL生

理盐水得无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min制成1:10得样品匀液。

7、1、4液体样品：液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL

生理盐水得无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量得无菌玻璃珠）中，充分振摇，制成1:10得样品匀

液。

7、2步骤

7、2、1用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于装有9mL

生理盐水得无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹

打使其混合均匀，制成1:100得样品匀液。

7、2、2另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每

递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。

7、2、3乳酸菌计数

7、2、3、1乳酸菌总数

根据待检样品活菌总数得估计，选择2个～3个连续得适宜稀释度，每个稀释度吸取1

mL样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后，将冷却至50℃得MRS

琼脂培养基倾注入平皿约15mL，转动平皿使混合均匀。36℃±1℃厌氧培养48h±2h，培养后

计数。从样品稀释到平板倾注要求在15min内完成。

7、2、3、2双歧杆菌计数

根据对待检样品双歧杆菌含量得估计，选择2个～3个连续得适宜稀释度，每个稀释度吸取

1mL样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后，将冷却至50℃得莫

匹罗星锂盐与半胱氨酸盐酸盐得MRS培养基倾注入平皿约15mL，转动平皿使混合均。36℃±1℃

厌氧培养48h±2h，培养后计数平板上得所有菌落数。从样品稀释到平板倾注要求在15min内

完成。

7、2、3、3嗜热链球菌计数

根据待检样品嗜热链球菌活菌数得估计，选择2个～3个连续得适宜稀释度，每个稀释样品匀液

于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后，将冷却mL1度吸取．

h±48±1℃需氧培养培养基倾注入平皿约15mL，转动平皿使混合均匀。36至50℃得MC℃琼

脂平板上得菌落特征为：菌落中等偏小，边缘整齐MC2h，培养后计数。嗜热链球菌在mm，菌

落背面为粉红色。从样品稀释到平板倾注要求在mm±光滑得红色菌落，直径21

15min内完成。

7、2、3、4乳杆菌计数

7、2、3、1项乳酸菌总数结果减去7、2、3、2项双歧杆菌与7、2、3、3项嗜热链球菌计

数结果之与即得乳杆菌计数。

7、3菌落计数

可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数与相应得菌落数量。菌落计数以菌

落形成单位（colony-formingunits，CFU）表示。

7、3、1选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长得平板计数菌落总数。低于

30CFU得平板记录具体菌落数，大于300CFU得可记录为多不可计。每个稀释度得菌落数应采

用两个平板得平均数。

7、3、2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长得平板作

为该稀释度得菌落数；若片状菌落不到平板得一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算

半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。

7、3、3当平板上出现菌落间无明显界线得链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

7、4结果得表述

7、4、1若只有一个稀释度平板上得菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数得平均值，

再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）中菌落总数结果。

7、4、2若有两个连续稀释度得平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算：

式中：

N——样品中菌落数；

∑C——平板（含适宜范围菌落数得平板）菌落数之与；

n——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；1n第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；——2．

