targetscan

如何寻找miRNA靶基因？

microRNA（miRNA）是一类能够调节基因表达的短单链內源非编

码RNA（约22nt），通过与互补的mRNA选择性地结合抑制蛋白的产

生，广泛存在于动物、植物、病毒等多种有机体中。

miRNA通常位于基因间或者内含子区域，在细胞核内有RNA聚

合酶Ⅱ转录产生具有帽子结构多聚腺苷酸尾巴的pri-miRNA。在核酸

酶Drosha及其辅助因子Pasha的作用下，pri-miRNA被处理成70个

核苷酸组成具有茎环结构的pre-miRNA，然后由Exportin5等转运至

细胞质。Dicer将pre-miRNA切割成约22nt的双链miRNA，双链miRNA

讲解形成单链的成熟miRNA。成熟miRNA还需要与Argonaute蛋白等

组装形成RNA诱导沉默复合体（RISC），RISC作用于特异mRNA的3’UTR，

从而抑制翻译过程或者直接讲解mRNA。整个过程如图所示。

尽管对miRNA功能的认识还不是非常清楚，但miRNA在许多生

物过程中起关键作用，包括发育、细胞分化、增殖、凋亡、肿瘤转移

等。准确快速地预测miRNA靶基因对于研究miRNA功能以及分析

miRNA参与的生物学过程具有十分重要的意义。目前寻找miRNA靶

基因的方法主要有生物信息学以及生物实验方法。

1、生物信息学方法

生物信息学方法主要是利用某种算法对靶基因样本进行评分及

筛选。生物信息学的方法只是通过算法为研究人员提供可能性最大的

参考信息，还需要通过实验进行验证。

使用计算机预测植物miRNA靶基因比较简单，因为在植物中

miRNA与靶基因几乎还是以完全互补配对的方式结合，预测不需要复

杂的算法。而预测动物miRNA靶基因则存在一定的困难，主要是目

前已知的miRNA靶基因及其确切靶点不多，在算法编写时没有足够

的已知样本可供参考。但是，miRNA与靶基因间的相互作用仍然具有

一定的规律性。目前常规的算法主要遵循以下几个常用原则：（a）

miRNA与靶基因的互补性；（b）miRNA靶位点在不同物种之间的保守

性；（c）miRNA-mRNA双链之间的热稳定性；（d）miRNA靶位点不会

有复杂的二级结构；（e）miRNA5’端于靶基因的结合能力强于3’端。

除了这些基本原则以外，不同的预测方法还会根据各自总结的规律对

算法进行限制和优化。

（1）miRanda

miRanda是最早利用生物信息学对miRNA靶基因进行预测的软

件，由Enright等人[1]于2003年开发设计。其对3’UTR的筛选依据主

要是从序列匹配、miRNA与mRNA双链的热稳定性以及靶位点的保守

性三个方面进行分析。综合这3条原则，miRanda选取每条miRNA

相对的3’UTR中排名前十位的基因，作为miRNA的候选靶基因，对

于多个miRNA对应于同一靶位点的情况，miRanda使用贪心算法

（GreedyAlgorithm）选取其中得分最高且自由能最低的那一对。[2]

（2）TargetScan和TargetScanS

TargetScan是Lewis等人[3]在2003年开发的一款用于预测哺乳动

物miRNA靶基因的软件，该软件将RNA间相互作用的热力学模型与

序列比对分析相结合，预测不同物种间保守的miRNA结合位点。

TargetScan还引入了信号噪声比来评估预测结果的准确度，所谓信号

噪声比即用已知（信号组）和随机生成的miRNA（噪声组）分别对

mRNA的3’UTR进行预测，所得靶基因数目的比值。随着物种数目的

增多，预测得到的靶基因减少，但准确性得到了相应的提高。

后来，Lewis等人[4]又对TargetScan进行了优化，即TargetScanS。

TargetScanS在人、小鼠、大鼠的基础上增加了狗（Canisfamiliaris）

和鸡（Gallusgallus）的基因组数据，同时在算法上做了改动。

（3）RNAhybrid

RNAhybrid是Rehmsmeier等人[5]在2004年开发的一种基于分析

miRNA和靶基因间形成双链的二级结构，从而预测miRNA靶基因的

软件。RNAhybrid在实质上是一种经典RNA二级结构预测软件的扩展，

能够快速、准确地计算一条短链RNA和一条长链RNA杂交（如miRNA

和mRNA3’UTR）时的自由能，并基于此来预测果蝇中miRNA的靶基

因。RNAhybrid的算法禁止分子内、miRNA分子间及靶基因间形成二

聚体，根据miRNA和靶基因之间结合自由能探测最佳的靶位点。

（4）DIANA-microT

DIANA-microT是Kiriakidou[6]等人于2004年开发的一款结合了

生物信息学和实验学方法的靶基因预测软件。DIANA-microT主要考虑

单一结合位点的miRNA靶基因。此外在寻找结合位点时，除了必需的5’

