acoh

糖类物质的衍生化试剂——氘代PMP和类似物的合成及

其衍生化性能*

张萍1，2，王仲孚2，黄琳娟2

【摘要】摘要：在冰醋酸催化的无溶剂条件下，于室温合成了氘代PMP及其

类似物——1-五氘代苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(d5-PMP)，1，3-二苯基-5-吡

唑啉酮(DPP)和1-(4-异丙苯基)-3-甲基-5-吡唑啉酮(PPMP)，其中d5-PMP和

PPMP为新化合物,其结构经UV,1HNMR，13CNMR，MS及元素分析表征。

通过ESI-MS对d5-PMP，DPP及PPMP与乳糖的衍生化性能进行了初步研

究。结果表明，d5-PMP和乳糖的反应活性最高，衍生物以双分子标记物为主，

衍生化性能与d0-PMP相当；DPP的反应活性最低，单分子和双分子标记物产

率相当，不适用于糖类物质的衍生化分析；PPMP的反应活性仅次于d5-PMP

或d0-PMP，生成稳定性较好的单分子标记物的倾向较大,优化衍生条件使其定

量进行可用于糖类物质分析。

【期刊名称】合成化学

【年(卷),期】2013(021)003

【总页数】6

【关键词】关键词：吡唑啉酮；酸催化；乳糖；合成;衍生化性能

·研究论文·

糖类物质的研究已成为生命科学研究的热点。天然糖类物质本身极性较大、没

有发光基团，无法直接运用紫外或荧光检测技术进行分析，加之糖类物质的离

子化效率较低，对微量组分来说，目前的质谱检测技术也无法满足灵敏度要求。

因此，糖链的衍生化技术已成为近年来研究的热点之一。

1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)属于1，3-取代的吡唑啉酮类试剂，其4-C

具有较高的负电性，可以发生亲核反应。该类试剂在医药行业中可作为脑自由

基清除剂以治疗急性脑梗塞[1～3]。1989年，Honda等[4]首次使用PMP在

碱性环境下标记还原糖，并实现糖链衍生物的反相高效液相色谱(RP-HPLC)分

离。之后PMP作为一种糖类物质的衍生化试剂不断被推广应用，衍生化条件

也不断被改善。由于PMP衍生物表现出良好的色谱、质谱分析检测性能，并

且衍生化条件温和，和广泛使用的还原氨化试剂相比，不会引起糖基化丢失现

象，在寡糖的单糖组成分析、糖蛋白糖链的结构分析等方面已广泛使用[5]。但

目前还存在两个主要问题需要解决：一是缺乏商品化PMP同位素试剂，使其

在糖链的同位素标记-质谱相对定量分析方面的应用目前仍属空白；二是PMP

试剂疏水性偏低，衍生物稳定性不理想，且类似物种类少，无法满足当前种类

复杂的糖类物质分析检测的需要。因此，对氘代-PMP及其类似物即1，3-取

代吡唑啉酮类试剂的合成研究具有重要意义。

传统的吡唑啉酮类化合物的合成一般是将含β-羰基的酯类化合物与肼类衍生物

在酸性条件下加热反应合成[6～8]。近年来发展的合成工艺有：固相合成[9]、

微波辐射合成[10]以及超声介导的无溶剂合成[3]等技术。

本文以合成产率高、工艺简单以及成本低廉为目的，对1，3-取代的吡唑啉酮

化合物的合成工艺进行了改进，采用冰醋酸催化的无溶剂合成法合成了1-五氘

代苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(d5-PMP)及其类似物1，3-二苯基-5-吡唑啉酮

(DPP)和1-(4-异丙苯基)-3-甲基-5-吡唑啉酮(PPMP)(Scheme1),其中d5-

PMP和PPMP为新化合物,其结构经UV,1HNMR，13CNMR，MS及元素

表征。并通过ESI-MS对d5-PMP，DPP及PPMP与乳糖的衍生化性能进行

了初步研究。

d5-PMP

Scheme1

1实验部分

1.1仪器与试剂

UV254型紫外分析仪；PerkinElmerLambda25型紫外可见分光光度计；

Varian-400型核磁共振仪(CDCl3为溶剂，TMS为内标)；LTQ-XL型质谱仪；

VarioELⅢ型元素分析仪。

d5-苯肼按文献[11]方法合成；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(d0-PMP)，

Sigma-Aldrich公司；d5-苯胺，4-异丙基苯肼盐酸盐(98%)和苯肼，Sigma-

Aldrich公司；乙酰乙酸乙酯和苯甲酰乙酸乙酯，分析纯，国药集团化学试剂

有限公司；薄层硅胶板UV254，德国MACHEREY-NAGEL公司；其余所用试

剂均为化学纯或分析纯。

1.2合成

(1)d5-PMP的合成

在反应瓶中加入d5-苯肼8.76g(77mmol)，搅拌下依次滴加冰乙酸1.0mL

和乙酰乙酸乙酯9.8mL(77mmol)，滴毕，于25℃～30℃反应5h[TLC检测,

展开剂：A=V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=3∶2，对照品d0-PMP]。加CH2Cl2

