光学显微镜的基本构造及使用

光学显微镜的基本构造

导语：光学显微镜在生物学中已经非常的广泛了，在各大领域都能用到，如何做到了解显微镜的使用方法，那就需要了解显微镜的基本构造，才能知道怎么使用。下面介绍一下光学显微镜的基本构造吧!

光学显微镜的基本构造

镜座

位于显微镜底部，呈马蹄形，它支持全镜。

镜臂

位于镜筒后面，为弓形，起支持镜筒和搬移显微镜时握持部位。有固定和活动式两种，镜臂可改变角度。

镜柱

是在镜座后方中部直立向上的部分，支持镜臂及以上部分。

转换器

位于镜筒下方，为两个金属碟合成的一个转盘，有3~4个圆孔，可装配不同放大率的物镜，可使每个物镜通过镜筒与目镜构成一个放大系统。

载物台

也叫工作台或镜台，方形或圆形，为放置标本之用。载物台上有两个金属压夹，用作固定玻片标本。有的载物台上装有玻片移动器，可固定和移动标本之用。载物台中央有一通光孔，反射镜反射上来的光线，通过通光孔而透到标本上。

调焦装置

为了得到清晰的图像，必须调节物镜与标本之间的距离，使物镜的焦点对准标本，这一操作叫调焦。在显微镜的镜臂上装有大小螺旋各一对。大的叫粗动调焦螺旋每 旋转一周可使镜筒升降20毫米;小的微动调焦螺旋，每旋转一周可使镜筒升降0.1毫米或更小。由于显微镜型号的不同，调焦有不同方式。较新型的显微镜，借助调焦螺旋，使载物台升降进行调焦。

物镜

安装在镜筒下端的物镜转换器下方，因为它靠近被视物体，故又称接物镜。物镜是决定显微镜性能如分辨力的最重要的构件。物镜的作用是将标本第一次放大成倒像。一台显微镜备有数个物镜，每个物镜由数片不同球面半径的透镜组成。物镜下端的透镜口径越小，镜筒越长，其放大倍数越高;否则反之。物镜有低倍物镜和高倍物镜，其放大倍数一般刻在物镜的镜筒上，例如4×、8×、10×、40×、45×、65×、90×、100×，分别表示4倍、8倍、10倍……。其中40-65倍叫高倍物镜，90或100倍的称为油浸物镜(使用时需在标本和物镜之间加入折射率大于1，而与玻璃折射率相近的液体，如香柏油作为介质)。

目镜

安装在镜筒上端，因为它靠近观察者的眼睛，又称接目镜。目镜的作用是将由物镜放大的实像进一步放大成一个起立的虚像，其作用相当于一个放大镜。但它并不增 加显微镜的分辨力。目镜的镜筒内可安装一段头发，在视野内则为一黑线，叫做“指针”，可以指示所观察的部位。根据需要，目镜内也可安装测微尺，用以测量所观察物体的大小。一般显微镜备有几个放大倍数不同的目镜，其放大倍数刻在目镜边框上，如5×、10×、15×等。(显微镜的总放大倍数=物镜放大倍数×目镜放大倍数)

聚光镜

安装在载物台下方支架上，主要由聚光镜和可变光阑组成。聚光镜作用是会聚由反射镜反射来的光线，增加标本的照明。可变光阑位于聚光镜下方，又称光圈，由十 余片金属薄片组成，中心部分形成圆孔。推动楞变光阑把手，可调节圆孔大小，以调节光线的强弱。升降聚光器，也可调节照明强度。在可变光阑下面，还有一个圆 形的滤光片架，可根据镜检需要放置滤光片。

反射镜

又叫反光镜。安装在聚光器或转盘下方，其作用是把光源投射来的光向上反射到聚光器直到标本等。它楞以朝任意方向旋转以对准光源。反射镜通常一面是平面镜，另一面是凹面镜。没有聚光器的显微镜，使用低物镜时用平面镜，使用高倍物镜时则用凹面镜，因凹面镜也会有聚光作用。有聚光器的显微镜，一般用平面镜，如果室内光线弱时，则可使用凹面镜。

显微镜的工作原理

光学显微镜由两组镜片(目镜和物镜)组成，每组镜片相当于一个凸透镜。物镜的焦距很短，目镜的焦距较长。工作原理：物体先经过物镜成放大的实像，再经目镜成放大的虚像，二次放大，便能看清楚微小的物体。

1、显微镜的基本光学原理

(一) 折射和折射率

光线在均匀的各向同性介质中，两点之间以直线传播，当通过不同密度介质的透明物体时，则发生折射现象，这是由于光在不同介质的传播速度不同造成的。当与透明物面不垂直的光线由空气射入透明物体(如玻璃)时，光线在其介面改变了方向，并和法线构成折射角。