端种子区外，典型的中央突起以及miRNA在3’端与mRNA的结合也得到

了考虑。在算法方面，DIANA-microT主要基于以下两点原则对miRNA

靶基因进行判断：首先，通过动态规划算法计算经典的Watson-Crick

碱基对及G：U错配的自由能，进而衡量miRNA与靶基因间的结合能力；

其次，miRNA相关蛋白影响miRNA与靶基因结合时形成的中央突起的大

小与位置，进而影响miRNA与靶基因的结合。

（5）PicTar

Krek等人[7]在2005年采用一种更先进的算法来预测脊椎动物、线

虫和果蝇中miRNA的靶基因，并通过实验方法进行了验证，这种算法

就是PicTar，即组合靶位点的概率识别(probabilistic

identificationofcombinationsoftargetsites)。PicTar的算

法包括两个方面:识别单个miRNA的靶位点；为组合的靶位点评分。通

过生物信息学和实验方法的分析，PicTar算法估计会有30%左右的假

阳性率。

（6）RNA22

RNA22是由Miranda等人[8]于2006年开发的一种识别miRNA靶位点

以及相应miRNA-mRNA异源双链的软件。RNA22与其他miRNA靶基因预测

软件不同。首先，RNA22的预测不依赖于物种间的保守性，而是认为

即使近亲物种不存在miRNA结合位点，仍有可能是miRNA的靶基因；其

次，RNA22与其他软件的预测方向不同，RNA22不是从miRNA入手寻找

它的靶基因，而是首先从感兴趣的序列入手，寻找假定的miRNA结合

位点，再进一步确定其被哪条miRNA调控。

动物中miRNA靶基因预测方法

预测方法网址检索范围算法特点

miRanda/

人，果蝇，

斑马鱼

序列匹配,双链结合自由能,物种

间保守性

TargetScan/Tar

getScanS

/

人，小鼠，

大鼠，狗

提出“miRNA种子区”的概念

RNAhybrid

-

/rnahybrid/

哺乳动物

快速准确计算miRNA-mRNA二聚体

自由能

DIANA-microT

/

人，小鼠，

大鼠，果蝇

考虑miRNA调控单个靶位点的情况

PicTar/脊椎动物

区分“完全匹配种子区”与“不完全匹

配种子区”

