nob

A/O法活性污泥中氨氧化菌群落的动态与分布

摘要：

我们研究了在厌氧—好氧序批式反应器（SBR）中氨氧化菌群落（AOB）和

亚硝酸盐氧化菌群落（NOB）的结构活性和分布。在研究过程中，分子生物技

术和微型技术被用于识别和鉴定这些微生物。污泥微粒中的氨氧化菌群落结构

大体上与初始的接种污泥中的结构不同。与颗粒形成一起，由于过程条件中生

物选择的压力，AOB的多样性下降了。DGGE测序表明，亚硝化菌依然存在，

这是因为它们能迅速的适应固定以对抗洗涤行为。DGGE更进一步的分析揭露

了较大的微粒对更多的AOB种类在反应器中的生存有好处。在SBR反应器中有

很多大小不一的微粒共存，颗粒的直径影响这AOB和NOB的分布。中小微粒

（直径<0.6mm）不能限制氧在所有污泥空间的传输。大颗粒（直径>0.9mm）

可以使含氧量降低从而限制NOB的生长。所有这些研究提供了未来对AOB微

粒系统机制可能性研究的支持。

关键词：氨氧化菌（AOB），污泥微粒，菌落发展，微粒大小，硝化菌分布，

发育多样性

•简介

在浓度足够高的条件下，氨在水环境中对水生生物有毒，并且对富营养化

有贡献。因此，废水中氨的生物降解和去除是废水处理工程的基本功能。硝化

反应，将氨通过硝化转化为硝酸盐，是去除氨的一个重要途径。这是分两步组

成的，由氨氧化和亚硝酸盐氧化细菌完成。好氧氨氧化一般是第一步，硝化反

应的限制步骤：然而，这是废水中氨去除的本质。对16SrRNA的对比分析显示，

大多数活性污泥里的氨氧化菌系统的跟ß-变形菌有关联。然而，一系列的研究

表明，在氨氧化菌的不同代和不同系有生理和生态区别，而且环境因素例如处

理常量，溶解氧，盐度，pH，自由氨例子浓度会影响氨氧化菌的种类。因此，

废水处理中氨氧化菌的生理活动和平衡对废水处理系统的设计和运行是至关重

要的。由于这个原因，对氨氧化菌生态和微生物学更深一层的了解对加强处理

效果是必须的。当今，有几个进阶技术在废水生物处理系统中被用作鉴别、刻

画微生物种类的有价值的工具。目前，分子生物技术的应用能提供氨氧化菌群

落的详细分类说明。

如今，主要由于其细胞固定策略，好氧污泥颗粒处理已经成为传统废水处

理的替代工艺。颗粒有更加彻底的紧密结构和快速适应速率。因此，颗粒污泥

系统比传统活性污泥法有更高的混合悬浮固体浓度浓度(MLSS)和更长的污泥龄

(SRT)。更长的污泥龄能提供足够长的时间让时代时间长的微生物生长(例如氨氧

化菌)。有些研究表示，硝化颗粒可以在富铵离子废水中培养出来，并且颗粒的

直径很小。其他研究报告说，大直径颗粒已经在序批式反应器(SBR)中人工合成

的有机废水里培育出来了。污泥颗粒里的大量不同微生物共存，并去除COD和

氮磷。然而，对于直径大于0.6mm的大颗粒来说，由于氧传递被限制不能到达

颗粒核心，外部好氧壳和内部厌氧地带共存。这些特性表明，大颗粒污泥内部

环境不适合氨氧化菌的生长。有些研究表明，颗粒大小和密度导致了氨氧化菌、

亚硝酸氧化菌和反硝化菌的分布和优势种群。虽然不少研究力求评估废水处理

系统中氨氧化菌的生态生理，但是至今仍然被污泥颗粒化过程的水力学、分布、

氨氧化菌群落的数量化限制着。

•原理和方法

•反应器设置和操作

污泥颗粒被接种在有效体积为4L的实验室规模的SBR里。反应器有效直径