50mL，搅拌均匀后，于40℃减压抽干得黏稠状粗品，经硅胶柱层析[石油醚

湿法装柱(5.8cm×25cm)并平衡，粗品用少量甲醇溶解后，加入硅胶拌匀，挥

干甲醇后上柱，洗脱剂：V(二氯甲烷)∶V(乙酸乙酯)=6∶1，对照品d0-PMP]

纯化，收集含d5-PMP的流出液，于35℃减压蒸除溶剂得浅黄色粉末d5-

PMP8.5g，收率61.68%,纯度99.30%(HPLC),m.p.124℃～127℃；UV-

Vis(EtOH)：λmax=247nm;1HNMRδ：2.19(s，3H，CH3)，3.45(s，

2H，CH2)；13Cδ：16.98(CH3)，43.04(CH2)，118.34(N=C)，128.50，

137.82，156.28，170.50(C=O)；ESI-MSm/z：180.3{[M+H]+}；

orC10H5N2OD5：C67.03，H2.81，N15.62,D5.62；

foundC67.07，H2.79，N15.69,D5.56。

(2)DPP的合成

在反应瓶中加入苯肼5.5g(50mmol)，搅拌下于室温依次滴加苯甲酰乙酸乙酯

9.0mL(50mmol)和冰乙酸1.0mL，滴毕，于室温反应30min，生成大量白

色乳状固体，继续碾磨反应2h(TLC检测，二氯甲烷为展开剂)。固体用少量正

己烷洗涤，用乙醇重结晶得白色粉末DPP4.418g，收率93.6%，纯度

99.5%(HPLC)，m.p.136℃～137℃；UV-Vis(EtOH):λmax=270nm；1H

NMRδ：3.87(s，2H，CH2)，7.23，7.46(AA′XX′，4H，N-PhH)，

7.79，7.97(AA′XX′,4H,C-PhH)；13CNMRδ：39.64(CH2)，

119.04(N=C)，125.29，125.95，128.85，128.90，130.70，

130.80(CHinPh)，138.06，154.62(CinPh)，170.21(C=O)；ESI-MS

m/z：237.3{[M+H]+}；orC15H12N2O：C76.27，H5.12，

N11.85；foundC76.21，H5.17，N11.82。

(3)PPMP的合成

在反应瓶中加入4-异丙基苯肼盐酸盐3.734g(20mmol)，搅拌下滴加

5%NaOH溶液17mL，滴毕，于30℃反应4h;用1mol·L-1盐酸中和至pH

8～9，用二氯甲烷萃取至在紫外灯下无明显荧光斑点。合并二氯甲烷，蒸干得

浅黄色固体4-异丙基苯肼(2.90g，收率96.76%)。加乙酰乙酸乙酯2.5mL和

冰乙酸1.0mL，于室温反应6h(TLC检测，展开剂：A=3∶1)。减压抽去过

量的冰乙酸，经硅胶柱层析(洗脱剂：A=4∶1，TLC检测分管收集)纯化，洗

脱液作ESI-MS检测，收集分子量为216的洗脱液，减压蒸干得乳黄色粉末

PPMP3.09g，收率73.90%，纯度99.20%(HPLC),m.p.112℃～114℃；

UV-Vis(EtOH)：λmax=248nm;1HNMRδ：1.24(d，J=7.02Hz，6H，

CH3)，2.19(s，3H，5-CH3)，2.91(pt，J=7.02Hz，1H，CHMe2)，

3.45(s，2H，CH2)，7.25，7.40(AA′XX′，4H，ArH)；13CNMRδ：

