牛耳学院

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技 术

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通 讯…一５Ｎ

。．３ Ｍａ，２０１４ＬＥ ＳＩＮＢＩＯＴＥＣ ＮＯＬＯＧＹ ＶＯＩ．Ｚ Ｍａｙ， Ｉ’Ｉ’ＥＲ Ｈ ｌ ｏ・ ３６ｌ

ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００９—０００２．２０１４．０３．０１３ 研究报告

利用自裂解多肽Ｔ２Ａ在牛耳皮肤成纤维细胞中实现多基

因共同表达

张俨 ，马晴雯

１．上海交通大学医学院，上海市儿童医院，上海交通大学附属儿童医院，上海交通大学医学遗传研究所，上海

２０００４０；２．卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室暨上海市胚胎与生殖工程重点实验室，上海２０００４０

［摘要］ 目的：探讨利用自裂解多肽２Ａ构建的多顺反子载体能否在牛耳皮肤成纤维细胞中实现多基因的有效表

达。方法：利用来自一点褐翅蛾病毒（ＴａＶ）的２Ａ元件（Ｔ２Ａ）将ＧＦＰ和Ｎｅｏ基因连接到同一载体中，构建ｐＣＭＶ—ＧＦＰ—

Ｔ２Ａ—Ｎｅｏ质粒，将其转染牛耳皮肤成纤维细胞，以ＦＡＣＳ检测Ｇ 基因的表达，ＲＴ—ｑＰＣＲ检测Ｇ即、Ｔ２Ａ和Ｎｅｏ的表

达。结果：由Ｔ２Ａ连接的ＧＦＰ和Ｎｅｏ基因在ｍＲＮＡ水平上都有显著表达，且表达水平相当。结论：以Ｔ２Ａ连接的基因

在转入细胞后能正常翻译和表达，显示Ｔ２Ａ在牛耳皮肤成纤维细胞中具有自裂解功能，可作为一种构建多顺反子载

体的有效工具用于牛耳皮肤成纤维细胞的基因转移，为其将来在转基因牛研制中的应用奠定了基础。

［关键词】 多顺反子载体；自裂解多肽Ｔ２Ａ；牛耳皮肤成纤维细胞

［中图分类号］Ｑ７８ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］ １００９—０００２（２０１４）０３—０３６１－０４

Ｃｏ‘＿－Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｂｏｖｉｎｅ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｕｓｉｎｇ Ｓｅｌｆ－

Ｃｌｅａｖｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔ２Ａ

ＺＨＡＮＧ Ｙａｎ ．ＭＡ Ｑｉｎｇ－Ｗｅｎ１，２

１．Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉａｏ Ｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ Ｓ Ｈｏｓｌ￣ｉｔａｌ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，

Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉａｏ Ｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００４０；２．Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｍｂｒｙｏ ａｎｄ

Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ ＨｅＭｔｈ，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｅｍｂｒｙｏ ａｎｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，

Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００４０；Ｃｈｉｎａ

＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ，Ｅ－ｍａｉｈ ｑｗｍａ１２１３＠１６３．ｃｏｍ

［Ａｂｓｔｒａｃｔ］０ｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｗｈｅｔｈｅｒ ｔｈｅ ｍｕｈｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ ｌｉｎｋｅｄ ｂｙ ８ｅｌｆ＿ｃｌｅａｖｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ２Ａ

ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｉｎ ｂｏｖｉｎｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ａ ＣＯ—ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＣＭＶ—ＧＦＰ一

２ Ｎｅｏ ｃｏｎｔａｉｎｓ Ｔ２Ａ ｆｒｏｍ ｉｎｓｅｃｔ ｖｉｒｕｓｅｓ ＴａＶ ｌｉｎｋｅｄ ＧＦＰ ａｎｄ ｎｅｏｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｅｓ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ａｎｄ

ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｂｏｖｉｎｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌｓ．ＦＡＣＳ ａｎａｌｙｓｉｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇ ．ＲＴ—ｑＰＣＲ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ

ｔｈａｔ Ｇ ． Ａ ａｎｄ Ｎｅｏ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｂｏｖｉｎｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｅｑｕａｌ ａｍｏｕｎｔ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔ２Ａ ｈａｓ ｓｅｌｆ－ｃｌｅａｖ．

ｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｂｏｖｉｎｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌｓ ｗｈｉｃｈ ｒｅｓｕｌｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｉｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ Ｔ２Ａ

ｃｏｕｌｄ ｂｅ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ＣＯ—ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｏｖｉｎｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｍａｙ ｐｒｏｖｉｄｅ ｎｅｗ ｃｌｕｅ ｆｏｒ

ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｂｏｖｉｎｅ ｗｉｔｈ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅｓ．

［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ｍｕｈｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｖｅｃｔｏｒ；ｓｅｌｆ－ｃｌｅａｖｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔ２Ａ；ｂｏｖｉｎｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ

多顺反子载体在基因操作中具有重要的应用价

值。目前常用的构建多顺反子载体的策略有：构建

多启动子表达载体、构建剪切载体、表达融合基因、

基因之间以内部核糖体插入位点（ＩＲＥＳ）连接等。

但这些构建方法往往有载体容量有限、受细胞类型

限制及不能表达多个蛋白等缺点。最近几年发展出

了自裂解多肽２Ａ（ｓｅｌｆ－ｃｌｅａｖｉｎｇ ２Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ）相关的

收稿日期：２０１３—１２—２０

基金项目：国家高技术研究发展计￣ｔＪ（２０１１ＡＡ１００６０２）

作者简介：张俨（１９８５一），男，硕士研究生

通信作者：马晴雯，（Ｅ—ｍａｉｌ）ｑｗｍａ１２１３＠ｌ６３．ｃｏｒｎ

构建多顺反子载体的新技术。自裂解多肽２Ａ可应

用于多顺反子载体的构建，具有结构短小、上下游基

因表达平衡性好、可用于共表达多个蛋白等优点，是

一种构建多顺反子载体的有效工具 。

近几年，利用２Ａ多肽构建多顺反子表达载体的

技术在干细胞研究中得到了大量应用。２００８年，

Ｓｏｍｍｅｒ等 １联合应用２Ａ和ＩＲＥＳ首次构建了一种多

顺反子慢病毒载体，该载体可同时表达Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、

Ｓｏｘ２和ｃ—Ｍｙｃ等４种转录因子，并成功地将新生儿

成纤维细胞诱导成ｉＰＳ细胞。Ｃａｒｅｙ等ｐ 使用不同来

源的２Ａ序列（Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ和Ｐ２Ａ）作为连接元件，构建

３６２

生 物 技 术 通 讯…～Ｎ

。－３ Ｍａｙ’２０１４ＬＥＴＴＥＲＳ ＩＮ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＶＯＩ．Ｚ３ Ｍａ ｌ、Ｏ・ｊ ｙ，

