脱氧核糖核苷酸

(19)国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号

(43)申请公布日

(21)申请号2.X

(22)申请日2022.04.27

(71)申请人江苏华熙益能生物科技有限公司

地址214028江苏省无锡市新吴区菱湖大

道99-2号303

申请人北京华熙荣熙生物技术研究有限公

司

华熙生物科技股份有限公司

(72)发明人张伟平 张晨 高萌 张天萌

王瑞妍

(74)专利代理机构北京唐颂永信知识产权代理

有限公司11755

专利代理师刘伟

(51).

C12N15/10(2006.01)

C12N15/11(2006.01)

(54)发明名称

多聚脱氧核糖核苷酸及其制备方法

(57)摘要

本申请提供一种多聚脱氧核糖核苷酸的制

备方法，所述制备方法包括以下步骤：获取鲑鱼

基因组DNA，采用多重置换扩增鲑鱼基因组DNA制

备得到经扩增的鲑鱼DNA片段，将所述鲑鱼DNA片

段打断，得到多聚脱氧核糖核苷酸。本申请还提

供一种多聚脱氧核糖核苷酸，所述多聚脱氧核糖

核苷酸中长度小于等于400bp的片段占比大于

90％，大于等于1000bp的片段占比小于2％。本申

请提供的方法通过合成生物学技术，仅需引入少

量外源蛋白(Phi DNA聚合酶)，即可大量合成鲑

鱼精DNA。此外，本申请合成的鲑鱼精DNA不是全

长的基因组DNA(genome DNA,gDNA)而是片段大

小处在12kb～100kb的长片段DNA；通过复合物理

破碎方法和生物处理手段，可在短时间内获取大

量分子量大小理想的PDRN样品。

权利要求书1页说明书8页附图2页

CN115109775A

2022.09.27

C

N

1

1

5

1

0

9

7

7

5

A

1.一种多聚脱氧核糖核苷酸的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

获取鲑鱼基因组DNA，

采用多重置换扩增鲑鱼基因组DNA制备得到经扩增的鲑鱼DNA片段，

将所述鲑鱼DNA片段打断，得到多聚脱氧核糖核苷酸。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述采用多重置换扩增鲑鱼基因组

DNA制备得到经扩增的鲑鱼DNA片段包括以下步骤：

对获得的鲑鱼基因组DNA进行处理以获得单链的鲑鱼基因组DNA模板，

中和处理所述模板，

将随机引物在包含经中和处理的模板、Phi29 DNA聚合酶、dNTP的PCR体系中进行多重

置换扩增，

对Phi29 DNA聚合酶进行灭活，得到所述经扩增的鲑鱼DNA片段。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述随机引物在PCR体系中的浓度为

0.2‑1.0μM。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，多重置换扩增的时间为2‑4h。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述打断包括超声处理和/或酶切处

理，优选地，所述打断包括首先进行超声处理，然后进行酶切处理。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述超声处理的超声功率为200‑

400W、占空比为1:0.5‑2，超声处理时间为10‑60min。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述酶切处理使用浓度为50‑100U/ml

的限制性内切酶Sau 3AI在37‑40℃恒温处理1‑2h。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括将所述鲑鱼DNA