和高度分别为10cm和51cm。水力停留时间设为8h。来自全尺寸污泥处理设置

(中国天津污水处理厂)的活性污泥被作为反应器的种污泥，其MLSS初始浓度为

3876mg/L。反应器操作6小时为一循环，由2分钟的进水时间，90分钟厌氧混

合，240反正抛弃阶段和5分钟出水阶段组成。在20天80个SBR循环后，污

泥沉降时间逐渐从10分钟降到5分钟，并且只有沉降速度大禹4.5m/h的颗粒

才能在反应器中停留。入流中的主要化合物包括NaAc(450mg/L)，

NH4Cl(100mg/L)，(NH4)2SO4(10mg/L)，KH2PO4(20mg/L)，MgSO4·7H2O(50mg/L)，

KCl(20mg/L)，CaCl2(20mg/L)，FeSO4·7H2O(1mg/L)，pH7.0-7.5，and0.1mg/L元

素示踪剂。

分析方法-TOC、TN、TP、MLSS、SVI都根据标准方法定期检测。

污泥大小分布由筛法决定。4个干净的直径为5cm钢制筛，筛孔直径分别

0.9,0.6,0.45,和0.2mm，这4个筛子被全程监控。用友刻度的圆柱从反应器中取

100mL的污泥，然后放到0.9mm筛孔的筛子上。随后用蒸馏水冲洗，直径小于

0.9mm的颗粒通过这个筛子，到达筛孔更小的筛子上。冲洗过程要重复几次，

以分开污泥团。不同面上收集到的颗粒恢复用蒸馏水反冲洗。每一部分都手机

在不同的烧杯里，然后用量化的滤纸过滤来测定TSS。一旦留在各个筛子上TSS

的数量确定了，就可以确定不同大小的颗粒占污泥总重的比例了。

•DNA提取和PCR-DGGE

来自大约8mg的MLSS种的污泥被转化成1.5mL的Eppendorf管，然后在

14000g条件下离心10分钟。移除上清液，向其中加入1mL磷酸钠缓冲液，然

后在无菌条件下研磨以分离颗粒。使用A工具，离心物种DNA染

色体被分离。

为了放大氨氧化菌特征16srRNA来进行DGGE，一个巢式PCR被用为先前

描述。30µl的巢式PCR放大剂被加载并被在聚丙烯酰胺凝胶上的加了线性分布

为35%-55%的变性剂DGGE分开。这个胶体在维持60度、140V、1×TAE缓冲液

中(通用突变检测系统)运行6.5h。电泳结束后，银染色和胶体的发展表现正如

Sanguinetti所表述。接下来是空气干燥和用凝胶成像分析系统扫描。凝胶扫描

图像用QuantityOne分析，版本号4.31。成对群落相似性的色子指数是计算评

估氨氧化菌群落在DGGE中线路相似性的。这个用QuantityOne测出的指数范

围从0%(无共同频带)到100%(频带相同)。Shannon多样性指数（H）是用来衡

量将一个菌群中每个菌种的丰富度和比例加入考虑的微生物多样性。H用下列

等式计算：

其中，ni/N表示i菌种占总群落的比例(i条带亮度在条带总亮度中的比例)。

微生物系统树图模板相似性使用QuantityOne不用非加权配对组算术平均

数（UPGMA法）算法就能计算出来。

突出的DGGE条带被切除并溶解在30mLMilli-Q水中过夜，温度维持4摄

氏度。在冷冻解冻3次后凝胶中的DNA被回收。目标DNA片段的克隆及测序

按照既定的方法（Zhang等，2010）进行。

•硝化细菌的分布

为了调查AOB和NOB在颗粒中的空间分布，3种大小([0.2-0.45],[0.45-

0.6],>0.9mm)的颗粒在第180天被选定做FISH分析。2mg的污泥样品被固定在

