还原糖的测定

还原糖的测定方法还原糖和总糖的测定

还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法

一、目的

掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光

光度计的使用。

二、原理

还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖

类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，

蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多

糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性

的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量(还原糖以葡萄糖含量

计)。

还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还

原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜

色的深浅成正比关

1

系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，

便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键

需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。

三、实验材料、主要仪器和试剂

1(实验材料

小麦面粉;精密pH试纸。

2(主要仪器

(1)具塞玻璃刻度试管:20mL×11

(2)大离心管:50mL×2

(3)烧杯:100mL×1

(4)三角瓶:100mL×1

(5)容量瓶:100mL×3

(6)刻度吸管:1mL×1;2mL×2;10mL×1

(7)恒温水浴锅

(8)沸水浴

(9)离心机

(10)扭力天平

(11)分光光度计

3(试剂

(1)1mg/mL葡萄糖标准液

2

准确称取80?烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水

溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4?冰箱中保存备

用。

(2)3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂

将6.3gDNS和262mL2MNaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热

水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至

1000mL，贮于棕色瓶中备用。

(3)碘-碘化钾溶液:称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL蒸馏水中。

(4)酚酞指示剂:称取0.1g酚酞，溶于250mL70%乙醇中。

(5)6MHCl和6MNaOH各100mL。

四、操作步骤

1(制作葡萄糖标准曲线

取7支20mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标

准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。

表1葡萄糖标准曲线制作

将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至

20mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度

3

计上进行比色。调波长540nm，用0号管调零点，测出1~6号管的光密度值。

以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量(mg)为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。

实验仪器大全实验试剂大全

2(样品中还原糖和总糖的测定

(1)还原糖的提取

准确称取3.00g食用面粉，放入100mL烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，

然后加入50mL蒸馏水，搅匀，置于50?恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。

将浸出液(含沉淀)转移到50mL离心管中，于4000r/min下离心5min，沉淀可用

20mL蒸馏水洗一次，再离心，将二次离心的上清液收集在100mL容量瓶中，用蒸

馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。

(2)总糖的水解和提取

准确称取1.00g食用面粉，放入100mL三角瓶中，加15mL蒸馏水及10mL6M

HCl，置沸水浴中加热水解30min(水解是否完全可用碘-碘化钾溶液检查)。待三角

瓶中的水解液冷却后，加入1滴酚酞指示剂，用6mol/LNaOH中和至微红色，用蒸

馏水定容在100mL容量瓶中，混匀。将定容后的水解液过滤，取滤液10mL，移入

另一100mL容量瓶中定

4

容，混匀，作为总糖待测液。

(3)显色和比色

取4支20mL具塞刻度试管，编号，按表2所示分别加入待测液和显色剂，空

白调零可使用制作标准曲线的0号管。加热、定容和比色等其余操作与制作标准

曲线相同。

五、结果与计算:

计算出7、8号管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均值，在标准曲

线上分别查出相应的还原糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含

量。

六、附注

1(离心时对称位置的离心管必须配平。

2(标准曲线制作与样品测定应同时进行显色，并使用同一空白调零点和比

色。

3(面粉中还原糖含量较少，计算总糖时可将其合并入多糖一起考虑。

七、思考题

1(3,5-二硝基水杨酸比色法是如何对总糖进行测定的?

2(如何正确绘制和使用标准曲线?

参考答案

1(植物中的总糖包括单糖、寡糖和多糖，单糖是还原糖，

5

可直接测定。而没有还原性的寡糖和多糖，需用高浓度的酸在加热的条件下水

解成有还原性的单糖，还原糖在碱性条件下加

热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-

5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成一定比例关

系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，可

求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需要

加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。

2(标准曲线应在坐标纸上绘制，横坐标轴距坐标纸底边1.5~2cm，标示出刻度

和葡萄糖的毫克数;纵坐标轴距坐标纸左边1.5~2cm，标示刻度和光密度值;曲线为

过原点的直线，测定点均匀分布在直线的两侧;标准曲线只能在测试条件完全相同

的情况下，用于确定样品中的物质含量。对于重复的测定，应取吸光度的平均值查

标准曲线;测定数据不应记在标准曲线上。

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