片段打断之后去除蛋白、沉淀得到鲑鱼DNA片段的步骤。

9.一种多聚脱氧核糖核苷酸，其特征在于，所述多聚脱氧核糖核苷酸中长度小于等于

400bp的片段占比大于80％，优选大于90％，

进一步优选长度小于等于200bp的片段占比大于40％，优选大于50％，

进一步优选长度小于等于600bp的片段占比大于90％，优选大于95％，

进一步优选长度大于等于1000bp的片段占比小于10％，优选小于2％。

10.根据权利要求9所述的多聚脱氧核糖核苷酸，其特征在于，所述多聚脱氧核糖核苷

酸通过权利要求1‑8中任一项所述的制备方法制得。

权 利 要 求 书

1/1页

2

CN115109775A

多聚脱氧核糖核苷酸及其制备方法

技术领域

[0001]本申请属于生物工程领域，具体地，涉及一种多聚脱氧核糖核苷酸及其制备方法。

背景技术

[0002]多聚脱氧核糖核苷酸(Polydeoxyribonucleotide,PDRN)是源自鲑鱼、鳟鱼或大马

哈鱼等精巢或精液中的一类天然生物活性物质，其本质是一种分子量大小处在50～1,

500KDa的脱氧核糖核苷酸结合体。由于鲑鱼基因组在碱基结构和构成比例上与人类基因组

的高度相似性(≥95％)，因此经过严格处理纯化后的PDRN不存在免疫原性且具有高度的安

全性和稳定性。体外和体内实验表明，细胞表面的腺苷A2A受体通过识别腺苷受体激动剂

PDRN，可以起到调节炎症、降低细胞耗氧量、改善组织局部缺血、促进细胞生长和血管生成

的作用。此外，PDRN通过参与“补救合成途径”可以为细胞生长提供核苷和核苷酸，延长细胞

寿命，改善细胞状态。总之，PDRN作为一种新的功能性原料具有组织修复、促进伤口愈合以

及延缓衰老等作用，目前已经被广泛应用于医药、化妆品、食品和保健品等领域。

[0003]富含DNA的鱼类精巢和精液是提取PDRN的理想原料。然而，受到石油泄漏、核废水

排放以及船舶污染等带来的重金属超标、基因突变和染色体畸变等意料之外的风险，通过

鲑鱼精巢或精液直接提取PDRN不再作为最佳选择。此外，深海鲑鱼种群作为一种生态系统

的重要组成部分，现代渔业捕捞很容易导致海洋生态系统退化、种群灭绝等风险。21世纪是

生物技术大爆发的时代，其中合成生物学通过工程化的策略，可以有目的地设计合成标准

化的生物元件，构建特定的基因回路，组装具有特定功能的人工生命系统，从而定向地人工

合成多种原料、药物和生物能源等等。多PDRN的生产过程主要分为DNA提取和DNA打断两大

工艺步骤，其中现有的工业DNA提取方法包括醇沉法、盐析法和柱层析法等，DNA打断方法有

物理破碎法(超声破碎)和生物破碎法(酶切处理)等。例如专利CN107287186A公开的一种从

鱼类的精液分离多脱氧核糖核苷酸的方法通过盐析法纯化鲑鱼DNA并通过物理破碎法获取

PDRN；专利CN106031709B(辉文授权)公开的一种鱼精DNA‑NA、鱼精蛋白提取物及其制备方

法使用柱层析法获取高浓度的鱼精DNA‑NA提取物；专利CN112315836A公开的一种高效的外

用PDRN的制备方法通过醇沉法获取高纯度DNA再经由限制性内切酶处理获取高质量PDRN。

由于是从动物细胞中直接提取DNA，工业DNA提取工艺很容易造成大量蛋白残留。PDRN生产

过程中单一的打断处理不仅具备功耗大、成本高和反应时间长的缺点，而且并不总能获取

理想的分子量大小。例如专利CN107287186A未测量样品中蛋白残留量且缺乏关键性证据表

征分子量大小及分布区间；专利CN106031709B获得的DNA样品中蛋白残留量为2.5～5％且

并未提及分子量大小及分布区间；专利CN112315836A虽然蛋白残留量低于1％且PDRN分布

范围较为理想，但是在DNA打断过程使用单一酶切处理(37℃恒温孵育16h)不仅成本高昂而