(二) 透镜的性能

透镜是组成显微镜光学系统的最基本的光学元件，物镜目镜及聚光镜等部件均由单个和多个透镜组成。依其外形的不同，可分为凸透镜(正透镜)和凹透镜(负透镜)两大类。

当一束平行于光轴的光线通过凸透镜后相交于一点，这个点称"焦点"，通过交点并垂直光轴的平面，称"焦平面"。焦点有两个，在物方空间的焦点，称"物方焦点"，该处的焦平面，称"物方焦平面";反之，在象方空间的焦点，称"象方焦点"，该处的焦平面，称"象方焦平面"。

光线通过凹透镜后，成正立虚像，而凸透镜则成正立实像。实像可在屏幕上显现出来，而虚像不能。

(三) 凸透镜的五种成象规律

1. 当物体位于透镜物方二倍焦距以外时，则在象方二倍焦距以内、焦点以外形成缩小的倒立实象;

2. 当物体位于透镜物方二倍焦距上时，则在象方二倍焦距上形成同样大小的倒立实象;

3. 当物体位于透镜物方二倍焦距以内，焦点以外时，则在象方二倍焦距以外形成放大的倒立实象;

4. 当物体位于透镜物方焦点上时，则象方不能成象;

5. 当物体位于透镜物方焦点以内时，则象方也无象的形成，而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成放大的直立虚象。

2 光学显微镜的成象(几何成象)原理

只有当物体对人眼的张角不小于某一值时，肉眼才能区别其各个细部，该量称为目视分辨率ε。在最佳条件下，即物体的照度为50~70lx及其对比度较大时，可达到1'。为易于观测，一般将该量加大到2'，并取此为平均目镜分辨率。

物体视角的大小与该物体的长度尺寸和物体至眼睛的距离有关。有公式y=Lε

距离L不能取得很小，因为眼睛的调节能力有一定限度，尤其是眼睛在接近调节能力的极限范围工作时，会使视力极度疲劳。对于标准(正视)而言，最佳的视距规定为250mm(明视距离)。这意味着，在没有仪器的条件下，目视分辨率ε=2'的眼睛，能清楚地区分大小为0.15mm的物体细节。

在观测视角小于1'的物体时，必须使用放大仪器。放大镜和显微镜是用于观测放置在观测人员近处应予放大的物体的。

(一) 放大镜的成像原理

表面为曲面的玻璃或其他透明材料制成的光学透镜可以使物体放大成像，光路图如图1所示。位于物方焦点F以内的物AB，其大小为y，它被放大镜成一大小为y'的虚像A'B'。

放大镜的放大率

Γ=250/f'

式中250--明视距离，单位为mm

f'--放大镜焦距，单位为mm

该放大率是指在250mm的距离内用放大镜观察到的物体像的视角同没有放大镜观察到的物体视角的比值。

(二) 显微镜的成像原理

显微镜和放大镜起着同样的作用，就是把近处的微小物体成一放大的像，以供人眼观察。只是显微镜比放大镜可以具有更高的放大率而已。

图2是物体被显微镜成像的原理图。图中为方便计，把物镜L1和目镜L2均以单块透镜表示。物体AB位于物镜前方，离开物镜的距离大于物镜的焦距，但小于两倍物镜焦距。所以，它经物镜以后，必然形成一个倒立的放大的实像A'B'。 A'B'位于目镜的物方焦点F2上，或者在很靠近F2的位置上。再经目镜放大为虚像A''B''后供眼睛观察。虚像A''B''的位置取决于F2和A'B'之间的距离，可以在无限远处(当A'B'位于F2上时)，也可以在观察者的明视距离处(当A'B'在图中焦点F2之右边时)。目镜的作用与放大镜一样。所不同的只是眼睛通过目镜所看到的不是物体本身，而是物体被物镜所成的已经放大了一次的像。

(三) 显微镜的重要光学技术参数

在镜检时，人们总是希望能清晰而明亮的理想图象，这就需要显微镜的各项光学技术参数达到一定的标准，并且要求在使用时，必须根据镜检的目的和实际情况来协调各参数的关系。只有这样，才能充分发挥显微镜应有的性能，得到满意的镜检效果。

显微镜的光学技术参数包括：数值孔径、分辨率、放大率、焦深、视场宽度、覆盖差、工作距离等等。这些参数并不都是越高越好，它们之间是相互联系又相互制约的，在使用时，应根据镜检的目的和实际情况来协调参数间的关系，但应以保证分辨率为准。

1. 数值孔径

数值孔径简写NA，数值孔径是物镜和聚光镜的主要技术参数，是判断两者(尤其对物镜而言)性能高低的重要标志。其数值的大小，分别标刻在物镜和聚光镜的外壳上。

数值孔径(NA)是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率(n)和孔径角(u)半数的正弦之乘积。用公式表示如下：NA=nsinu/2

