分子筛效应

1.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生定向迁移（与其本身所带电荷相反的电极移动）的

现象。利用电泳现象将多组分物质分离、分析的技术叫做电泳技术。

2。生物大分子在电场中移动的速度由什么决定？

答：样品性质方面：粒子大小，形状，带电荷多少，带电性质；电泳条件方面：介质阻力，

电场强度，溶液黏度。

3。

粒子的移动速度(泳动速度V）与电场强度（E）、粒子所带电荷量（Q)成正比，而与粒子半

径(r）及溶液粘度（η)成反比。非球形分子（如线状DNA）在电泳过程中受到更大的阻力，

即粒子的泳动速度与粒子形状有关。

4.迁移率与下列（D)因素无关?

A。电荷数量B.粒子大小C。溶液黏度D。电场强度

电泳迁移率（/泳动度/淌度）μ：带电颗粒在单位电场强度下的移动速度.

μ=V/E=Q/6πrη

【影响迁移率的因素:

1.待分离大分子的性质：所带的电荷、分子大小和形状，分子带的电荷量越大、直径越小、

形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快；

2.缓冲液pH和离子强度:pH值距pI愈远,Q越大,V越大；pH过高或过低☞蛋白变性☞

缓冲液；缓冲液通常要保持一定的离子强度；离子强度过低或过高的不利影响；

3.电场强度：E高，带电颗粒泳动快.过高，产生焦耳热,样品和Buffer扩散增加，条带增宽；

蛋白变性。过低，电泳时间增加，扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间时,需附有冷

却装置；

4。电渗:在电场中液体对固体支持物的相对移动；当电渗方向与电泳方向一致时，会加

快颗粒泳动速度，反之,当两者方向相反时,会减慢颗粒泳动速度;

5。支持介质：筛孔越小，则颗粒在移动的过程中所受到的阻力也就越大；介质的纯度影响

聚焦效果；介质的非特异性吸附会增大电渗。】

5.等电点的定义？蛋白质在等电点时有哪些特点?

答：当溶液的pH为一定数值时，其中的蛋白质正负电荷相等，即净电荷为零,此时的pH值

就是该蛋白质等电点pI.蛋白质在等电点时的溶解度最小.

6。下列不是区带电泳的是（C)

A.纸电泳B.醋酸纤维素薄膜电泳C.等电聚焦电泳D.聚丙烯酰胺凝胶电泳

7.等电聚焦与等速电泳的差别？

答：区带窄，分辨率高。

自由界面电泳:部分分离

8.电渗现象：外加电场作用下，与固体支持物接触的液体层发生移动的现象.

电渗流：电渗现象中液体的整体流动。是毛细管电泳分离的主要驱动力，是毛细管中的溶剂

因轴向直流电场作用发生的定向流动。其大小直接影响分析结果的精确度，准确度。

9.（凝胶电泳）为什么要用支持介质?支持介质应具备哪些特性？

答：抗对流;抗扩散.物理化学性质稳定；化学惰性—-不干扰大分子的电泳过程；均匀，电内

渗小，结果重复性好。

10.两大类支持介质薄膜类和凝胶类的特点？

答:薄膜类化学惰性好，能将对流减到最小;分离主要原理：生物大分子的电荷密度。凝胶类

高粘度和摩擦阻力☞对流和扩散都小；具有分子筛作用。分离主要原理：电荷密度+分子大

小。

11.在聚丙烯酰胺凝胶方法中,引发剂和加速剂的作用？

答:引发剂:提供原始自由基，通过自由基传递，使Acr成为自由基，启动聚合反应。

加速剂：加快引发剂释放自由基的速度.Bis是交联剂。

12.决定PAG特性的主要因素：单体和交联剂的总浓度;单体和交联剂的比例。

凝胶总浓度一定时,Bis的含量影响凝胶孔径。PAG的分子筛效应取决于凝胶孔径与样品分子

大小接近的程度。选择合适的凝胶浓度,完成不同的分离任务。

a:b〈10凝胶脆、硬，呈乳白状；

a：b〉100凝胶呈糊状；

a：b≈30凝胶富有弹性,且完全透明；

a<2％和b〈0。5％凝胶不可能聚合。

什么是分子筛效应？

分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出

不同的迁移率,这就是分子筛效应。分子量小，阻力小，移动快；分子量大,阻力大，移动慢。

醋酸纤维素薄膜电泳的特点是什么？

分离速度快、电泳时间短、样品用量少。因此特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。

简述聚丙烯酰胺凝胶电泳特点及应用范围。

特点:具有机械强度好、弹性大、透明、化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、样品量小

(1μg～100μg）、分辨率高等.