且反应时间较长。

发明内容

[0004]针对现有技术存在的问题，本申请提供一种多聚脱氧核糖核苷酸及其制备方法。

说 明 书

1/8页

3

CN115109775A

[0005]具体来说，本申请涉及如下方面：

[0006]1.一种多聚脱氧核糖核苷酸的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步

骤：

[0007]获取鲑鱼基因组DNA，

[0008]采用多重置换扩增鲑鱼基因组DNA制备得到经扩增的鲑鱼DNA片段，将所述鲑鱼

DNA片段打断，得到多聚脱氧核糖核苷酸。

[0009]2.根据项1所述的制备方法，其特征在于，所述采用多重置换扩增鲑鱼基因组DNA

制备得到经扩增的鲑鱼DNA片段包括以下步骤：

[0010]对获得的鲑鱼基因组DNA进行处理以获得单链的鲑鱼基因组DNA模板，

[0011]中和处理所述模板，

[0012]将随机引物在包含经中和处理的模板、Phi29 DNA聚合酶、dNTP的PCR体系中进行

多重置换扩增，

[0013]对Phi29 DNA聚合酶进行灭活，得到所述经扩增的鲑鱼DNA片段。

[0014]3.根据项2所述的制备方法，其特征在于，所述随机引物在PCR体系中的浓度为

0.2‑1.0μM。

[0015]4.根据项2所述的制备方法，其特征在于，多重置换扩增的时间为2‑4h。

[0016]5.根据项1所述的制备方法，其特征在于，所述打断包括超声处理和/或酶切处理，

优选地，所述打断包括首先进行超声处理，然后进行酶切处理。

[0017]6.根据项5所述的制备方法，其特征在于，所述超声处理的超声功率为200‑400W、

占空比为1:0.5‑2，超声处理时间为10‑60min。

[0018]7.根据项5所述的制备方法，其特征在于，所述酶切处理使用浓度为50‑100U/ml的

限制性内切酶Sau 3AI在37‑40℃恒温处理1‑2h。

[0019]8.根据项1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括将所述鲑鱼DNA片

段打断之后去除蛋白、沉淀得到鲑鱼DNA片段的步骤。

[0020]9.一种多聚脱氧核糖核苷酸，其特征在于，所述多聚脱氧核糖核苷酸中长度小于

等于400bp的片段占比大于80％，优选大于90％，

[0021]进一步优选长度小于等于200bp的片段占比大于40％，优选大于50％，

[0022]进一步优选长度小于等于600bp的片段占比大于90％，优选大于95％，

[0023]进一步优选长度大于等于1000bp的片段占比小于10％，优选小于2％。

[0024]10.根据项9所述的多聚脱氧核糖核苷酸，其特征在于，所述多聚脱氧核糖核苷酸

通过项1‑8中任一项所述的制备方法制得。

[0025]针对工业DNA提取过程中蛋白残留和单一打断处理的缺点，本申请提供了一种恒

温扩增生物合成多聚脱氧核糖核苷酸的方法。通过合成生物学技术，仅需引入少量外源蛋

白(Phi DNA聚合酶)，即可大量合成鲑鱼精DNA。此外，本申请合成的鲑鱼精DNA不是全长的

基因组DNA(genome DNA,gDNA)而是片段大小处在12kb～100kb的长片段DNA；通过复合物理

破碎方法和生物处理手段，可在短时间内获取大量分子量大小理想的PDRN样品。

附图说明

[0026]图1为不同反应条件的PDRN的凝胶电泳图，其中A显示不同引物浓度(0.2～1.0μM)

说 明 书

2/8页

4

CN115109775A

的凝胶电泳图，B显示不同反应时间(2～4h)的凝胶电泳图；

[0027]图2为不同超声条件的PDRN的凝胶电泳图，其中A显示不同超声时间(10～60min)

