联合大学应用文理学院

芦丁与人血清白蛋白相互作用的紫外可见光谱特性研究

黄汉昌;姜招峰

【摘要】Inordertoinveatigatetheinteractionbetweenrutinandhuman

rumalbumin(lISA),thisarticledeterminedtheultraviolt-visible(UV-Vis)

absorptionspectrum,circulardiachroismandHSAfluorescence

spectrum,andfurthertoanalythedifferencebetweenthespectrabefore

ultsindicatedthatrutinshowsthree

particularUVabsorption-peakatthewavelength264.0,285.5and354.5nm

andcirculardiachroismatthewavelengthranges330～300nmand300～

tininteractedwithHSA,theUVabsorptionpeakofRutin

r,forthestructureofHSA,rutin

itationwavelength

willbeshifttowardslongwavelength,whileemissionwavelengthwillbe

shifttowardsshortwavelengthwhenHSAinteractedwithrutin.%本文通过

测定芦丁与HSA相互作用前后的紫外可见吸收光谱、圆二色性及人血清白蛋白

(HSA)的荧光特性,研究了芦丁与HSA结合作用.结果表明,芦丁在紫外区有三个特征

的吸收峰(264.0、285.5及354.5nm)、在330～300nm及300～230nm处显示

圆二色性,HSA引起芦丁紫外可见吸收光谱波峰红移;芦丁与HSA相互作用后,不引

起HSA二级结构的改变,但对其三级结构有影响,同时对HSA荧光激发及发生光谱

最大峰位及幅度有影响.

【期刊名称】《天然产物研究与开发》

【年(卷),期】2011(023)003

【总页数】6页(P476-481)

【关键词】芦丁;人血清白蛋白;紫外吸收;圆二色性;荧光光谱

【作者】黄汉昌;姜招峰

【作者单位】北京联合大学应用文理学院;北京联合大学生物活性物质与功能食品

北京市重点实验室,北京,100191

【正文语种】中文

【中图分类】Q81

芦丁(Rutin)亦称芸香苷(Rutinoside)是黄酮类生物活性物质，存在于70多种植物

中，如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英等，其中以槐米和荞麦叶的含量较高［1］。芦

丁具有降低毛细血管的异常通透性和脆性的作用，具有维持与增强毛细血管抵抗力，

降低其通透性，促进细胞增生和抗炎、抗过敏、利尿、降血脂等作用。临床上用于

治疗毛细血管引起的出血症，并常作为高血压的辅助治疗药［2］。芦丁为黄酮类

物质，由于很容易得到对照品，因此中药或中药制剂常以芦丁为对照品测定总黄酮

含量［3-6］。在研究中芦丁常作为黄酮类化合物的模型化合物，研究黄酮类物质

的理化性质及生理活性［7-11］。人血清白蛋白(HumanSerumAlbumin，HSA)

是血浆中含量最丰富的载体蛋白，是生物活性物质发挥生物效应的重要载体和靶向

分子。本文就芦丁与HSA相互作用的光谱特性进行了研究。

1.1仪器与材料

圆二色光谱仪(JASCO810，日本分光公司);紫外可见分光光度计(UV-2450，日本

岛津公司);荧光分光光度计(RF-301，日本岛津公司)。

芦丁，中国生物制品药品鉴定所(Mw610，HPLC＞97%);人血清白蛋白HSA(Mw

66000，96%～99%，MERK公司);甲醇(色谱纯，北京化学试剂公司)，磷酸钾盐

缓冲液(PBS)(pH=7.40，内含NaC1溶液0.5mol/L)。

1.2实验方法

1.2.1紫外可见吸收光谱(UV-VisAbs)测定

芦丁UV-VisAbs:精密称取芦丁样品30.5mg于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并