在4摄氏度下的4％多聚甲醛溶液16-24h，然后用磷酸钠缓冲液冲洗两次；样

本分别在在50%，80%和100%的乙醇中脱水10分钟。在室温下，将颗粒在乙

醇—二甲苯体积比分别为3:1，1:1，1:3然后100%二甲苯的溶液中连续浸泡，

每次10分钟后，颗粒中的乙醇然后完全被二甲苯取代。随后，将颗粒在二甲苯

与石蜡体积比为1:1的60度溶液中浸泡30分钟，接着再在100%石蜡溶液中浸

泡30分钟，颗粒被石蜡嵌入。在石蜡固化后，切为8mm厚的片，放置在涂了

明胶的显微镜上。将切片在二甲苯和乙醇中各浸泡30分钟，石蜡被去除，然后

将切片干燥。

三个寡核苷酸探针被用于杂交：FITC标记为Nso190，指明了大多数AOB；

TRITC标记为NIT3，指明了硝化sp。所有的探针序列，杂交条件，以及洗涤条

件都在表1中给出。寡核苷酸的合成以及荧光标记都来自Takara公司。

杂交是在包含了各个标记了的探针(5ngµ/L)的46摄氏度度杂交缓冲液

(0.9MNaCl,甲酰胺的百分比见表1，20mMTris/HCl，pH值8.0，0.01%SDS)下进

行了2小时。杂交后，未被结合的寡核苷酸由一个严格的洗涤步骤去除：在48

度与洗涤液含有相同化合物的缓冲液中洗涤15分钟。

为了所有DNA的探测，DAPI被用甲醇最终稀释到浓度为1ngµ/L。将切片

用DAP-Iemethanol覆盖并保持恒温37度15分钟。然后将切片用甲醇清洗一次，

再用蒸馏水简单清洗，完了立刻空气干燥。使用Vectashield(媒介实验室)以防止

照片变白。使用激光共聚焦显微镜来抓拍杂交图像(CLSM,Zeiss710)。每种颗粒

大小的每个探头都各自一共拍了10张图像。最后使用AdobePhotoShop选出代

表图像和最终图像的评价。

表1：用于不同大小颗粒的寡核苷酸探针

图1：生物量和SVI

10在整个操作过程中的变化

•结果

•SBR性能及颗粒特征

在启动阶段，反应器能高效去除TOC以及氨氮。98%的氨氮和100%的TOC

分别在第3天和第5天从入流中被去除(图S2，S3)。这一期间总氮和总磷的去

除率不高，虽然总磷的去除率逐渐提高，在第33天达到100%(图S4)。

为了确定污泥颗粒的污泥体积指数，沉淀时间由10分钟代替30分钟，因

为颗粒污泥在60分钟和5分钟后有一个相似的SVI数值。接种污泥的SVI值是

108.2Ml/g。在连续操作中MLSS和SVI10的变化如图1所示。污泥沉降性在设置

阶段明显提升。图2反应了污泥颗粒的慢速形成，从流动态到颗粒状态。

•DGGE技术分析：AOB的群落结构在污泥颗粒化中的变化

巢式PCR的结果在图S1中显示。在GSBR的操作中，较好显示的DGGE条

带被在代表性点上得到，那些条带揭示AOB群落的结构在污泥颗粒化和稳定化

过程中是动态的(图3)。实验结束时的菌群结构与初始接种污泥的菌群结构是不

同的。AOB群落在第一天和GSBR操作的最后仅有40%的相似度，指明接种污

泥和形成的颗粒污泥中AOB群落有重大变化。通过计算Shannon指数H分析

DGGE模板得出的生物多样性见图5.

图2：污泥中颗粒大小分布在操作过程中的变化

图3：AOB群落在污泥颗粒化过程中DGGE分析(顶部表示取样时间)。主要条带

已用数字标出(条带1-15)