的凝胶电泳图，B显示不同超声功率(200～400W)的凝胶电泳图，C显示不同占空比(1～2:1

～2)的凝胶电泳图；

[0028]图3为核酸/蛋白分析仪测定的实施例制备的PDRN的片段分布结果；

[0029]图4为核酸/蛋白分析仪测定的对比例制备的PDRN的片段分布结果；

[0030]图5为凝胶电泳测定的实施例和对比例制备的PDRN的片段分布结果。

具体实施方式

[0031]下面结合实施例进一步说明本申请，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释

本申请，并非用于限制本申请。

[0032]除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通

常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材

料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定

义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本申请作

进一步的说明，但不用来限制本申请的范围。

[0033]本申请提供一种多聚脱氧核糖核苷酸的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

[0034]步骤一：获取鲑鱼基因组DNA。

[0035]步骤二：采用多重置换扩增鲑鱼基因组DNA制备得到经扩增的鲑鱼DNA片段，

[0036]步骤三：将所述鲑鱼DNA片段打断，得到多聚脱氧核糖核苷酸。

[0037]在步骤一中，鲑鱼基因组DNA可以通过现有的技术从鲑鱼中提取获得。例如可以通

过传统的酚氯仿抽提法，或者试剂盒获取纯净的鲑鱼基因组DNA(genomic DNA,gDNA)。传统

的酚氯仿抽提方案使用酚/氯仿分离有机相和水相，从而实现核酸的提取。虽然酚氯仿抽提

可获得产量可观的gDNA，但是由于涉及有毒有害试剂的使用，因此其不适宜工业化大规模

生产。而市售的试剂盒虽然可获得较为纯净的gDNA，但是gDNA的得率较小且成本昂贵也较

难实现工业化。因此，本申请采用试剂盒提取的少量gDNA(鲑鱼gDNA)作为模板，通过多重置

换扩增技术可获得大量鲑鱼gDNA，且反应过程中不涉及任何有毒有害试剂的使用。

[0038]在步骤二中，所使用的重置换扩增技术(Multiple displacement

amplification,MDA)是目前最常用的全基因组扩增方法，该方法在30℃恒温条件下，通过

随机引物与模板DNA的随机退火结合，在高保真、强链置换活性Phi29 DNA聚合酶的作用下，

可在短时间内合成大量12kb～100kb的扩增片段。

[0039]进一步地，采用多重置换扩增制备得到经扩增的鲑鱼DNA片段可以包括以下步骤：

对获得的鲑鱼基因组DNA进行处理以获得单链的鲑鱼基因组DNA模板；中和处理所述模板；

将随机引物在包含经中和处理的模板、Phi29 DNA聚合酶、dNTP的PCR体系中进行多重置换

扩增；对Phi29 DNA聚合酶进行灭活，得到所述经扩增的鲑鱼DNA片段。

[0040]其中，将DNA由双链处理为单链可以通过本领域任何已知的变性方法进行。

[0041]phi29 DNA聚合酶是从嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillus subtilis噬菌体phi29中克隆