d——稀释因子（第一稀释度）。

7、4、3若所有稀释度得平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高得平板进行计数，其

她平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

7、4、4若所有稀释度得平板菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低得平均菌落数乘以稀释

倍数计算。

7、4、5若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍

数计算。

7、4、6若所有稀释度得平板菌落数均不在30CFU～300CFU之间，其中一部分小于30CFU

或大于300CFU时，则以最接近30CFU或300CFU得平均菌落数乘以稀释倍数计算。

7、5菌落数得报告

7、5、1菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。

7、5、2菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位

数字，后面用0代替位数；也可用10得指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两

位有效数字。

7、5、3称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。

8结果与报告

根据菌落计数结果出具报告，报告单位以CFU/g（mL）表示。

9乳酸菌得鉴定（可选做）

9、1纯培养

挑取3个或以上单个菌落，嗜热链球菌接种于MC琼脂平板，乳杆菌属接种于MRS琼脂平板，

置36℃±1℃厌氧培养48h。

9、2鉴定

9、2、1双歧杆菌得鉴定按GB4789、34得规定操作。

9、2、2涂片镜检：乳杆菌属菌体形态多样，呈长杆状、弯曲杆状或短杆状。无芽胞，革兰氏

染色阳性。嗜热链球菌菌体呈球形或球杆状，直径为0、5μm～2、0μm，成对或成链排列，

无芽胞，革兰氏染色阳性。

。2与表1乳酸菌菌种主要生化反应见表3、2、9．

附录A

培养基及试剂

A、1MRS培养基

A、1、1成分

蛋白胨10、0g

5牛肉粉、0g

4、酵母粉0g

20、葡萄糖0g

1、吐温800mL

2、0g·HPOK7HO2425、O3H·0g醋酸钠22柠檬酸三铵、0g

0、2g·MgSO7HO240、05gMnSOO4H·24g0、15琼脂粉pH、2制法A、1、℃高压灭

菌，分装后121000mL蒸馏水中，加热溶解，调节pH将上述成分加入到1

min。min～2015

A、1、3莫匹罗星锂盐与半胱氨酸盐酸盐改良MRS培养基

A、1、3、1莫匹罗星锂盐储备液制备：称取50mg莫匹罗星锂盐加入到50mL蒸馏水中，用0、

22?m微孔滤膜过滤除菌。

A、1、3、2半胱氨酸盐酸盐储备液制备：称取250mg莫匹罗星锂盐加入到50mL蒸馏水中，

用0、22?m微孔滤膜过滤除菌。

A、1、3、2制法

将A、1、1成分加入到950mL蒸馏水中，加热溶解，调节pH，分装后121℃高压灭菌15min～

20min。临用时加热熔化琼脂，在水浴中冷至48℃，用带有0、22?m微孔滤膜得注射器将莫匹

罗星锂盐储备液及半胱氨酸盐酸盐储备液制备加入到熔化琼脂中，使培养基中莫匹罗星锂盐得浓

度为50?g/mL，半胱氨酸盐酸盐得浓度为500?g/mL。

A、2MC培养基

A、2、1成分

大豆蛋白胨5、0g

3牛肉粉、0g

3酵母粉、0g

20葡萄糖、0g

20乳糖、0g

10、0g碳酸钙

15、0g琼脂

蒸馏水1000mL

％中性红溶液mL0、51、pH60

制法、2、A2

℃种成分加入蒸馏水中，加热溶解，调节7，加入中性红溶液。分装后pH121将前面。min20～

min15高压灭

乳酸杆菌糖发酵3

1基础成0牛肉蛋白0

酵母浸0

5吐8m

5琼

46溴甲酚紫酒精溶m

蒸馏1000m

制2

mimi20155加入所需糖类，并分装小试,121℃高压灭七叶苷培养基成分1A、4、

0g蛋白胨、51g磷酸氢二钾0、g七叶苷0、3枸橼酸铁5、0g16%1、溴甲酚紫酒精溶

液、mL4

蒸馏水mL100

、A4制法、2

。20min℃高压灭菌将上述成分加入蒸馏水中，加热溶解，12115～min5A、革兰氏染色液、、

A51结晶紫染色液115、A、、成分、10结晶紫g95％乙醇mL20

1％草酸铵水溶液mL80

、5、A2、1制法将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。

2革兰氏碘1成0

碘化0蒸馏m300

制法、A5、2、2

3将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至00mL。

A、沙黄复染液5、3

成分、3、15A、g25、沙黄0％乙醇95mL10

蒸馏水mL90

制法235A、、、将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。A、5染色法、4

145A、、、1将涂片在酒精灯火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染min，水洗。滴加革兰氏碘

液，作用，水洗。1min245A、、、5A、、～15％乙醇脱色，约9534、滴加s30，直至染色液

被洗掉，不要过分脱色，水洗。s、、A51滴加复染液，复染、44。水洗、待干、镜检。min