应用范围：可用于蛋白质、核酸等分子大小不同的物质的分离、定性和定量分析。还可结合

去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS)，以测定蛋白质亚基的相对分子质量。

13。聚丙烯酰胺凝胶电泳有什么优点？

（1)可以在天然状态分离生物大分子；

（2)可分析蛋白质和别的生物大分子的混合物；

（3）电泳分离后仍然保持生物活性。

14。琼脂糖凝胶的特点：

（1)属于大孔胶。可以分析107的大分子，其电泳分辨率低于PAGE的.琼脂糖浓度决定形

成凝胶后的孔径。

（2)物理化学性质稳定,吸附小，分辨率高，重复性好；

（3)机械强度较高；

（4)琼脂糖无毒，热可逆，制备简单;

(5)利于样品回收；

(6）琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快,染色、脱色程序简单快速。

15简述电泳的基本操作。

一，安装膜具；装封胶条,注意封胶条平面朝下，不能有裂口；盖上凹玻璃；将凹玻璃冲外

装进槽里；将楔子插进，将底部插紧。

二，配制凝胶溶液

三,灌胶，加到顶部，来回倾斜去气泡

四，样品制备。

五，加样：通过电极缓冲液，小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部.

六，电泳

七，剥胶:电泳结束后，取下凝胶模，卸下胶框，用凝胶铲小心撬开短玻璃板，从凝胶板上

切下一角作为加样标记。

八，染色与脱色

16.。电泳技术的优点：

快速、准确、重现性好。

（1）电泳性质高度特异性；

（2)电泳方法温和性。

17.常见的不正常电泳现象有：涂抹痕迹;条纹拖尾；条带变浅；前段指示剂缺失；条带仅在

凝胶顶部;混杂因素等。

等电聚焦电泳：

一种利用具有pH梯度的支持介质分离等点电不同的蛋白质的电泳技术。等电聚焦

就是在电泳介质中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到

阴极逐步增加的pH梯度，在此体系中,不同的蛋白质即移动到或聚焦于其相当的等电点位置

上，也就是说被聚焦于一个狭的区带中，电泳技术中的等电点聚焦也称为聚焦电泳。

的特点？

答：优点:1.分辨率高（精密度可达0。01pH单位)，灵敏度高（最低检出量达0.1ng).2.电泳

区带相当狭窄。3.重复性好。

缺点：1.要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀。2。样品中的成分必须停

留在其pI，不适用在pI不溶或发生变性的蛋白质。

20.进行IEFE必须具备3个条件：

①有一个在电泳条件下基本稳定、重复性良好的pH梯度

②有一个抗对流的电泳材料，使已经分离的样品不再重新混合

③电泳后有适当的方法来鉴定分离的区带

在电泳介质中放入载体两性电解质,当通入直流电时，两性电解质形成一个由正极到负极逐

渐增加的pH梯度，正极附近是低pH区，负极附近是高pH区.

21.理想的载体两性电解质应具备的特征:

①分子量要小，以便与被分离大分子物质分离；

②化学性质稳定；

③各成分的pI彼此接近,并在其pI值附近有良好的缓冲能力；

④在pI处具有足够的电导，导电性均匀；

⑤两性电解质载体的数目要足够多；

⑥可溶性好；

⑦对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度，不干扰样品的测定。

简述等电聚焦电泳的限制条件。

答：（1)要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀;

（2)样品中的成分必须停留在其pI，不适用在pI不溶或发生变性的蛋白质。

列举几个等电聚焦电泳的应用.

答：（1）分析分离制备蛋白质、多肽：①区分人血清蛋白;②测出异常免疫球蛋白；③基因

分型

（2）测定pI可鉴定蛋白质、多肽;

(3）双相电泳中，IEFE作为第一相。

理想的载体两性电解质应具备的特征有？

答：（1）分子量要小，以便与被分离大分子物质分离；

（2)化学性质稳定;

（3）各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好的缓冲能力;

(4）在pI处具有足够的电导,导电性均匀；

（5）两性电解质载体的数目要足够多；

(6）可溶性好；

（7）对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度，不干扰样品的测定。

SDS—PAGE

-聚丙烯酰胺凝胶电泳:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）。

它是根据SDS和还原剂将蛋白质分子解聚后亚基的大小，在恒定pH（碱性）缓冲系统的分

离.主要用于测定蛋白质亚基分子量。

电泳的迁移速率主要取决于分子大小，为什么？

SDS是一种阴离子去垢剂，SO32—带负电荷.因此蛋白质在含有强还原剂的SDS溶液中与

SDS分子结合时，可形成SDS—蛋白质复合物。这种复合物由于结合大量带负电荷的SDS，

蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作

用.