稀释至刻度，摇匀配成0.001mol/L(M)的芦丁样品储备溶液。吸取适当芦丁储备

液，用水稀释，制备1.0×10-5M，1.5×10-5M，2.5×10-5M，5.0×10-5M的

芦丁待测样品。分别以待测芦丁待测样品空白溶液为对照，测定芦丁500～200

nm紫外可见吸收光谱。

HSA对芦丁UV-Vis的影响:精密称取14.0mgHSA于10mL的容量瓶中，磷酸

盐缓冲溶液溶解并稀释至刻度，摇匀配成2.0×10-5M的HSA储备溶液。吸取适

当的HSA储备溶液，先用待加体积的PBS溶液稀释后，再加入适当的芦丁储备液

溶液(下同)，制备含1.5×10-5M芦丁、5.0×10-7MHSA的芦丁HSA样品溶液。

以待测芦丁待测样品空白溶液为对照，测定芦丁HAS样品500～250nm紫外可

见吸收光谱。

1.2.2圆二色光谱(CD)测定

芦丁UV-VisCD:吸取适当的芦丁储备液及HSA储备溶液，制备合适浓度芦丁样

品溶液，以其空白溶液为对照，测定芦丁500～200nm紫外可见圆二色光谱。

HSA二级结构:制备合适浓度HSA溶液，测定其250～190nm的CD值，杨氏拟

合法拟合HSA的二级结构组成。仪器条件:1mm石英比色池，1nm狭缝宽度，

100nm/min扫描速度，1s响应值，扫描3次取平均值。

HSA对芦丁二级结构的影响:固定HSA的含量(5.0×10-8M)，制备芦丁与HSA不

同配比的样品溶液，测定其250～190nm的CD值。仪器条件:1mm石英比色

池，1nm狭缝宽度，100nm/min扫描速度，1s响应值，扫描3次取平均值。

HSA对芦丁三级结构的影响:固定HSA的含量(1.0×10-5M)，制备不同芦丁与

HSA配比的样品溶液，测定其350～250nm的CD值。仪器条件:10mm石英比

色池，1nm狭缝宽度，100nm/min扫描速度，1s响应值，扫描3次取平均值。

1.2.3荧光光谱测定

HSA荧光激发光谱:配制系列合适浓度HSAPBS溶液，以320～190nm波长作

为激发光源，测定345nm的发射荧光强度。固定HSA的含量(5.0×10-8M)，制

备芦丁与HSA不同配比的样品溶液，测定320～190nm波长范围的345nm的

荧光强度。比较以上荧光强度的变化。仪器条件:10mm石英比色池，狭缝宽度4

nm，100nm/min扫描速度，1s响应值，扫描3次取平均值。

HSA荧光发射光谱:固定HSA的含量(1.0×10-6M)，制备不同芦丁与HSA不同配

比的样品溶液，测定其300～500nm的发射荧光光谱。仪器条件:10mm石英比

色池，激发波长为283nm，狭缝宽度4nm，100nm/min扫描速度，1s响应值，

扫描3次取平均值。

芦丁对HSA荧光发射光谱的吸收:制备合适浓度HSA溶液，283nm光源激发

HSA溶液产生发射荧光光谱，在荧光光路上放置不同浓度的芦丁溶液，测定

300～500nm的发射荧光光谱。仪器条件:HSA溶液荧光激发采用10mm石英

比色池;芦丁溶液采用1mm石英比色池。激发波长为283nm，狭缝宽度4nm，

100nm/min扫描速度，1s响应值，扫描3次取平均值;芦丁溶液采用1mm石

英比色池。

2.1芦丁紫外可见吸收光谱及圆二色性分析

芦丁为黄酮类化合物，具有α-苯基色原酮的基本结构，羰基与二个芳香环形成两

个较强的共轭系统(图1)，浓度为1.0，1.5，2.5，5.0×10-5M的芦丁甲醇溶液，

在500～200nm波长下作光谱扫描，其图谱见图2。芦丁对紫外光谱的两个区域

有很强的特征吸收。吸收带I在330～380nm较长波长范围最大ε在22000左

右，吸收峰归属色原酮结构氧原子n→π*的电子跃迁R带吸收;吸收带II在240～

280nm波长范围，最大ε在26000左右，吸收峰归属苯环共轭结构π→π*的电

子跃迁B带吸收。吸收带III在200～240nm，最大摩尔吸光系数ε在48000左

右，吸收峰归属苯环双键π→π*的电子跃迁E带吸收。

当平面圆偏振光通过这些光活性的生色基团时，光活性中心对平面圆偏振光中的左、

右圆偏振光的吸收不相同，产生的吸收差值。由于这种吸收差的存在，造成了偏振

光矢量的振幅差，圆偏振光变成了椭圆偏振光，这就是手性化合物的圆二色性。芦

丁的紫外可见圆二色光谱图见图3。芸香糖虽然存在不对称结构，但在500～200