出的嗜温DNA聚合酶，在大肠杆菌中进行表达后经多次纯化分离而得。

[0042]phi29 DNA聚合酶具有特殊的链置换和连续合成特性，可连续合成长达70kb的DNA

说 明 书

3/8页

5

CN115109775A

片段。另外，该酶具有3’→5’外切酶校读功能，合成的DNA片段保真性高。该酶的外切酶活性

较强，因此合成过程中对引物3’端进行修饰，以降低外切活性对引物的切割效应尤为必要。

[0043]在多重置换扩增过程中随机引物的浓度和扩增的时间均可以调整。

[0044]在一个具体的实施方式中，所述随机引物在PCR体系中的浓度为0.2‑1.0μM，例如

可以为0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1.0μM。

[0045]在一个具体的实施方式中，多重置换扩增的时间为2‑4h，例如可以为2h、2.5h、3h、

3.5h、4h。

[0046]在步骤三中，将所述鲑鱼DNA片段可以通过现有技术已知的方法进行，例如可以通

过超声处理、酶切处理、或超声处理和酶切处理组合使用。

[0047]在一个具体的实施方式中，所述打断包括首先进行超声处理，然后进行酶切处理。

[0048]其中，超声处理可以通过常规的超声设备实现。具体地，可以通过调节超声功率、

占空比，处理时间来控制DNA片段打断的效果。在一个具体的实施方式中，所述超声处理的

超声功率为200‑400W，例如可以为200W、250W、300W、350W、400W；占空比为1:0.5‑2，例如可

以为1:0.5、1:0.8、1:1、1:1.2、1:1.5、1:1.8、1:2；超声处理时间为10‑60min，例如可以为

10min、20min、30min、40min、50min、60min。

[0049]在一个具体的实施方式中，所述酶切处理使用度为50‑100U/ml的限制性内切酶

Sau 3AI在37‑40℃恒温处理1‑2h。

[0050]进一步地，所述制备方法还包括将所述鲑鱼DNA片段打断之后去除蛋白、沉淀得到

鲑鱼DNA片段的步骤。去除蛋白的方法不作限制，可以为本领域任何已知的方法，在一个具

体的实施方式中，通过蛋白酶去除蛋白。鲑鱼DNA片段的沉淀可以通过异丙醇沉淀、清洗和

冻干所获得的沉淀得到。

[0051]本申请还提供一种PDRN，其中所述多聚脱氧核糖核苷酸中长度小于等于400bp的

片段占比大于80％，优选大于90％。

[0052]进一步本申请还提供一种PDRN，其中所述多聚脱氧核糖核苷酸中长度小于等于

400bp的片段占比大于80％，优选大于90％，且长度小于等于200bp的片段占比大于40％，优

选大于50％。

[0053]进一步本申请还提供一种PDRN，其中所述多聚脱氧核糖核苷酸中长度小于等于

400bp的片段占比大于80％，优选大于90％，且长度小于等于200bp的片段占比大于40％，优

选大于50％，且长度小于等于600bp的片段占比大于90％，优选大于95％。

[0054]进一步本申请还提供一种PDRN，其中所述多聚脱氧核糖核苷酸中长度小于等于

400bp的片段占比大于80％，优选大于90％，且长度小于等于200bp的片段占比大于40％，优

选大于50％，且长度小于等于600bp的片段占比大于90％，优选大于95％，且长度大于等于

1000bp的片段占比小于10％，优选小于2％。

[0055]根据韩国PDRN原料公司巨头BR PHARM公司的推荐，适用于医疗器械级PDRN片段长

度为700kDa，药品级PDRN片段长度为350～500kDa，化妆品、食品级PDRN片段长度为40～

60kDa。因此，本申请制备的PDRN可适用于药品，或者食品，具有较广泛的应用范围。

[0056]进一步地，所述PDRN可以通过上述制备方法制得。

[0057]本申请的制备方法不仅解决了现有技术可持续发展差、生态不友好的缺点，而且

在生产过程中仅需使用微量的鲑鱼DNA即可大量生产PDRN，而且引入的外源蛋白大幅降低。

说 明 书

4/8页

6

CN115109775A

现有生产过程中通常从成年雄性鲑鱼精巢中提取PDRN，正常成年雄性大西洋鲑体重平均约

为4.5公斤精巢重量约为300g。鲑鱼精巢细胞中核酸含量约为7％，因此一条雄性的大西洋

鲑可提供不到15g PDRN原料(结果包含加工过程中核酸损失)。而本申请中仅通过50ng模板

即可实现125μg PDRN原料的获取。因此，在同等条件下，本申请可通过一条雄性的大西洋鲑

提供的模板生产约37500g PDRN原料，是传统方法的2500倍，因此本申请方法中蛋白残留量

仅为传统方法的1/2500。而且本申请的方法可以仅使用来源纯净的gDNA，保证了PDRN的安

全。

[0058]实施例

[0059]实施例1

[0060]多重置换扩增技术(Multiple displacement amplification,MDA)方法优化，按

照如下步骤：

[0061]步骤1试剂准备，提前解冻所需试剂：

[0062]室温下解冻Phi29 DNA聚合酶反应缓冲液，所述的Phi29DNA聚合酶反应缓冲液包

含40mMTris‑HCL(pH7.5)，50mMKCL，10mMMgCl

2

，5mM(NH

4

)

2

SO

4

；

[0063]步骤2鲑鱼DNA模板变性处理，双链DNA模板处理为单链DNA：

[0064]在微量离心管中加入2.5μL鲑鱼精gDNA(D8030，Solarbio)，gDNA浓度为～50ng/μ

L；变性处理：在DNA样品中加入2μL变性缓冲液，用移液枪吹打混匀，室温孵育2.5‑3min(变

性缓冲液：0.5M EDTA(pH 8)1μL；5m KOH4μL；无核酸酶水35μL)；

[0065]步骤3DNA模板中和处理，调节溶液PH准备扩增：

[0066]将2μL中和溶液(中和溶液：400mM HCL和600mMTris‑HCL(pH 7.5))加入步骤2所述

的变性DNA模板中，用移液器吹打混匀；

[0067]步骤4多重置换扩增，鲑鱼DNA样品的制备：

[0068]按照以下的配比准备混合体系(如表1所示)：Phi29 DNA聚合酶反应缓冲液4μL，

10mM dNTPs 4μL，分别加入终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8和1.0μM的随机引物2μL，10mg/mL

BSA0.8μL，Phi29 DNA聚合酶0.5μL，水31.2μL，总体积42.5μL；取2.5μL步骤3所述的变性DNA

模板，加入42.5μL的混和体系，30℃的PCR仪或其他恒温设备中孵育2或4h。

[0069]表1

[0070]

