kb片段

SMARTer™RACEcDNA扩增试剂盒实验流程

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SMARTer™RACEcDNA扩增试剂盒

操作一览(PT4096-2)

本操作一览仅为实验流程，对于初用者，请在使用操作一览前仔细阅读SMARTerRACE

cDNA扩增试剂盒(.634923&634924)的说明书。

一、RACE-ReadycDNA的准备

为了获得RACE-ReadycDNA(说明书的SectionV)，请准备5’-&3’-RACE-ReadycDNA合成

反应体系，共需要4个反应管，每管均为10µl反应体系。

1.混匀以下试剂，并瞬时离心。在进行Step7前，将反应管室温放置:

2.0µl5XFirst-StrandBuffer

1.0µlDTT(20mM)

1.0µldNTPMix(10mM)

4.0µl总体积

2.分别向这些管中加入对应的以下试剂：

准备5'-RACE-ReadycDNA准备3'-RACE-ReadycDNA

1.0–2.75µlRNA*1.0–3.75µlRNA*

1.0µl5'-CDSPrimerA1.0µl3'-CDSPrimerA

*使用1µl对照小鼠心脏总RNA(1µg/µl)。

3.将step2中的5'-RACE-ReadycDNA定容至3.75µl；将3'-RACE-ReadycDNA定容至4.75µl。

4.混匀试剂，瞬时离心。

5.72°C孵育3min，然后42°C冷却2min。最后14,000rpm离心10c。

注意:此步骤在PCR仪中进行，在孵育时，准备step7。

6.向5’RACE反应管中各加入1µlSMARTerIIAoligo，混匀后瞬时离心。

7.室温下，按顺序混匀以下试剂：

4.0µlBufferMix（Step1）

0.25µlRNaInhibitor(40U/µl)

1.0µlSMARTScribe™ReverTranscripta(100U)

5.25µl总体积

8.将分别向Step5和step6中变性的RNA反应物管中加入Step7中的5.25µl混合物，每管

体积均为10µl。

9.使用枪轻柔地混匀试剂，瞬时离心。

10.42°C孵育90min。

11.70°C加热10min终止反应。

12.用TE缓冲液稀释第一链反应产物：

•Add20µlifyoustartedwith<200ngoftotalRNA.

•Add100µlifyoustartedwith>200ngoftotalRNA.

•Add250µlifyoustartedwithpolyA+RNA.

13.反应产物–20°C可保存最多3个月。

二、快速扩增cDNA末端(RACE)

阳性对照RACEPCR实验(说明书的SectionVI.B)

快速扩增cDNA末端(RACE)(说明书的SectionVI.D)

基因特异性引物(GSPs)：

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•23–28nt

•50–70%GC

•Tm≥65°C；最好使用Tm>70°C(用于使用降落(touchdown)PCR)

•与UniversalPrimerMix3’-end不能有配对

使用TFR（看家基因）primers和UPM扩增阳性对照的5’-和3’-RACE。尽管试剂盒中提

供有NestedUniversalPrimerA(NUP)，但在SMARTerRACE扩增中并不是必须进行nestedPCR

扩增的。

请注意，所有的RACEPCR反应都是针对Advantage®2PolymeraMix优化的。

1.各准备50µl的5’-和3’-RACE反应体系，按照顺序混匀以下试剂：

34.5µlPCR-GradeWater

5.0µl10XAdvantage2PCRBuffer

1.0µldNTPMix(10mM;inSMARTerRACEorAdvantage2PCRKit)

1.0µl50XAdvantage2PolymeraMix

41.5µl总体积

2.旋涡混匀试剂(切勿产生气泡)，瞬时离心。

3.5’-RACE:按照TableI准备反应体系。

3’-RACE:按照TableII准备反应体系。.