的其他作用包括:

阴离子去污剂：作为变性剂和助溶性试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，

破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂：断裂二硫键。

25。样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度十分重要,影响它们结合的因素主要有三个:

⑴溶液中SDS单体的浓度:SDS在水溶液中是以单体和SDS—多肽胶束的混合形式存在的，

能与蛋白质结合的是单体。单体的浓度与SDS总浓度，温度和离子强度有关。为保证蛋白

质与SDS的充分结合，它们的重量比应该为1：4或1：3。

⑵样品缓冲液的离子强度:因为SDS结合到蛋白质分子上的量仅决定于平衡时SDS的单体

浓度，不是总浓度,而只是在低离子强度的溶液中，SDS单体才具有较高的平衡浓度。所以

SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低，常为10～100mmol/L。

⑶二硫键是否完全被还原：只有二硫键被彻底还原后，蛋白质分子才能被解聚,SDS才能定

量的结合到亚基上而给出相对迁移率和分子质量对数的线性关系。样品缓冲液中的β-巯基

乙醇的浓度通常为4％—5％，二硫苏糖醇的浓度通常为2％—3％。前者有挥发性，所以最

好在配置样品前加入。

26.配制凝胶过程中的注意事项：

*凝胶配制过程要迅速,加速剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最

好一次性完成,避免产生气泡。

＊水封的目的：保持分离胶上沿平直，排气泡

*胶凝好的标志：胶与水层之间形成清晰的界面

*梳子需一次平稳插入，梳口处不得有气泡，梳底需水平

＊剥胶时要小心，保持胶完好无损，染色要充分

—聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲系统的选择和凝胶浓度的选择应注意什么？

缓冲系统的选择:在被分析的蛋白质稳定的pH范围，凡不与SDS发生相互作用的缓冲液都

可以使用

凝胶浓度的选择：不同分子质量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度

28.提高SDS—PAGE电泳分辨率的途径？

聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后,可在室温

下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致

SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。

蛋白溶液中SDS过量会引起什么变化？

答:（1）蛋白质本身电荷被屏蔽；

（2）氢键断裂；

（3)疏水作用被取消；

（4)多肽折叠被破坏。

试列举几个影响蛋白质恢复活性的因素。

答：（1)SDS的纯度;

（2）蛋白酶；

（3）二硫键；

（4）蛋白的结构；

(5）辅助因子和辅酶。

为什么带出现拖尾现象？

答：主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。

处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂;电泳缓冲液时间过长，

重新配制；降低凝胶浓度.

阴离子染料的三个缺点是什么?

答：(1)溶液系统中的甲醇会引起NC膜皱缩或破坏;

（2）不能用于带正电荷的膜，如尼龙膜，会使膜本身染色;

（3）灵敏度较低。

净电荷：

29。蛋白质的电泳行为：

蛋白质的净电荷是组成它的氨基酸残基的侧链基团上所有正、负电荷的总和。

等电点是蛋白质的物理化学常数，与其组成有关；

pH=pI，蛋白质的净电荷是零。

30。电泳槽与凝胶中缓冲液的成分、pH值和离子强度均不相同。使得不连续电泳过程中有

三种物理效应：

①样品的浓缩效应；

②凝胶的分子筛效应；

③一般电泳分离的电荷效应。由于这三种物理效应,使样品分离效果好，分辨率高.

31.不连续体系对蛋白的分离作用——样品的浓缩效应

A。凝胶孔径不连续性

B.缓冲体系离子成分的不连续性

值的不连续性

D。电位梯度的不连续性

高效毛细管电泳分析法HPCE：

32。与普通电泳相比,毛细管电泳有什么优点？

答：使用细内径毛细管,抑制了对流和减小热扩散;分析速度快；分离效率很高；可使用在线

检测法；进量少。

33.。毛细管电泳有什么缺点？

答:制备能力差，光学检测器的光路太短，非高灵敏度的检测器难以测出样品峰；

凝胶、色谱填充管需专门的灌制设备；

大的侧面/截面积比能”放大”吸附作用，导致蛋白质等的分离效率下降或不出峰，同时也

会影响分离的重现性。

34。高效毛细管电泳有什么特点？

答：仪器简单,易自动化;分析速度快，分离效率高；操作方便，消耗少；应用范围极广。

中电渗流的流动为平流还是塞流？

答:塞流。

36..HPCE中影响电渗流的因素是什么？

答:1）电场强度的影响;2)毛细管材料的影响；3）电解质溶液性质的影响；4）温度的影响；

5）添加剂的影响

37。改变电渗流方向的方法？

答：(1）毛细管改性表面键合阳离子基团;

(2）加电渗流反转剂,内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电

荷，溶液表面带负电荷.电渗流流向阳极.