nm纳米范围内没有光谱吸收，所以在检测波长范围内不表现CD值。500～330

nm波长范围内芦丁没有明显的CD值，表明原酮结构氧原子处于对称微环境中，

没有手性。330～300nm、300～230nm波长范围分别有正的科顿效应，这可能

与苯环B对色原酮(C+A环)平面不对称性有关。

1.5×10-5M的芦丁溶液吸光度在0.2～0.8范围，试验误差小，因此采用此浓度

测定HSA对芦丁紫外吸收光谱的影响。含5.0×10-7MHSA的1.5×10-5M芦丁

溶液500～250nm波长紫外吸收光谱见图4。由图4可见，芦丁溶液中加入

HSA后，其最大紫外吸收峰发生了红移;264.0nm的波峰红移至267.5nm，最大

ε稍有增加，285.5nm的波谷红移至291.5nm，354.50nm的波峰红移至

363.0nm，最大ε明显降低，并且R吸收带明显向长波方向扩展(红移)。紫外吸

收波长的红移表明芦丁与HSA发生了相互作用。

由于芦丁在500～330nm波长范围内没有明显的CD值，而330～190nm以下

HSA的CD值很明显，会给芦丁CD值分析带来很大干扰，因此很难测定及分析

HSA作用对芦丁手性的影响。

2.2芦丁对HSA结构的影响

圆二色光谱能够灵敏地反映蛋白质溶液构象的改变［12］。在蛋白质或多肽中，

主要的光活性基团是肽链骨架中的肽键、芳香氨基酸残基及二硫桥键。蛋白质的

CD光谱一般分为两个波长范围，即190～250nm为远紫外区CD光谱，250～

320nm为近紫外区CD光谱。远紫外区CD光谱由肽键产生，反映蛋白质二级结

构的圆二色性。在蛋白质或多肽的二级结构中，肽键是高度有规律排列的。排列的

方向性决定了肽键能级跃迁的分裂情况。因此，具有不同二级结构的蛋白质或多肽

所产生CD谱带的位置、吸收的强弱都不相同。近紫外CD主要由侧链芳香基团、

二硫键等生色基团产生，近紫外CD与蛋白质的三级结构密切相关。

2.2.1HSA二级结构的影响

HSA和芦丁的190～250nm的圆二色光谱图见图5。可见相同浓度的HSA溶液

中，HSA与芦丁比例从2∶1～1∶20，HSA的208及222nm处的α-螺旋特征

光谱变化没有浓度依赖关系;造成其光谱微细差异主要由实验样品间浓度差异造成。

芦丁对HSA在190～250nm的圆二色光谱并没有明显影响，表明芦丁与HSA发

生作用后并没有引起HSA二级结构的变化。本实验结果与吴锦绣等［13］认为芦

丁引起HSA二级结构的改变有矛盾。其可能的原由:(1)供试品与对照品HSA的浓

度差异造成。HSA的圆二色性很强，浓度稍有差异，对HSA在200～230nm的

CD值影响明显;(2)芦丁甲醇储备液加入高浓度HSA储备液后，再加入PBS溶液

稀释成所需浓度的供试样品。甲醇对HSA的二级结构组成有一定的影响(图6)，

在低含量下(小于10%)，甲醇对HSA二级结构影响不明显;但甲醇含量较高时，

HSA二级结构改变明显，208及222nm处的α-螺旋特征光谱明显减弱。

2.2.2HSA三级结构的影响

HSA和芦丁的250～350nm的圆二色光谱图见图7。可见，芦丁对HSA250～

350nm的CD光谱有轻微的影响。HSA在250～270nm有精细的CD光谱值，

其CD值主要来自芳香氨基酸残基中测量色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸

(Phe)的贡献。HSA在262及268nm处有两个精细的最大CD值;在芦丁存在条

件下，明显的加强这两个CD波峰值。表明芦丁与HSA发生作用后引起HSA三

级结构的变化。

2.3芦丁对HSA荧光光谱的影响

HSA中含有芳香氨基酸，使其具有很强的内源荧光性，当某些小分子如药物与蛋

白质结合后，会导致HSA激发及发射光谱特性的改变。药物与蛋白质结合后，导

致蛋白质荧光强度下降现象，这种现象称为药物对蛋白质的荧光猝灭作用。但当药

物在HSA的发射荧光光谱范围内有强烈的吸收时，在同一溶液中即使药物与HSA

没有发生直接的结合作用，也能导致检测器中HSA荧光强度下降，造成药物对荧

光猝灭作用的假象。我们曾经报道随着芦丁浓度的增加HSA内源荧光强度逐渐降

低现象［14］，但我们没有考虑到芦丁自身对HSA发射荧光的吸收因素。HSA

内源荧光强度的降低究竟是由芦丁的电子吸收作用引起的，还是由芦丁与HSA发