16.95[CH(CH3)2]，23.90(5-CH3)，33.57(CH2)，42.93[CH(CH3)2]，

119.09(N=C)，126.65，135.60(CHinAr)，145.77，156.06(CinAr)，

170.37(C=O)；ESI-MSm/z：217.4{[M+H]+}；or

C13H16N2O：C72.20，H7.45，N12.95;foundC72.27，H7.39，N

12.93。

1.3d5-PMP，DPP和PPMP与乳糖的衍生化性能测定

以乳糖(Lac)为研究对象，考察了d5-PMP，DPP和PPMP与Lac的反应活性

及产物Lac-d5-PMP，Lac-DPP及Lac-PPMP的ESI-MS响应情况[以β-环糊

精(CD)为内标物]。

取100mmol·L-1的Lac水溶液10μL，加入10mmol·L-1的CD水溶液100

μL制得溶液A。溶液A用蒸馏水稀释至1.0mL用于ESI-MS检测。

取溶液A3份，分别加入50mmol·L-1的d5-PMP，DPP及PPMP的甲醇溶

液150μL和氨水100μL，涡旋混匀后，封盖于70℃(浴温)反应30min。氮

气吹干，残渣加水1.0mL和二氯甲烷1.0mL充分溶解、震荡，于13000

rpm·min-1离心3min。弃去二氯甲烷相，同法再萃取两次以除尽过量的衍生

化试剂。水相稀释10倍后，进行ESI-MS检测[正离子模式；电喷雾电压:4.80

kV；鞘气(N2)：30.00arb；辅助气(N2):7.00arb；吹扫气(N2):0arb；离子

传输毛细管温度:375℃；管透镜电压:250V；扫描范围：中分子量端200～

2000；流动相：50%甲醇；流速：200μL·min-1；2μL定量环进样]。

2结果与讨论

2.1反应条件优化

分析反应机理可知，以肼类衍生物和β-酮酸酯为原料合成吡唑啉酮类化合物的

反应，是以生成腙为中间体的两步反应组成的，而酸可以催化肼与醛酮生成腙

的反应[12]。但采用强酸可能会使苯肼完全质子化，失去亲核性能，反应活性

降低。因此本研究加入AcOH作为催化剂提高反应产率。此外，固相合成也是

提高有机合成收率的一个途径[10]。Mojtahedi等[3]研究表明，超声波介导也

可以提高苯肼或者肼类与β-酮酸酯合成吡唑啉酮类化合物产率。本文综合文献

方法，探讨了AcOH催化、超声波作用以及溶剂对合成PMP收率的影响，结

果见表1。由表1可见，有AcOH存在的反应体系中PMP的收率是无AcOH

时的2倍以上，说明AcOH对此反应有明显的催化作用。在AcOH催化下，

无超声介导的无溶剂反应体系的收率(78.5%)比甲醇溶剂体系的收率(69.2%)高

出9.3%，比AcOH催化、超声介导的无溶剂体系的收率(74.3%)高出4.2%，

说明无溶剂的固相合成对该反应收率的提高很有效；另外由于该反应生成PMP

的同时释放出乙醇和水，无溶剂体系有利于该反应平衡正向进行。在本实验中，

超声波的作用并没有使收率在原有的基础上提高，反而下降。这可能是因为超

声波的空化作用使得反应体系温度升高，导致副产物增多的缘故。本实验采用

以AcOH催化的无溶剂室温反应合成工艺对1，3-取代的吡唑啉酮类试剂进行

合成。

2.2d5-PMP，DPP和PPMP与Lac的衍生化性能

Lac-d5-PMP，Lac-DPP及LAc-PPMP(于70℃反应40min,其余条件同1.3)