[0071]步骤5DNA聚合酶灭活，终止反应：

[0072]孵育结束时，将DNA样品加热至65℃10min，然后将样品降至4℃保存备用；

[0073]步骤6琼脂糖凝胶电泳验证

说 明 书

5/8页

7

CN115109775A

[0074]称取1g琼脂糖粉末于250mL锥形瓶中，加入99mL1×TAE缓冲液制备1％琼脂糖凝

胶。使用1％琼脂糖凝胶检测扩增质量，电压120V，约30min取出，在凝胶成像仪上用紫外灯

成像观察结果。

[0075]结果如图1所示，当MDA引物浓度为0.6μM、反应时间为4h时，琼脂糖凝胶电泳图上

显示清晰明亮的条带。

[0076]实施例2

[0077]超声打断gDNA的方法优化，按照如下步骤：

[0078]步骤1试剂准备，提前解冻所需试剂：

[0079]室温下解冻Phi29 DNA聚合酶反应缓冲液，所述的Phi29DNA聚合酶反应缓冲液包

含40mMTris‑HCL(pH7.5)，50mMKCL，10mMMgCl

2

，5mM(NH

4

)

2

SO

4

；

[0080]步骤2鲑鱼DNA模板变性处理，双链DNA模板处理为单链DNA：

[0081]在微量离心管中加入2.5μL鲑鱼精gDNA，gDNA浓度为～50ng/μL；变性处理：在DNA

样品中加入2μL变性缓冲液，用移液枪吹打混匀，室温孵育2.5‑3min(变性缓冲液：0.5M

EDTA(pH 8)1μL；5m KOH 4μL；无核酸酶水35μL)；

[0082]步骤3DNA模板中和处理，调节溶液PH准备扩增：

[0083]将2μL中和溶液加入步骤2所述的变性DNA模板中，用移液器吹打混匀(中和溶液：

400mM HCL和600mMTris‑HCL(pH 7.5))；

[0084]步骤4多重置换扩增，鲑鱼DNA样品的制备：

[0085]按照下面的配比准备混合体系(如表2所示)：Phi29 DNA聚合酶反应缓冲液4μL，

10mM dNTPs 4μL，随机引物2μL(终浓度0.6μM)，10mg/mL BSA 0.8μL，Phi29 DNA聚合酶0.5μ

L，水31.2μL，总体积42.5μL；取2.5μL步骤3所述的变性DNA模板，加入42.5μL的混和体系，30

℃的PCR仪或其他恒温设备中孵育4h；

[0086]表2

[0087]

[0088]步骤5DNA聚合酶灭活，终止反应：

[0089]孵育结束时，将DNA样品加热至65℃10min，然后将样品降至4℃保存备用；

[0090]步骤6超声处理鲑鱼DNA：

[0091]超声处理：将步骤5制备的DNA样品进行超声破碎处理，对超声功率、占空比以及超

声处理时间进行优化，其中超声处理时间为10min、20min、30min、40min、50min，超声功率为

200W、250W、300W、350W、400W，占空比为2:1、2:2、1:1、1:2。

[0092]步骤7琼脂糖凝胶电泳验证

说 明 书

6/8页

8

CN115109775A

[0093]称取1g琼脂糖粉末于250mL锥形瓶中，加入99mL1×TAE缓冲液制备1％琼脂糖凝

胶。使用1％琼脂糖凝胶检测扩增质量，电压120V，约30min取出，在凝胶成像仪上用紫外灯

成像观察结果。

[0094]本实施例以MDA的扩增产物为样本，分别对超声时间、功率以及占空比进行优化。

结果如图2所示，当超声时间为30min、超声功率为250W、占空比为2:1时，琼脂糖凝胶电泳图

上显示相对较佳的打断效果。

[0095]实施例3

[0096]一种恒温扩增生物合成多聚脱氧核糖核苷酸的方法，按照如下步骤进行：

[0097]步骤1试剂准备，提前解冻所需试剂：

[0098]室温下解冻Phi29 DNA聚合酶反应缓冲液，所述的Phi29DNA聚合酶反应缓冲液包

含40mMTris‑HCL(pH7.5)，50mMKCL，10mMMgCl

2

，5mM(NH

4

)