RNA22

.c

om/

哺乳动物

不考虑保守性,由mRNA入手预测

相关miRNA

上述不同算法各有其特点，主要还是依据miRNA与其靶位点的互

补性、miRNA靶位点的保守性、miRNA-mRNA双链之间的热稳定性及附

近序列的二级结构等原则设计的。其中，miRanda是将miRNA-mRNA之

间的序列匹配，保守性及热稳定性作为计算参数，有比较好的检出率，

但是假阳性率也较高；TargetScan提出了“种子区”的概念，增加了

预测的精确度；RNAhybrid的研究重点在RNA二级结构预测方面，能够

更快速准确地计算miRNA-mRNA双链的自由能，降低了假阳性率；

DIANA-microT则主要考虑miRNA调控单个靶基因的情况，同时考虑中

央突起以及miRNA在3’端与mRNA的结合；RNA22与其他算法不同，不考

虑物种间的保守性，检出率较高。

2、生物学实验方法

由于计算机模拟在预测miRNA靶基因时存在一定的局限性，因此

很多学者也希望能够利用生物学实验方法直观地寻找miRNA靶基因。

(1)从mRNA水平寻找miRNA靶基因

（a）miRNA靶基因大规模寻找

将miRNA成熟体双链或腺病毒载体转染至细胞中，使得miRNA在细

胞中过表达，之后利用基因芯片分析mRNA的变化以找出相应miRNA的

靶基因[9]。由于miRNA在体内通过翻译抑制或影响mRNA的稳定性起作

用，因此这种方法在寻找起翻译抑制作用的miRNA的靶基因时存在一

定困难。

Beitzinger等人[10]利用AGO蛋白家族既能结合miRNA又能结合

mRNA的特性，分别使用AGO-1和AGO-2蛋白的单克隆抗体在人类细胞中

进行免疫共沉淀，得到与AGO-1和AGO-2蛋白结合的mRNA各600条，并

通过克隆测序对这些mRNA进行鉴定。同时，从与AGO-1蛋白结合的mRNA

中随机挑选6条进行荧光素酶报告基因检测，发现其中有5条都是

miRNA的靶基因。

与上述工作类似,Easow等人[11]也是利用纯化miRNP来分析miRNA

的靶基因。他们利用基因芯片分析了miRNP结合的mRNA后发现，大量

计算机预测的miRNA靶基因得到了富集，同时为了分析单个miRNA的靶

基因，对野生型果蝇和miR-1缺失果蝇的miRNP结合mRNA进行了分析，

得到并利用实验方法鉴定miR-1调节的mRNA，为miRNA靶基因的寻找提

供了新的思路。

（b）miRNA靶基因的精确寻找

Liu等人[12]在研究Mir-16家族的功能时建立了一种针对miRNA靶

基因的反向筛选法。首先，确定了感兴趣的基因ccnd1，将它的3’UTR

构建到荧光素酶报告载体中，之后与构建的miRNA表达文库共转染

HepG2细胞，得到荧光值明显下降的miRNA，再将得到的miRNA在体内

验证其功能，最终得到Mir-16家族能够调节CCND1基因。该方法的关

键在于，利用了自行构建的miRNA表达文库，能够方便同时研究多条

miRNA，通过体外实验对候选miRNA进行初步筛选，从而快速地鉴定一

条mRNA所对应的多条miRNA。

（2）从蛋白质水平寻找miRNA靶基因

由于miRNA所介导的转录后翻译抑制过程不引起mRNA水平的改变，

因此依据mRNA水平的变化寻找miRNA靶基因的方法在检出率上存在一

定问题。Selbach[13]和Baek[14]两个研究组分别利用蛋白质组学的研究

方法，建立了从蛋白质水平寻找miRNA靶基因的新方法。

两个课题组分别将成熟miRNA双链转染HeLa细胞，利用细胞培养

稳定同位素标记技术（stableisotopelabelingwithaminoacids

incellculture），将转染了成熟miRNA双链的细胞和正常细胞分别

培养于含轻/重型稳定同位素标记必需氨基酸的培养基中，经过若干

次细胞倍增后，稳定同位素按照序列特异的方式完全掺入到新合成的

蛋白质中，通过比较标记前后同一肽段的质谱峰值变化实现对蛋白质

的精确定量，在检测了2000~5000个蛋白后，两个研究组分别发现，

转染一条miRNA后有几百个蛋白的表达水平发生了改变，许多改变在

mRNA水平上不能得到体现。

前面提到很多寻找miRNA靶基因的方法，这里也不得不提miRNA

靶基因的鉴定。与miRNA靶基因的预测方法相比，对miRNA靶基因进行

实验验证的方法并不多，目前还没有一个快速、简便、高通量的鉴定

方法。最直接的鉴定方法是，利用荧光定量PCR及Westernblot方法

分别检测转染或敲低miRNA后细胞中mRNA水平及蛋白水平的变化，从

而确定miRNA与靶基因的对应关系。这种方法能够直接鉴定出miRNA

的靶基因，准确度高但不能鉴定miRNA的靶位点。

目前最为常用的miRNA靶位点鉴定方法是荧光素酶报告基因法。

其基本原理是首先构建荧光素酶表达载体，将希望鉴定的miRNA靶基

因的3’UTR构建到荧光素酶基因的3’UTR中；之后将构建好的载体转染

细胞并改变细胞中相应miRNA的表达水平；最后检测荧光素酶的表达

情况，以分析转染3’UTR中是否含有miRNA的靶位点[1,15]。美国Signosis

经过多年探索，积累了丰富的上述miRNA靶基因荧光素酶报告载体实

验相关的经验，可以帮助科研人员构建实用的miRNA靶基因荧光素酶

报告载体。同时，有多种已构建完毕的载体可提供给研究人员使用

（/product/miRNA_Lucifera_Repor

ter_Vectors；/kysj/）。除此

之外，Signosis还提供miRNA研究中常用的实验试剂，如miRNA芯片、

miRNANorthernBlot、miRNA实时荧光定量PCR以及Signosis专利性

的miRNA微孔板检测试剂等。（/kysj/；

/6-miRNA_）使用这些产

品帮助研究人员解决了很多操作方面的麻烦，发表了100多篇SCI文章。

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