38。电內渗的利弊是什么?

答：（1)利：对流电泳中增加阳离子大分子的分辨率.

（2）弊：高电内渗时阻碍大分子的迁移，耗时长。

中电渗流的作用是什么?

答：（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离;

（2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变LC中的流速；

（3）电渗流的微小变化影响结果的重现性.

40。HPCE中影响电渗流的因素有哪些？

答：（1）电场强度的影响，电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流

速度正比于工作电压.

（2）毛细管材料的影响,不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同.

（3）电解质溶液性质的影响：（1）溶液pH的影响；（2)阴离子的影响。

（4）温度的影响毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大.温度变化来自

于“焦耳热”。

（5)添加剂的影响。

41.简述毛细管电泳基本工作原理：溶液中的带电粒子以高压电场为驱动力，沿毛细管通道，

以不同速度向与其所带电荷相反的电极方向迁移，并依据样品中各组分之间淌度和分配行为

上的差异而实现分离.

42.高效毛细管电泳分析在技术上采取了哪两项重要改进？

一是采用了0.05mm内径的毛细管；二是采用了高达数千伏的电压。

蛋白质印迹

43.叙述什么是蛋白质印迹,且简述其优势。

答：(1）定义:把电泳或色谱分离的蛋白质转移到固定基质上,再对其进行进一步分析的方法。

(2)优势：

①一旦转移到固定基质上，Pr比在凝胶中容易接近探针，且几乎所有被转移的Pr都

有相同的机会接触探针;

②转移到固定基质上的Pr带在探测过程中不会因扩散而失去分辨率;

③Pr转移到膜上后能进行多种分析，能得到多份结果;

④印迹法只需很少试剂(ng级），处理时间相对短，固定化膜容易操作和保存。

⑤蛋白质印迹法是高分辨电泳和灵敏、专一的免疫探测技术的结合！

⑥蛋白质印迹法中分析蛋白质时使用的探针：

⑦用针对蛋白质特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针;

⑧通常使用抗体做探针；

⑨抗体与附着于固定基质上的靶蛋白发生特异性反应-—免疫印迹；

⑩免疫印迹实现了高灵敏和特异性的结合。

44。什么是电泳印记？

答：生物大分子物质（如核酸或蛋白质）印迹到固相载体上经封阻试剂处理后，可与相应的

探针反应接着用适当的溶液漂洗，置含底物的溶液中培育，即可显出谱带.如所用探针是放

射性同位素标记物时,则应将漂洗后的载体进行放射自显影，即可检测出样品中特异的成分。

45.蛋白质印迹的应用有哪些？

分析和制备特异成分;检测生命大分子物质之间的相互作用;可作为诊断某些疾病的工具

46。蛋白质印迹蛋白质转移条件的选择：

离子强度:导电性；低离子强度。

pH：合适的pH值使Pr远离其pI而带负电荷。

稳定性:好，耐受高电场强度，易于转移。

蛋白质双向电泳

47。影响IPG胶条对蛋白载样量的因素包括哪些方面？

1、待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析；

2、电泳的目的；

3、待研究蛋白的丰度;

4、样品的复杂度：复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实

验才能完成，如果将待测样品被富集以后则更易分析；

5、IPG胶条的PH范围。

48.蛋白质双向电泳中核酸对电泳有何影响，为了消除影响如何去除呢？

对电泳的影响：增加样品粘度、与蛋白质形成复合物后会出现假象迁移和条纹。

解决方法:用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切酶进行降解,或是利用合成载体两性电解质

（SCA）同核酸结合形成复合物的能力，再通过超速离心来去除复合物。

试

49.双向电泳分析中的样品制备其制备原则是什么？

答:1、应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白)，且制备方法

应具有可重现性.

2、防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀.

3、防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。

4、完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。

5、尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白,从而保证待研究蛋白的可检测性.