生分子相互作用后引起的，还有待进一步的研究。本部分重新考查了芦丁与HSA

的相互作用及对HSA荧光光谱的影响。

2.3.1HSA荧光激发光谱

配制1.0×10-7～1.0×10-6MHSA的PBS溶液，以190～320nm波长光源作为

激发光源，记录345nm处HSA的荧光发射光强，考察HSA浓度对其荧光激发

光谱的影响。HSA荧光激发光谱见图8，PBS在190～320nm波长光源激发下

不产生荧光，对HSA荧光强度测定无干扰。HSA的最大激发波长在280nm附近，

随HSA的浓度稍有变化，当HSA浓度当1.0×10-7M升高到1.0×10-6M时，最

大激发波长从280nm变化到283nm。280nm附近激发光源下，HSA的荧光

发射光强与其浓度呈依赖关系，随HSA浓度的升高而增大。在250～300nm范

围内芳香氨基酸的侧链生色基团有较强的紫外吸收，HSA中含有酪氨酸及色氨酸

残基，280nm附近激发光源的HSA荧光发射光谱主要为酪氨酸及色氨酸残基激

发的内源性荧光。

值得注意的是，230左右nm的激发光源下，HSA的荧光发射光强与浓度没有依

赖关系。

2.3.2芦丁对HSA荧光激发光谱影响

芳香氨基酸残基的激发波普与其所处的微环境，特别是疏水性有关，蛋白质与药物

结合后可能会对芳香氨基酸残基的微环境产生影响，其最大激发波长可能会产生变

化。

配制1.0×10-6MHSA的PBS溶液及其不同芦丁含量的PBS溶液，以190～320

nm波长光源作为激发光源，记录345nm处HSA的荧光发射光强，考察芦丁对

HSA荧光激发光谱的影响。芦丁对HSA荧光激发的影响光谱见图9。芦丁在

190～320nm波长光源激发下不产生荧光，对HSA荧光强度测定无干扰。芦丁

对HSA的最大激发波长产生明显的影响，在相同HSA浓度下，当芦丁浓度从

1.0×10-8M升高到5.0×10-6M时(HSA与芦丁的摩尔比100∶1～1∶5)，最大

激发波长从283nm变化到286nm。表明芦丁对HSA中酪氨酸及色氨酸残基侧

链生色基团的微环境产生了影响，而这种影响与HSA蛋白质的空间构象变化密切

相关。

2.3.3芦丁对HSA荧光发射光谱影响

配制1.0×10-6MHSA的PBS溶液及其不同芦丁含量的PBS溶液，以283nm波

长光源作为激发光源，记录300～450nm波长范围的HSA荧光发射光谱，考察

芦丁对HSA荧光发射光谱的影响，结果见图10。芦丁溶液本身不产生荧光，因此，

研究中不用考虑“内滤光效应”的干扰。固定HSA的量，改变芦丁与HSA的含

量比例，随着芦丁浓度的增加，HSA的内源荧光强度有规律地降低，当HSA与芦

丁浓度比达到1∶12时，基本检测不到HSA的发生荧光光强。这种荧光发生强度

的降低来源于:(1)芦丁本身对300～450nm光谱的吸收;(2)芦丁对HSA酪氨酸及

色氨酸残基侧链生色基团的微环境产生影响，部分抑制了其产生荧光的能力。

HSA在345nm附近的发射峰可归属于其酪氨酸及色氨酸残基的发生荧光，而酪

氨酸、色氨酸残基的最大发射波长与其所处的微环境相关［8］。芦丁-HSA溶液

体系中，HSA荧光最大发射峰位及峰形随芦丁浓度的增加发生蓝移，相同

1.0×10-6MHSA浓度条件下，当芦丁浓度由1.0×10-7M升高到8.0×10-6M时，

HSA最大发射荧光峰位从345nm蓝移到338nm(最大荧光强度由5.0下降到

0.15左右)。

为了探讨芦丁对HSA发射荧光光谱直接吸收的影响，设计以下实验:在HSA溶液

发生荧光光路上，放置芦丁溶液，记录经芦丁溶液吸收后的HSA荧光发射光谱。

实验结果见图11。芦丁对HSA发射荧光有较强的吸收作用，相同1.0×10-6M

HSA浓度条件下，HSA发射荧光强度随芦丁浓度的增加而降低，但是与芦丁-

HSA溶液体系不同的是:(1)即使HSA与芦丁浓度比达到1∶50时，仍能检测到一

定的HSA荧光光强;并且芦丁对360nm附近的荧光有较强的吸收作用，这与芦丁

的360附近有最大吸收的紫外吸收光谱相吻合。(2)在相近发射荧光强度条件下，

最大发射荧光峰位发生更大的蓝移，HSA最大发射荧光峰位从345nm蓝移到

326nm(最大荧光强度由0.45下降到0.22左右)。

以上实验结果表明，芦丁-HSA溶液体系中，芦丁除了本身对300～450nm光谱