在污泥接种阶段(在第38天前)，指数H由于反应器中一些菌种的消失明显

下降。虽然几种接种污泥中的优势菌种(条带2,7,10,11)得以保留，但是许多条

带削弱或消失了(条带3,4,6,8,13,14,15)。在第45天后，多样性指数趋于稳定，

并且显示流动性变小(从0.72到0.82)。

模板条带相似性利用UPGMA程序分析。UPGMA分析显示三个组菌落群相

似度约为67%-78%，群体内部约为44%-62%。一般来说，第一组与污泥接种和

冲刷有关，第二组与污泥颗粒化及SVI

10值下降有关，第三组和稳定系统及优良

的生物沉淀性有关。

图4：AOB菌落DGGE条带的UPGMA分析树图。罗马数字显示主要集群。

在图3中，占优条带被从胶体中切除。这些条带中的DNA被再次放大，克

隆及排序。对这些部分的16SrRNA排序(表2和图S6)的比较分析揭露了补偿了

的13序列的系统附属树。在接种污泥中，细菌大多由亚硝化菌和亚硝化螺菌组

成。随着污泥颗粒化进行，大多数亚硝化菌(条带2,5,7,9,10,11)仍然保留或者最

终变为GSBR的主导；然而，所有的亚硝化螺菌(条带6,13,15)都从反应器中逐渐

消失。

•AOB和NOB在不同尺寸颗粒中的分布

我们使用FISH来确定AOB和NOB在不同尺寸污泥颗粒中的分布，得出的

图像并没有进一步分析得出细胞数量。如图6所示，在小颗粒(0.2mm

mm)中，AOB主要分布在颗粒空间的外部。在中等颗粒(0.45mm

AOB甚至能分布到整个颗粒空间，而NOB依然只存在于内部空间。在大颗粒

(d>0.9mm)中，AOB和NOB大都处于颗粒的表面，更有甚者，NOB开始变得稀

有。

•讨论

•污泥颗粒形成与反应器性能之间的关系

在第32天后，SVI

10稳定在20-35mL/g，相对于测得的活性污泥的

SVI10(100-150mL/g)，这是一个非常低的数值。然而，在第32天测得的颗粒大

小分布(图2)表面仅有22%的生物量是由直径大于0.2mm的颗粒污泥组成的。

这些结果表面污泥沉降性提升提前于颗粒的形成，并在GSBR操作过程中不受

不同污泥颗粒大小的影响。

然而我们观察到，颗粒直径在较长时间内一直波动。大颗粒由于生物内部

呼吸趋于不稳定，并分裂成可以再次形成大颗粒的小种子颗粒。Pochana和

Keller报告说，通过物理破碎形成的污泥絮体有助于降低反硝化速率，因为其减

少的缺氧空间。所以，在这次试验过程中，总氮的去除率也是波动的。一些先

前研究已经证明，更大体积、更大密度的颗粒青睐于富裕的PAO。因此，在第

77天后，总磷的去除率变得更高并相对稳定，这是由于颗粒的质量分数在90%

以上了，并且有更大的颗粒形成了。

•AOB群落动态与污泥颗粒化的关系

为了颗粒形成，我们设定了小段的沉淀时间，并且仅有沉淀速度大于

4.5m/h的颗粒才会在反应器中去除。而且正如图1所示，SVI10值的变化在第

41天前很大(从108.2mL/g-34.1mL/g)。在这一期间，大量微生物不能再反应器

中生存。我们观测到一个明显的菌数量增长，与第8天与第18天(表S1)有58%

的相似性。在用基于醋酸合成废水喂养的SBR系统中，非自养菌能比自养菌产

生大量更多的胞外多糖。一些研究者发现，微生物在高剪切力的环境中会粘附

胞外聚合物质以抵抗由于环境压力导致的悬浮细胞的伤害。而且，已经被证明

的是，接种污

表2：选中的DGGE条带的微生物种类鉴别

泥中的优势异养菌在我们先前的研究中得以保存。众所周知，AOB是生长

缓慢的化能自养菌，因此，大量数量和密度不能变的足够大以快速沉淀的群落

被从系统中洗出去。作为结果，AOB在污泥接种阶段的变化很明显，多样性指

数快速下降。在第45天后，由于污泥稳定性的发展和更多微生物的保留，AOB

群落的结构变的稳定。这些结果表明，短沉淀时间(选择压力)表面上能给微生物

加压，导致AOB群落处于暴力动态中。