孔径角又称"镜口角"，是物镜光轴上的物体点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度。孔径角越大，进入物镜的光通亮就越大，它与物镜的有效直径成正比，与焦点的距离成反比。

显微镜观察时，若想增大NA值，孔径角是无法增大的，唯一的办法是增大介质的折射率n值。基于这一原理，就产生了水浸物镜和油浸物镜，因介质的折射率n值大于1，NA值就能大于1。

数值孔径最大值为1.4，这个数值在理论上和技术上都达到了极限。目前，有用折射率高的.溴萘作介质，溴萘的折射率为1.66,所以NA值可大于1.4。

这里必须指出，为了充分发挥物镜数值孔径的作用，在观察时，聚光镜的NA值应等于或略大于物镜的NA值。

数值孔径与其他技术参数有着密切的关系，它几乎决定和影响着其他各项技术参数。它与分辨率成正比，与放大率成正比，与焦深成反比，NA值增大，视场宽度与工作距离都会相应地变小。

2. 分辨率

显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距，又称"鉴别率"。其计算公式是σ=λ/NA

式中σ为最小分辨距离;λ为光线的波长;NA为物镜的数值孔径。可见物镜的分辨率是由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定。NA值越大，照明光线波长越短，则σ值越小，分辨率就越高。

要提高分辨率，即减小σ值，可采取以下措施

(1) 降低波长λ值，使用短波长光源。

(2) 增大介质n值以提高NA值(NA=nsinu/2)。

(3) 增大孔径角u值以提高NA值。

(4) 增加明暗反差。

3. 放大率和有效放大率

由于经过物镜和目镜的两次放大，所以显微镜总的放大率Γ应该是物镜放大率β和目镜放大率Γ1的乘积：

Γ=βΓ1

显然，和放大镜相比，显微镜可以具有高得多的放大率，并且通过调换不同放大率的物镜和目镜，能够方便地改变显微镜的放大率。

放大率也是显微镜的重要参数，但也不能盲目相信放大率越高越好。显微镜放大倍率的极限即有效放大倍率。

分辨率和放大倍率是两个不同的但又互有联系的概念。有关系式：500NA<Γ<1000NA

当选用的物镜数值孔径不够大，即分辨率不够高时，显微镜不能分清物体的微细结构，此时即使过度地增大放大倍率，得到的也只能是一个轮廓虽大但细节不清的图像，称为无效放大倍率。反之如果分辨率已满足要求而放大倍率不足，则显微镜虽已具备分辨的能力，但因图像太小而仍然不能被人眼清晰视见。所以为了充分发挥显微镜的分辨能力，应使数值孔径与显微镜总放大倍率合理匹配。

4. 焦深

焦深为焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也能看得清楚，这个清楚部分的厚度就是焦深。焦深大, 可以看到被检物体的全层，而焦深小，则只能看到被检物体的一薄层，焦深与其他技术参数有以下关系：

(1) 焦深与总放大倍数及物镜的数值孔径成反比。

(2) 焦深大，分辨率降低。

由于低倍物镜的景深较大，所以在低倍物镜照相时造成困难。

5. 视场直径(Field Of View)

观察显微镜时，所看到的明亮的圆形范围叫视场，它的大小是由目镜里的视场光阑决定的。

视场直径也称视场宽度，是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检物体的实际范围。视场直径愈大，愈便于观察。

有公式 F=FN/β

式中F: 视场直径，FN：视场数(Field Number, 简写为FN，标刻在目镜的镜筒外侧)，β:物镜放大率。

由公式可看出：

(1) 视场直径与视场数成正比。

(2) 增大物镜的倍数，则视场直径减小。因此，若在低倍镜下可以看到被检物体的全貌，而换成高倍物镜，就只能看到被检物体的很小一部份。

6. 覆盖差

显微镜的光学系统也包括盖玻片在内。由于盖玻片的厚度不标准，光线从盖玻片进入空气产生折射后的光路发生了改变，从而产生了相差，这就是覆盖差。覆盖差的产生影响了显微镜的成响质量。

国际上规定，盖玻片的标准厚度为0.17mm，许可范围在0.16-0.18mm，在物镜的制造上已将此厚度范围的相差计算在内。物镜外壳上标的0.17，即表明该物镜所要求的盖玻片的厚度。

7. 工作距离WD

工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。镜检时，被检物体应处在物镜的一倍至二倍焦距之间。因此，它与焦距是两个概念，平时习惯所说的调焦，实际上是调节工作距离。

在物镜数值孔径一定的情况下，工作距离短孔径角则大。

数值孔径大的高倍物镜，其工作距离小。