了含有Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２和ｃ—Ｍｙｃ转录因子的多顺反

子载体，并且分别在胚胎和成体细胞水平成功地诱

导了小鼠和人体细胞的重编程。最近，有研究者分

别使用ＩＲＥＳ、Ｆ２Ａ序列连接Ｏ（６）一甲基鸟嘌呤一ＤＮＡ

甲基转移酶基因和多药耐药性基因，通过细胞转染

使这２个基因在造血干细胞系中过表达；与ＩＲＥＳ的

连接相比，Ｆ２Ａ的连接对细胞起到了更好的保护效

果 。我们采用来自一点褐翅蛾病毒（ＴａＶ）的Ｔ２Ａ

构建共表达载体ｐＣＭＶ—ＧＦＰ—Ｔ２Ａ—Ｎｅｏ，转染牛耳皮

肤成纤维细胞，分析ＧＦＰ和Ｎｅｏ基因在分子和细胞

水平的表达情况，为在转基因牛制备中利用２Ａ进行

多基因转移操作提供基础数据和参考。

１材料与方法

１．１材料

小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３为本所保存；原代牛耳

皮肤成纤维细胞由本所大动物实验基地提供；大肠

杆菌ＴＯＰＩＯ感受态细胞购白天根生化科技（北京）有

限公司；质粒ｐＥＧＦＰ—Ｎ１和ｐｃＤＮＡ３．１（＋）分别购自

Ｃｌｏｎｔｅｃｈ和Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。

ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养液、血清、ＰＢＳ和ＴＲＩｚｏｌ试剂购

自Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司；胰蛋白酶购自Ｂｅｃｔｏｎ

Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ公司；Ｇ４１８购自国药集团化学试剂有限公

司；ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ转染试剂购自Ｒｏｃｈｅ公司；限制性

内切酶、Ｔ４ ＤＮＡ连接酶和Ｐｈｕｓｉｏｎ超保真ＤＮＡ聚合

酶购自ＮＥＢ公司；Ｔａｑ酶、ＳＹＢＲ荧光定量ＰＣＲ试剂

和ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ反转录酶购白ＴａＫａＲａ公司；ＰＣＲ纯化

试剂盒和胶回收试剂盒购自Ｑｉａｇｅｎ公司；引物及

Ｔ２Ａ合成由Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司完成。

１．２ 载体ｐＣＭＶ—ＧＦＰ—Ｔ２Ａ—Ｎｅｏ的构建

以Ｎａｒ Ｉ和ＢａｍＨ Ｉ双酶切ｐｃＤＮＡ３．１（＋），去除

ＳＶ４０启动子。因切除ＳＶ４０启动子时，Ｎｅｏ基因的部

分片段也被切除，因此，以ｐｃＤＮＡ３．１（＋）为模板扩增

含有被切除的Ｎｅｏ基因片段（引物序列见表１），并与

上述经Ｎａｒ Ｉ和ＢａｍＨ Ｉ酶切的ｐｃＤＮＡ３．１（＋）载体

相连，得到ｐｃＤＮＡ３．１一ＣＭＶ—Ｎｅｏ。将合成的Ｔ２Ａ及

其互补单链Ｔ２Ａｒｃ（分别含有限制性内切酶Ｎｈｅ Ｉ和

ＢａｍＨ Ｉ粘性末端，序列见表１）干粉配制为１００

Ｉｘｍｏｌ／Ｌ的溶液后等摩尔混合，于１００￣Ｃ沸水中待其自

然冷却，即得到两侧分别为Ｎｈｅ Ｉ和ＢａｍＨ Ｉ粘性末

端的Ｔ２Ａ双链，将其连入ｐｃＤＮＡ３．１一ＣＭＶ—Ｎｅｏ相应

的酶切位点处，得到ｐｃＤＮＡ３．１一ＣＭＶ—Ｔ２Ａ－Ｎｅｏ。以

ｐＥＧＦＰ—Ｎ１为模板，ＰＣＲ扩增含有Ⅳｋ Ｉ和ＡｖｒⅡ酶

切位点的ＧＦＰ基因，接入ｐｃＤＮＡ３．卜ＣＭＶ—Ｔ２Ａ－Ｎｅｏ

中，得至０目的载体ｐＣＭＶ—ＧＦＰ—Ｔ２Ａ—Ｎｅｏ。

１３细胞培养及转染

接种适量ＮＩＨ３Ｔ３细胞或牛耳成纤维细胞至６

孑Ｌ板中，培养至８５％～９５％汇合度时进行细胞转染。

需转染的质粒用无内毒素质粒提取试剂盒制备。采

用相同方法转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞和牛耳成纤维细胞。

转染前进行细胞换液，每孔细胞中加入２ ｍＬ新鲜培

养基（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％血清）。６孔板中每孔细胞的

转染操作如下：取３．３ Ｉｚｇ ＤＮＡ加入不含血清的

ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养液中，吹打混匀，配成体积为１５７

Ｌ的ＤＮＡ混合液，随后将ＤＮＡ（ｔｘｇ）和转染试剂

（ Ｌ）按１：３的比例加入９．９ ｔｘＬ ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ转染

试剂，轻轻吹打混匀，室温静置２０ ｍｉｎ，将转染复合

物逐滴加入６孔板的细胞中，轻轻摇匀。另设转染

ｐＥＧＦＰ—Ｎ１质粒的阳性对照组和未转染质粒的空白

对照组。转染１２ ｈ后，换新鲜的含血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２

培养液继续培养。

１．４ 荧光激活细胞分选（ＦＡＣＳ）分析

转染４８ ｈ后，胰酶消化收集细胞，用ＰＢＳ洗涤

１～２次，取１Ｘ１０ 以上的细胞用鞘液重悬，用流式细

胞仪分析ＮＩＨ３Ｔ３和牛耳皮肤成纤维细胞中ｐＣＭＶ—

ＧＦＰ—Ｔ２Ａ—Ｎｅｏ的转染效率及ＥＧＦＰ的表达情况。

１．５ 荧光定量ＰＣＲ

转染牛耳皮肤成纤维细胞４８ ｈ后，收集转染组

和空白对照组细胞，用ＴＲＩｚｏｌ法提取细胞总ＲＮＡ，反

转录获得ｃＤＮＡ后用荧光定量ＰＣＲ方法检测ＧＦＰ、

Ｔ２Ａ和Ｎｅｏ基因在ｍＲＮＡ水平的表达。引物及序列

见表２。采用ＧｒａｐｈＰａＤ Ｐｒｉｓｍ ５软件分析荧光定量

ＰＣＲ数据。

２ 结果

２．１ 共表达载体ｐＣＭＶ—ＧＦＰ—Ｔ２Ａ—Ｎｅ０构建

表１ 构建ｐＣＭＶ—ＧＦＰ一 Ｆ２Ａ—Ｎｅｏ载体所用引物