产物的ESI-MS谱图见图1。

由图1可见，在三个谱图中均出现了包括CD，剩余Lac以及Lac与DPP，

PPMP和d5-PMP的两种标记产物(单分子和双分子标记物)在内的4种物质的

峰{[M+Na]+}。为了便于比较，根据Lac与CD分子离子峰的丰度比，初步判

断衍生试剂与Lac标记的活性大小；根据Lac与衍生试剂的单分子标记物和双

分子标记物分子离子峰丰度比大小，判断标记衍生试剂的主要类型。由图1中

丰度比可见，Lac/CD分子离子峰丰度比的顺序为：DPP>PPMP>d5-

PMP(d0-PMP)，表明三种试剂与Lac的标记反应活性为d5-PMP(d0-

PMP)>PPMP>DPP；DPP的反应活性最差。丰度比Lac-PPMP/Lac-

2PPMP>Lac-DPP/Lac-2DPP>Lac-d5-PMP/Lac-2d5-PMP，说明PPMP生

成单分子标记物的倾向最大，d5-PMP生成双分子标记物的倾向最大，而DPP

由于受反应活性和基团空间位阻的影响，两种标记产物的丰度相当。在对衍生

化反应条件的优化实验中也表明，无论如何改善反应条件，均无法使DPP与

Lac的标记反应完全、主产物唯一。而PPMP和d5-PMP均可以在其优化的衍

生条件下和Lac反应完全，并能得到预期标记的主产物。

1，3-取代的吡唑啉酮试剂与还原糖之间的反应表现出的这种反应活性和反应产

物上的差异，可从该类试剂和还原糖反应的机理来分析(Scheme2)。由于1，

3-取代的吡唑啉酮试剂的4-C存在α-氢，在碱性环境下离去成为烯醇式负离子，

和糖类物质的还原端进行醛酮之间的缩合反应，在加热条件下失水成为具有α，

β-不饱和酮结构的单分子标记物。此单分子标记物会继续与另一分子吡唑啉酮

试剂的烯醇式负离子进行Michael1，4加成反应，从而也可能使糖类物质标

记上双分子吡唑啉酮试剂。

单分子标记物

Scheme2

显然，加热升温有利于第一步醛酮之间缩合反应的发生，生成吡唑啉酮试剂对

糖类物质的单分子标记物。而随后发生的第二步反应为单分子标记物与吡唑啉

酮试剂之间的Michael加成反应，是一个放热可逆反应[13]，低温有利于该反

应正向进行，生成吡唑啉酮试剂对糖类物质的双分子标记物。因此，反应温度

是影响PPMP衍生化糖类物质产物结构的一个关键因素，优化反应温度可以使

反应向主产物方向进行。对于DPP与还原糖的反应活性不如PPMP和PMP，

并且产物不均一，可能是因为吡唑啉酮环上3-R的空间位阻对该反应的活性影

响较大所致。

3结论

在AcOH催化的无溶剂条件下，于室温合成了d5-PMP，DPP和PPMP。该

合成工艺操作简单、收率较高，为解决市场上d5-PMP的短缺问题提供了技术

参考。同时丰富了糖类物质的衍生化和同位素标记试剂的种类。

d5-PMP和PPMP与还原糖的反应活性较高，衍生物分别以双分子标记物和单

分子标记物为主；优化衍生条件可用于糖类物质分析。DPP的反应活性最低，

不适用于糖类物质的定量衍生。

参考文献

[1]JungJC,WatkinsEB,sisof3-substitutedand3,4-

disubstitutedpyrazolin-5-ones[J].Tetrahedron,2002,58(18):3639-3646.

[2]赵剑锋,徐利敏,雷玉平,等.1-苯基-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮衍生物的合成[J].化

学与生物工程,2007,24(7):30-31.

[3]MojtahediMM,JavadpourM,ientultrasound

mediatedsynthesisofsubstitutedpyrazolonesundersolvent-free

conditions[J].UltrasonicsSonochemistry,2008,15(5):828-832.

[4]HondaS,AkaoE,OkudaM,-performanceliquid

chromatographyofreducingcarbohydratesasstronglyultraviolet-

absorbingandelectrochemicallynsitive1-phenyl-3-methyl-5-

pyrazolonederivatives[J].AnalBiochem,1989,180(2):351-357.

[5]HondaS,SuzukiS,isofcarbohydratesas1-phenyl-3-

methyl-5-pyrazolonederivativesbycapillary/microchipelectrophoresis

andcapillaryelectrochromatography[J].JournalofPharmaceuticaland

BiomedicalAnalysis,2003,30(6):1689-1714.

[6]王树清,高崇.1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的合成工艺研究[J].染料与染

色,2004,41(2):114-115.

[7]TietzeLF,alandexpedientmethodforthe

solid-phasynthesisofstructurallydiver1-phenyl-pyrazolone

derivatives[J].Synlett,1996,(7):667-668.

[8]KuoSC,HuangLJ,sonheterocyclic

compounds,6,synthesisandanalgesicandantiinflammatoryactivitiesof

3,4-dimethylpyrano-[2,3-c]pyrazol-6-onederivatives[J].JMed

Chem,1984,27(4):539-544.

[9]TietzeLF,EversH,HippeT,-phasynthesisof

substitutedpyrazolonesfrompolymer-boundβ-ketoesters[J].EurJOrg

Chem,2001,(9):1631-1634.

[10]MojtahediMM,JalaliMR,synthesisof

pyrano[2,3-c]pyrazol-6-onederivativesundermicrowaveirradiationin

solvent-freeconditions[J].SynthCommun,2006,36(1):51-57.

[11]沈磊,杨文革,胡永红,等.邻氰基苯肼的合成研究[J].广东化

工,2009,36(10):46-47.

[12]胡洪文.有机化学上册(第二版)[M].北京:高等教育出版社，1990.

[13]邢其毅,裴伟伟,徐瑞秋,等.基础有机化学(第三版)上册[M].北京:高等教育出

版社，2005.

基金项目:国家自然科学基金资助项目(31170773);陕西省科技厅自然科学基金

资助项目(2012JQ2014);陕西省教育厅自然科学基金资助项目(2013JK0670);

咸阳师范学院科研基金资助项目(11XSYK103)