2

SO

4

；

[0099]步骤2鲑鱼DNA模板变性处理，双链DNA模板处理为单链DNA：

[0100]在微量离心管中加入2.5μL鲑鱼精gDNA，gDNA浓度为～50ng/μL；变性处理：在DNA

样品中加入2μL变性缓冲液，用移液枪吹打混匀，室温孵育2.5‑3min(变性缓冲液：0.5M

EDTA(pH 8)1μL；5m KOH 4μL；无核酸酶水35μL)；

[0101]步骤3DNA模板中和处理，调节溶液PH准备扩增：

[0102]将2μL中和溶液加入步骤2所述的变性DNA模板中，用移液器吹打混匀(中和溶液：

400mM HCL和600mMTris‑HCL(pH 7.5))；

[0103]步骤4多重置换扩增，鲑鱼DNA样品的制备：

[0104]按照下面的配比准备混合体系(如表2所示)：Phi29 DNA聚合酶反应缓冲液4μL，

10mM dNTPs 4μL，随机引物(0.6μM)2μL，10mg/mL BSA 0.8μL，Phi29 DNA聚合酶0.5μL，水

31.2μL，总体积42.5μL；取2.5μL步骤3所述的变性DNA模板，加入42.5μL的混和体系，30℃的

PCR仪或其他恒温设备中孵育4h；

[0105]步骤5DNA聚合酶灭活，终止反应：

[0106]孵育结束时，将DNA样品加热至65℃10min，然后将样品降至4℃保存备用；

[0107]步骤6超声/酶切复合处理鲑鱼DNA，获取PDRN样品：

[0108](1)超声处理：将步骤5制备的DNA样品进行超声破碎处理，所述超声功率为250W、

占空比为2:1，超声处理30min；

[0109](2)酶切处理：向上述制备的DNA溶液中，加入50～100U限制性内切酶Sau 3AI 37

℃恒温处理2h；

[0110](3)除蛋白操作：向上述制备的DNA溶液加入终浓度为90～100mMNaCL，0.9～1％

SDS，0.04～0.05mg/mL蛋白酶K，50℃恒温处理3h，离心除沉淀，收集上清液；

[0111](4)在上述获得的上清液中加入等体积的异丙醇沉淀30min(室温)，离心弃上清；

沉淀用70％或75％乙醇漂洗两遍，将获得的沉淀进行冻干获得白色固体，即为PDRN样品。

[0112]对比例

[0113]对比例1采用背景技术中CN107287186A描述的方法，其采用提取法从鲑鱼精巢中

提取PDRN，其提取过程中涉及‑80℃处理，加工方法繁杂不适宜大规模工业化生产。

[0114]对比例2采用背景技术中CN112315836A描述的方法，其同样采用提取法从鲑鱼精

巢中提取PDRN原料，提取得率～15％。

说 明 书

7/8页

9

CN115109775A

[0115]经计算，实施例3制备的PDRN样品以0.05μg鲑鱼DNA为模板，可合成125μgPDRN样

品。

[0116]使用Qp全自动核酸/蛋白分析仪分析实施例3和对比例2制备的PDRN样品的片段

分布，其中实施例3的结果如图3所示，对比例2的结果如图4所示。使用琼脂糖凝胶电泳测定

测定实施例3和对比例2制备的PDRN样品的片段分布，结果如图5所示，其中，1‑4(四个平行)

为实施例3的步骤6中经乙醇漂洗后获得的PDRN样品，4‑8(四个平行)为实施例3的步骤6中

冻干后复溶的PDRN样品，7‑8为对比例2制备得到的PDRN样品(两个平行)，M为分子量标准。

由图3和图4的结果可以看出，本申请制备的PDRN样品的碱基长度为24～400bp的片段占比

超过90％，超过1000bp的片段仅占约1％。而对比例2制备得到的PDRN样品400bp以下的片段

仅占34.3％，超过1000bp的片段占49.8％。

[0117]进一步对实施例3、对比例1和对比例2制备得到的PDRN样品的性状、溶解性、蛋白

含量进行检测，结果如表3所示。其中，蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定。实施例与对比例的

检测比对如表3所示。

[0118]表3

[0119]

[0120]

说 明 书

8/8页

CN115109775A

10

图1

图2

图3

说 明 书 附 图

1/2页

CN115109775A

11

图4

图5

说 明 书 附 图

2/2页

CN115109775A

12