这些结果更进一步说明，特定数目的微生物可能归功于GSBR操作上的成

功，而且能得以持续，不管在群体相似性方面波动有多大。这些细菌群体的不

稳定性，加上一般可接受的生物反应器性能，是符合从处理灰水的MBR所得到

的结果的。

亚硝化螺菌属和亚硝化菌属是废水处理系统中AOB群落的主体。一个新先

前研究揭露，AOB群落的主导群体十余多种污水处理过程不同的。一些研究者

发现，在MBRs中是亚硝化菌为菌落主体，而在生物滤池中则是亚硝化螺菌属

为菌落主体。在现今的研究中，序列分析表明选择压力明显对颗粒污泥中的亚

硝化菌生存有影响。几乎所有的亚硝化菌一开始就被洗出，他们没有机会跟着

环境变化进化。然而，一些亚硝化螺菌属的成员能产生更多两的EPS，特别是

处于氨被限制的条件下；而且这种特性也同一条带上的其他成员身上观察到。

由此，这些EPS对群落细胞之间以及颗粒污泥是有帮助的。因此，大多数亚硝

化螺菌能适应这一挑战(体积和密度变得足够大以快速沉淀)并在反应器中保存。

在反应器操作的最后(第180天)，不同大小的颗粒被过滤出来。我们研究

了污泥颗粒大小变化对AOB群落组成的影响。如图5所示，不同大小颗粒的

AOB群落结构不同。虽然集中主导条带(条带2，5，11)。在所有样品中都出现

了，仅有条带3和6在直径大于0.6mm的颗粒上出现。同时，条带7和10在

直径大于

图5：不同大小颗粒AOB群落的DGGE文件

0.45mm的颗粒上强烈显示。根据表2，我们可以清晰的推断，亚硝化菌仅仅能

在直径大于0.6mm的颗粒上存在。因此，亚硝化菌在图3上几乎不存在，这是

由于反应器操作中，在TSS中的大颗粒分数较低所导致的。

DGGE分析也解释，大颗粒有比小颗粒更丰富的生物多样性。这一结果也

阐明，由于更大的空间和更适合生长的环境，更多的微生物能在大颗粒上生存

(图6)。

图6：不同直径污泥颗粒微生物FISH分析结果

•颗粒大小对AOB和NOB分布的影响

虽然实验中进水颗粒大小已经被观测，并模拟同时脱氮除磷，颗粒大小对

不同生物种类分布的影响需要更进一步的研究，这一研究将借助可见的实验结

果，特别是在有同样大小颗粒污泥的反应器中。对于颗粒污泥中细菌群落的相

关研究总是针对单个大小颗粒中重要基础细菌群体分布。在现今的研究中，不

同大小颗粒被过滤出来，AOB和NOB的分布被分别研究。在理想硝化过程中，

AOB和NOB在颗粒中为了空间和氧而竞争。由于氨氧化者有更高的亲氧性，并

在反应器中比硝化者积累的更快，NOB就在AOB层的下面，那里仍然有一些氧

存在，这些氧允许硝化反应的产生。在小颗粒中，两种生物种类的位置分界线

很清楚，这是由于颗粒提供了限制的存在空间，而在这一空间中两种微生物都

可以生长。当氧和氨存在的情况下，AOB存在于颗粒外部。中等颗粒能为微生

物繁殖提供更大的空间；由此，AOB在整个颗粒中都有分布。这一结果同时证

实，当颗粒直径小于0.6mm时，氧能够不受限制的深入颗粒核心。一些数学模

型同样支持这一观点：NOBs更适宜在小颗粒中生长，因为那里的含氧量更高。

正如一系列实验结果所示，亚硝酸盐累积伴随着大颗粒(0.9mm)的形成同时发生。

这个现象可归因于联系着大颗粒的较小含氧量的氨表面负荷增长，结果就是

NOB失去竞争力。这同时说明，大颗粒(0.9mm)核心区域能提供缺氧环境供反硝

化菌生长。如图2和图3所示，大颗粒形成后总氮去除率提升了。

•总结

AOB群落结构的变化在污泥接种的时候很明显，同时群体多样性指数下降

很快。大多接种污泥中的亚硝化螺菌由于其快速适应固定能力对抗冲洗行动而

得以保存。DGGE分析也揭示，大颗粒比小颗粒有更高的AOB多样性。在直径

小于0.6mm的颗粒中，氧的渗透不受限制。然而，大颗粒(d>0.9mm)能形成较

低的氧含量以及NOB的生长。自此以后，关于控制和优化颗粒大小分布的更进

一步的研究可以对氮去除和广阔的颗粒污泥技术有益。