在0.5mlPCR离心管中按照顺序加入试剂，轻柔混匀。

*若您的RNA样本不是哺乳动物样本，请忽略此反应。或将引物换成您的样本的看家基因进行扩增。

†若没有设计overlappingRACE片段，请忽略此反应。

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*若您的RNA样本不是哺乳动物样本，请忽略此反应。或将引物换成您的样本的看家基因进行扩增。

†若没有设计overlappingRACE片段，请忽略此反应。

4.选择下列合适的扩增程序进行PCR扩增。

注意:对于0.2-2kb片段的扩增，建议延伸2min；对于2-4kb片段的扩增，建议延伸时间

为3min；对于5-10kb片段的扩增，建议延伸时间至少为10min。

PCR扩增程序1(推荐GSP的Tm>70°C)

•5cycles:

94°C30c

72°C3min*

•5cycles:

94°C30c

70°C30c

72°C3min*

•20cycles(PolyA+RNA)或者25cycles(TotalRNA):

94°C30c

68°C30c

72°C3min*

*若扩增片段>3kb，每增加1kb，延伸时间增加1min。

扩增程序2(GSP的Tm=60–70℃)

•20cycles(PolyA+RNA)或者25cycles(TotalRNA):

94°C30c

68°C30c

72°C3min*

*若扩增片段>3kb，每增加1kb，延伸时间增加1min。

如果扩增结果没有特异带时，您可以使用cDNA探针或NGSP引物作为探针来做

westhernblot分析。

您还可以利用NUPprimers来做巢氏PCR：

取5µlPCR产品加入到245µl的TE中，1µlNUPprimer和1µlNGSPs引物，扩增程序2，

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做15-20个循环。

三、5‘RACE随机引物扩增

1.72℃预热PCR仪。

2.准备2个PCR管（对照组和实验组），按照顺序混匀以下试剂：

1–2.75µlRNA(50ng–1μg)*

1µl10XRandomPrimerMix(N-15)(20μm)

xµlDeionizedH

2

O

3.75µl总体积

*使用1µl对照小鼠心脏总RNA(1µg/µl)。

3.瞬时离心。

4.72℃孵育3min，然后室温（22℃）放置2min。

5.在进行Step4的孵育时，您可以在室温下按照顺序混匀以下试剂：

2µl5XFirst-StrandBuffer

1µlDTT(20mM)

1µldNTPMix(10mM)

0.25µlRNaInhibitor

1µlSMARTerIIAOligonucleotide(12μm)

1µlSMARTScribe™ReverTranscripta(100U/µl)†

6.25µl总体积

†在使用前，最后加入反转录酶。

6.向Step4的反应管中分别加入6.25µl混合液，用枪混匀并瞬时离心。

7.室温孵育10min，然后42℃放置90min。

8.70℃加热10min终止反应。

9.使用TE缓冲液稀释第一链反应产物：

•Add20µlifyoustartedwith<200ngoftotalRNA.‡

•Add100µlifyoustartedwith>200ngoftotalRNA.‡

•Add250µlifyoustartedwithpolyA+RNA.

‡目的基因的拷贝数应该是影响样本稀释的主要因素。

若总RNA含量为200ng，目的基因丰度很低，那么使用20ul体积稀释样本；总RNA含

量为200ng，目的基因丰度很高，那么使用100ul体积稀释样本。

10.反应产物–20°C可保存最多3个月。

11.阳性对照的RACEPCR实验。

按照说明书的SectionVI.B.部分进行阳性对照的RACEPCR实验。

12.快速扩增5’cDNAEnds(RACE)

按照说明书的SectionVI.D.部分进行5’cDNAEnds的RACEPCR实验。

四、结果分析

1.阳性对照的结果分析

5’RACE的TFR片段为2.1kb；3’RACE的TFR片段为3.1kb。

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2.问题实验样本分析

5’RACEPCR扩增无特异条带：

可能原因：

•目的基因丰度低；

•GSP1效率不一定高；

•cDNA第一链合成失败；

•模板有污染。

测序结果不是自己的基因。

可能原因：

•RNA降解或不纯；

•引物特异性很差，可以用NGSPs进行二次PCR。