的有吸收外，芦丁与HSA分子之间确实发生了相互作用，芦丁对HSA酪氨酸及

色氨酸残基侧链生色基团的微环境产生影响，部分抑制了其产生荧光的能力。

HSA发射的荧光能量向芦丁发生了转移，芦丁对HSA的荧光有猝灭作用。

芦丁是重要的黄酮类生物活性物质，其经常作为黄酮类化合物的模型化合物，研究

黄酮类物质的理化性质及生理活性。HSA是血浆中含量最丰富的载体蛋白，是生

物活性物质发挥生物效应的重要载体和靶向分子。HSA影响芦丁的紫外吸收光谱;

芦丁与HSA相互作用，其不引起HSA二级结构的改变，但对HSA三级结构分子

构象有一定的影响。以芦丁为黄酮类物质的分子模型，开展黄酮类物质与HSA分

子相互作用的研究，探讨黄酮类物质与蛋白质的相互作用机制，对揭示黄酮类药物

药效具有重要意义。

【相关文献】

1ZhaoWB(赵文彬)，XuYH(许玉华)，WangLS(王鲁石).ThePurificationandDetermination

henMedMaterMedRes(时珍国医国药)，2007，18:876-878.

2LongQJ(龙全江)，YangT(杨韬).

JInfTraditChinMed(中国中医药信息杂志)，2002，9(4):39-42.

3MaTT(马陶陶)，ZhangQL(张群林)，LiJ(李俊).AlCl3ColorimetryforDeterminationof

henMedMaterMedRes(时珍国医国药)，2008，19:54-56.

4HeSM(何书美)，QiaoLX(乔兰侠)，LiuJL(刘敬兰).QuantitativeDeterminationofTotal

ci(分析科学学报)，2008，

24:201-204.

5GuiJS(桂劲松)，WeiHY(韦汉燕)，DaiP(戴平).TheContentDeterminationofTotal

zeUniv，Nat

Sci(长江大学学报，自科版医学卷)，2009，6:64-65.

6ZhouWP(周吴萍)，LiJS(李军生)，WeiYY(韦媛媛).A-nalysisofTotalFlavonoidsContentin

Emii(食品

科学)，2008，29:469-471.

7LuanNN(栾尼娜)，WuJX(吴锦绣)，SongYM(宋玉民).ThermodynamicsStudiesonthe

oscopySpectralAnal(光谱学与光谱分析)，2008，

28:856-859.

8MaGB(马贵斌)，GaoF(高飞)，RenBZ(任斌知).StudyontheInteractionofHumanSerum

imSin(化学学报)，1995，

53:1193-1197.

9GuoJJ(郭菁菁)，YangXF(杨秀芬).Rearchprogressoftheprotectiveeffectofflavanoids

armBull(中国药理学通报)，2008，24:5-10.

10ZhangAH(章爱华)，DengB(邓斌)，JiangGB(蒋刚彪).Preliminarystudyonantioxidant

iTechno(食品科技)，2008，8:140-143.

11YuTZ(愈天智)，YangRD(杨汝栋).Studyontheinteractionofrutinandrum

oscopySpectralAnal(光谱学与光谱分析)，2003，23:763-765.

12HuangHC(黄汉昌)，ZhuHJ(朱宏吉)，JiangZF(姜招峰).Themethodsofprotein

ll(化学通报)，2007，70:501-506.

13WuJX(吴锦绣)，ZhangY(张胤)，LiM(李梅).Influenceofrutinonconformationofrum

oscopySpectralAnal(光谱学与光谱分析)，2008，28:2619-2622.

14HuangHC(黄汉昌)，ZhangA(张艾)，JiangZF(姜招峰).Astudyonextractionofrutin

fromflossophoraeimmaturusandfluorescenceofhumanrumalbumininteractedwith

ngUnionUniv，NatSci(北京联合大学学报，自科版)，2008，22:11-14.